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專利名稱：：用于體外檢測(cè)生物人工肝功能性的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物人工肝檢測(cè)用醫(yī)學(xué)試驗(yàn)配制品，具體涉及一種用于體外檢測(cè)生物人工肝功能性的組合物。本發(fā)明還涉及上述組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
：我國是重型肝炎、肝衰竭的高發(fā)國家，每年有數(shù)萬例患者會(huì)發(fā)生該病，平均死亡率為3040%，晚期患者死亡率更高達(dá)7080%。因?yàn)椴∏檫M(jìn)展很快，多數(shù)患者黃膽迅速加深，并出現(xiàn)出血、昏迷、腹水等嚴(yán)重并發(fā)癥，而內(nèi)科藥物治療效果差，預(yù)后不良。肝衰竭內(nèi)科保守治療效果較差，而肝移植目前受到供體嚴(yán)重短缺等因素的制約，因此非內(nèi)科藥物治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。人工肝支持系統(tǒng)已被國內(nèi)外學(xué)者證明具有良好的臨床治療效果。人工肝支持系統(tǒng)可以分為非生物人工肝支持系統(tǒng)和生物人工肝支持系統(tǒng)。由于技術(shù)不斷成熟和完善，療效確切，非生物人工肝支持系統(tǒng)逐漸成為治療肝衰竭的常規(guī)手段。隨著新型材料的不斷開發(fā)和技術(shù)的不斷進(jìn)步，非生物人工肝支持系統(tǒng)的血液凈化效果不斷提高，已成為體外人工肝支持的重要手段，.但非生物人工肝也存在著自身難以克服的缺陷，如血漿置換雖對(duì)肝衰竭具有較好的治療作用，但存在諸如過敏反應(yīng)、低血壓等副作用，以及輸血感染的風(fēng)險(xiǎn)；分子吸附再循環(huán)系統(tǒng)(MARS)系統(tǒng)價(jià)格昂貴，國內(nèi)大多數(shù)肝功能衰竭病人為此而未能得到MARS的救治；非生物人工肝支持系統(tǒng)主要的功能是解毒，并不能改變患者的預(yù)后，即不能完成肝臟合成代謝后的轉(zhuǎn)化的功能。隨著肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)和克隆技術(shù)以及生物反應(yīng)器的日趨成熟，新一代以培養(yǎng)肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的現(xiàn)代生物人工肝被認(rèn)為是目前治療肝衰竭最有前途的手段。生物人工肝的研究過程中需要對(duì)其功能性(如有效性和安全性)進(jìn)行體外評(píng)估，現(xiàn)有的做法是使用肝衰竭模型動(dòng)物的血漿來模擬人類患者的血漿進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。然而，形成動(dòng)物肝衰竭模型的方法差異以及動(dòng)物的個(gè)體差異，會(huì)使得肝衰竭血漿成分變化的不一致性，即使是使用的是人類患者的血漿，也會(huì)因發(fā)病地區(qū)、發(fā)病機(jī)制、患者個(gè)體和治療方法的不同而使得血漿成分有所不同。因此，導(dǎo)致體外檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，生物人工肝難以大規(guī)模使用。另外，作為檢測(cè)用的血槳還必須對(duì)人工生物肝的生物反應(yīng)器部分無不良反應(yīng)，且無外源性污染和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。所以有必要提供一種可模擬肝衰竭血漿并在同一基線水平檢測(cè)生物人工肝的有效性和安全性的組合物。該組合物還應(yīng)滿足對(duì)反應(yīng)器部分無不良反應(yīng)且無外源性污染和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)的要求。而且，為可廣泛應(yīng)用，該組合物應(yīng)可大規(guī)模制備。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于體外檢測(cè)生物人工肝的功能性的組合物，其包含濃度為171-342pmol/L的未結(jié)合膽紅素或膽紅素二鈉、濃度為100-200^mol/L膽汁酸、濃度為240-400pmol/L的氨和細(xì)胞培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以為無血清培養(yǎng)基或者人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM;優(yōu)選為人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸，其中鵝去氧膽酸濃度為80-160pmol/L，膽酸濃度為20-40pmol/L。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物中的氨來源于非氧化性酸的銨鹽，例如NH4Cl、NH4Br或(NH4)3P04，優(yōu)選為氯化銨(NH4Cl)。本發(fā)明的另一個(gè)巨的在于提供上述組合物的制備方法，其包括(a)提供細(xì)胞培養(yǎng)基；(b)將未結(jié)合膽紅素或膽紅素二鈉加入所述細(xì)胞培養(yǎng)基，使得組合物中膽紅素的濃度為171-342pmol/L;(c)將膽汁酸加入所述細(xì)胞培養(yǎng)基，使得組合物中膽汁酸的濃度為腸-200拜ol/L;(d)將銨鹽加入所述細(xì)胞培養(yǎng)基，使得組合物中氨的濃度為240-400jimol/L。