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專利名稱：萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域中涉及β2-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
萊克多巴胺(Ractopamine)、西馬特羅(Cimaterol)都屬于β2-受體激動(dòng)劑,近年來，很多不法商家將它們作為鹽酸克倫特羅的替代品添加于動(dòng)物飼料中，當(dāng)長(zhǎng)期用來飼喂動(dòng)物時(shí)，萊克多巴胺、西馬特羅對(duì)動(dòng)物有營(yíng)養(yǎng)再分配的作用，促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積而抑制脂肪形成，從而顯著提高動(dòng)物胴體的瘦肉率。但萊克多巴胺、西馬特羅在體內(nèi)代謝緩慢、易聚積、藥物殘留率高，當(dāng)人類食用殘留該類藥物的動(dòng)物性食品后會(huì)產(chǎn)生中毒從而對(duì)人體健康產(chǎn)生相當(dāng)?shù)奈：?，通常表現(xiàn)為肌肉震顫、心悸、發(fā)燒、惡心嘔吐等，嚴(yán)重的會(huì)昏迷甚至死亡。因此，許多國(guó)家已經(jīng)禁止在動(dòng)物飼料中添加β2_興奮劑，但是關(guān)于β2_興奮劑的食品安全事件時(shí)有發(fā)生。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)萊克多巴胺和西馬特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。在食品安全檢測(cè)中，往往先用ELISA進(jìn)行初篩后，再對(duì)陽性樣本用HPLC或GC-MS、LC-MS進(jìn)行確證。但是上述方法所用的儀器設(shè)備昂貴復(fù)雜、成本高，同時(shí)需要對(duì)操作人員進(jìn)行特殊培訓(xùn)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能立即顯示，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象的快速在線檢測(cè)和監(jiān)控。膠體金試紙條是 以膠體金作為免疫層析的指示物，其原理是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測(cè)帶)，通過直接運(yùn)用可目測(cè)的膠體金標(biāo)記物而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然該方法快速方便，但是膠體金試紙條仍有以下缺點(diǎn):(I)只有當(dāng)金顆粒集聚到一定量(IO7個(gè)/mm2)時(shí)，才出現(xiàn)肉眼可見的紫紅條帶，且該顏色條帶與背景對(duì)比度不大，從而限制了檢測(cè)靈敏度。(2)樣品基質(zhì)效應(yīng)明顯，背景干擾大。(3)無法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。(4)只能檢測(cè)單個(gè)污染物此外，雖然現(xiàn)在也有單獨(dú)檢測(cè)萊克多巴胺的膠體金試紙條和西馬特羅的檢測(cè)卡，但是至今仍沒有一種能同時(shí)定性且定量檢測(cè)萊克多巴胺和西馬特羅的產(chǎn)品。因此，目前對(duì)于同時(shí)定量檢測(cè)萊克多巴胺與西馬特羅的檢測(cè)手段仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能有效檢測(cè)萊克多巴胺和西馬特羅的二聯(lián)膠體金試紙條及其制備方法和用途。在本發(fā)明的第一方面，參考圖1，本發(fā)明提出了一種萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條，包括:底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述金標(biāo)墊上是含有膠體金標(biāo)記的抗萊克多巴胺單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的西馬特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線依次由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合的萊克多巴胺檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣組成，所述質(zhì)控線由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合和抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體線狀點(diǎn)樣組成。由此，可以有效地獲得萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條，從而對(duì)樣品中萊克多巴胺、西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條的方法，其包括下列步驟:制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線；制備金標(biāo)墊；以及組裝試紙條，其中，用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合的萊克多巴胺檢測(cè)抗原和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣分別作為所述兩條檢測(cè)線；用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線。由此，通過本發(fā)明的方法，能有效制備前面所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條，從而對(duì)樣品中萊克多巴胺、西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述檢測(cè)線和質(zhì)控線是通過下列步驟獲得的:將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的萊克多巴胺、西馬特羅檢測(cè)抗原，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，其中，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊15mm 18mm,兩條檢測(cè)線之間相隔5mm ;將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線，質(zhì)控線點(diǎn)樣位置離膜底邊IImm 13mm ;將所述硝酸纖維素膜于37攝氏度烘干處理過夜后，在室溫干燥的環(huán)境下保存。由