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中，上述步驟(b)和步驟(c)的順序顛在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(a)中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，或者是人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM;優(yōu)選為人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(c)中所述膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(d)中所述銨鹽為非氧化性酸的銨鹽，例如NH4Cl、NH4Br或(NH4)3P04，優(yōu)選為氯化銨。本發(fā)明提供的能夠體外檢測(cè)生物人工肝功能性的組合物，其是在以往對(duì)肝臟的生理功能和肝衰竭患者的血漿成分的變化的研究基礎(chǔ)上研發(fā)出來的，該組合物能夠很好地反映肝臟衰竭患者的肝臟代謝功能、分泌功能和合成功能的損害。將該組合物通過生物人工肝的生物反應(yīng)器部分，通過檢測(cè)混合液中可反映肝臟代謝、分泌和合成功能物質(zhì)濃度的變化來檢測(cè)生物人工肝的體外功能性(有效性和安全性)。本發(fā)明提供的組合物中反映肝衰竭的物質(zhì)的濃度可以穩(wěn)定在一個(gè)水平，不會(huì)具有因動(dòng)物的個(gè)體差異和不同方法致動(dòng)物肝衰竭模型時(shí)肝衰竭血漿成分變化水平的不一致性，其能夠很好地在同一基線水平檢測(cè)生物人工肝功能，而且本發(fā)明幾乎對(duì)生物反應(yīng)器部分無不良反應(yīng)，更無外源性污染和疾病傳播問題。本發(fā)明組合物所含的各組分來源豐富、成本低，且本發(fā)明組合物的制備方法簡單，因此可以大規(guī)模制備。具體實(shí)施方式為更好地理解本發(fā)明，以下通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明所用試劑未結(jié)合膽紅素、二甲基亞砜、RPMI1640培養(yǎng)基、鵝去氧膽酸、膽酸、銨鹽均購于天津Alfa公司。濃度為20%的人血白蛋白購于上海萊仕血制品公司。儀器杜邦A(yù)R型全自動(dòng)生化分析儀(購自美國杜邦公司)；血氨的測(cè)定試劑盒(購自長春匯力生物技術(shù)有限公司)。實(shí)施例1①將O.lg未結(jié)合膽紅素在5(TC溶于10ml的二甲基亞砜，備用；②25ml的濃度為20%的人血白蛋白加入965mlRPMI1640培養(yǎng)基，邊加白蛋白邊振蕩，使其濃度均勻；③溶解在二甲基亞砜中的未結(jié)合膽紅素逐滴加入含人血白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基，邊加邊振蕩；④將32mg的鵝去氧膽酸和10mg膽酸加入步驟③所得的混合物中，均勻振蕩使其溶解。⑤在混合物溫度降至室溫時(shí)，將13mg氯化銨加入步驟④所得的混合物中，均勻振蕩使其溶解。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Mean士SDSPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4t:和37'C的環(huán)境中，并在O、12和24小時(shí)時(shí)取樣，每次取三個(gè)標(biāo)本，用杜邦A(yù)R型全自動(dòng)生化分析儀，血氨的測(cè)定試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)組合物所包含的各物質(zhì)的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在O、12和24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，各物質(zhì)濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測(cè)值見表l和表2)。表l——4'C時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2^37i:時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可看出，在4。C和37-C時(shí)，以上述各物質(zhì)濃度配制而成的組合物是可以穩(wěn)定存在的。實(shí)施例2①將0.2g未結(jié)合膽紅素在50'C溶于20ml的二甲基亞砜，備用；②將50ml的20%的人血白蛋白加入930mlRPMI1640培養(yǎng)基，邊加白蛋白邊振蕩，使其濃度均勻；③將溶解在二甲基亞砜中的未結(jié)合膽紅素逐滴加入含人血白蛋白R(shí)PMI1640培養(yǎng)基，邊加邊振蕩；將60mg的鵝去氧膽酸和20mg膽酸加入步驟③所得混合物中，均勻振蕩使其溶解；⑤在混合物溫度降至室溫時(shí)，將20mg氯化銨加入步驟④所得混合物中，均勻振蕩使其溶解。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Mean士SD檢驗(yàn)，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P〈0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4'C和37"C的環(huán)境中，并在0、12和24小時(shí)取樣，每次取三個(gè)標(biāo)本用杜邦A(yù)R型全自動(dòng)生化分析儀，血氨的測(cè)定試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)組合物所包含的各物質(zhì)的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0、12和24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，各物質(zhì)濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測(cè)值見表3和表4)。表3^4。C時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.827結(jié)果說明在4T:和37"C時(shí)，以上述的各物質(zhì)濃度配制而成的組合物是可以穩(wěn)定存在的。實(shí)施例3①將32mg的鵝去氧膽酸和10mg膽酸加入1000ml無血清培養(yǎng)基中，均勻振蕩使其溶解；②將0.11g膽紅素二鈉加入上述混合液中，邊加邊振蕩；③將24mg溴化銨加入步驟②的混合液中，均勻振蕩使其溶解。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Mean士SDSPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4'C和37。C的環(huán)境中，并在O、12和24小時(shí)時(shí)取樣，每次取三個(gè)標(biāo)本，用杜邦A(yù)R型全自動(dòng)生化分析儀，血氨的測(cè)定試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)組合物所包含的各物質(zhì)的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在O、12和24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，各物質(zhì)濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測(cè)值見表5和表6)。表5——4'C時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean土SD)時(shí)間項(xiàng)目O小時(shí)12小時(shí)24小時(shí)P值未結(jié)合膽紅素Ounol/L)174.50±0.36174.2±0.40174.4±0.350.722氨(pmol/L)243.33±1.53242.3±1.15242.6土2.080.889鵝去氧膽酸(Hmol/L)80.77±0.3880.53±0.2180.43±0.120.483膽酸(Hmol/L)21.17±0.1521.20±0.2021.23±0.150.679表6——37^時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean士SD)時(shí)間項(xiàng)目o小時(shí)12小時(shí)24小時(shí)P值未結(jié)合膽紅素(Hmol/L)174.1±0.35174.7±0.29174.6±0.170.207氨(拜ol/L)242.0±1.73243.0±2.00242.3±1.530.787鵝去氧膽酸(Hmol/L)81.20±0.3680.80±0.1080.73±0.060.079膽酸(拜ol/L)22.80±0.5022.33±0.2122.63±0.060.261實(shí)施例4①將60mg的鵝去氧膽酸和20mg膽酸加入1000ml無血清培養(yǎng)基中，均勻振蕩使其溶解；②將0.23g膽紅素二鈉加入上述混合液中，邊加邊振蕩；③將48mg溴化銨加入步驟②的混合液中，均勻振蕩使其溶解。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Mean土SDSPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4'C和37匸的環(huán)境中，并在0、12和24小時(shí)時(shí)取樣，每次取三個(gè)標(biāo)本，用杜邦A(yù)R型全自動(dòng)生化分析儀，血氨的測(cè)定試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)組合物所包含的各物質(zhì)的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0、12和24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，各物質(zhì)濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測(cè)值見表7和表8)。表7~~4-C時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean士SD)時(shí)間項(xiàng)目O小時(shí)12小時(shí)24小時(shí)P值未結(jié)合膽紅素(Hmol/L)341.3±0.25340.9±0.35341.7±0.490.298氨(Hmol/L)398.0±1.53398.3±2.05398.7±1.670.557鵝去氧膽酸(啤ol/L)80.77±0.3880.53±0.2180.43±0.120.336膽酸(Hmol/L)21.17±0.1521.20±0.202L23土0.150.893表8——37'C時(shí)組合物中各物質(zhì)的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例3和實(shí)施例4中的膽紅素二鈉可如以下方法制備將未結(jié)合膽紅素(UCB)溶于氯仿中，逐滴加入甲醇和乙醇鈉的混合液中(乙醇鈉:甲醇=1:6(V:V))，乙醇鈉與UCB的摩爾比為1.95:1。將混合液在5(TC真空中蒸發(fā)，得到的棕色粉末以氯仿洗兩次，以去除未與乙醇鈉反應(yīng)的UCB，真空中去除氯仿，最后得到的膽紅素二鈉貯存于棕色瓶中備用。或者，實(shí)施例3和實(shí)施例4中的膽紅素二鈉可從生產(chǎn)商購買得到。本發(fā)明的組合物中膽紅素的最低濃度約為正常人膽紅素濃度高限的10倍左右，而組合中氨的最低濃度約為正常人血氨濃度高限的4倍左右，可以很好地模擬人肝衰竭患者的血清。所述的用于檢測(cè)生物人工肝體外功能的組合物可以特異性地反映肝衰竭患者血漿成分的變化，并且各種試劑容易購得，經(jīng)濟(jì)便宜，且可大量制備。本發(fā)明所述的組合物在4'C和37X:時(shí)，未結(jié)合膽紅素、鵝去氧膽酸、膽酸和氨按上述比例溶解在細(xì)胞培養(yǎng)基中，各物質(zhì)之間可以穩(wěn)定存在，各成分濃度都穩(wěn)定地維持在固定的范圍內(nèi)。當(dāng)用于檢測(cè)生物人工肝的體外功能，可以很好地在同一基線水平檢測(cè)生物人工肝的體外功能。雖然本發(fā)明已經(jīng)參考具體的實(shí)施方式進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員通過閱讀上述描述后，將可以對(duì)本發(fā)明做出顯而易見的修改和修飾，而不違背本發(fā)明的意圖和本質(zhì)。本發(fā)明有意將這些修改和修飾包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種用于體外檢測(cè)生物人工肝的功能性的組合物，其包含濃度為171-342μmol/L的未結(jié)合膽紅素或膽紅素二鈉、濃度為100-200μmol/L膽汁酸、濃度為240-400μmol/L的氨和細(xì)胞培養(yǎng)基。2.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基或者人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。3.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸，其中鵝去氧膽酸濃度為80-160nmol/L，膽酸濃度為20-40|iimol/L。4.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述氨來源于非氧化性酸的銨鹽。5.權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，所述非氧化性酸的銨鹽選自NH4C1，NH4B,(NH4)3P04。6.權(quán)利要求l所述的組合物，其特征在于，所述氨來源于NH4C1。7.權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其包括(a)提供細(xì)胞培養(yǎng)基；(b)將未結(jié)合膽紅素或膽紅素二鈉加入所述細(xì)胞培養(yǎng)基，使得組合物中膽紅素的濃度為171-342|nmol/L;(c)將膽汁酸加入所述細(xì)胞培養(yǎng)基，使得組合物中膽汁酸的濃度為100-200拜ol/L;(d)將銨鹽加入所述細(xì)胞培養(yǎng)基，使得組合物中氨的濃度為240-400Hmol/L。8.權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)和步驟(c)的順序顛倒。9.權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所述細(xì)胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基或者人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。10.權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(c)中所述膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸，其中鵝去氧膽酸濃度為80-160pmol/L，膽酸濃度為20-40拜ol/L。11.權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(d)中所述銨鹽為非氧化性酸的銨鹽。12.權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(d)中所述銨鹽為NH4C1。全文摘要本發(fā)明提供的組合物含有濃度為171-342μmol/L的膽紅素或其衍生物、濃度為100-200μmol/L膽汁酸、濃度為240-400μmol/L的氨和細(xì)胞培養(yǎng)基。組合物中反映肝衰竭的物質(zhì)的濃度可以穩(wěn)定在一個(gè)水平，不會(huì)具有因動(dòng)物的個(gè)體差異和不同方法致動(dòng)物肝衰竭模型時(shí)肝衰竭血漿成分變化水平的不一致性，其能夠很好地在同一基線水平檢測(cè)生物人工肝體外功能，而且本發(fā)明幾乎對(duì)生物反應(yīng)器部分無不良反應(yīng)，更無外源性污染和疾病傳播問題。本發(fā)明組合物所含的各組分來源豐富、成本低，且本發(fā)明組合物的制備方法簡單，因此可以大規(guī)模制備。文檔編號(hào)G01N33/72GK101556275SQ20091003958公開日2009年10月14日申請(qǐng)日期2009年5月19日優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日發(fā)明者蔣澤生,穎郭,森高,毅高申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院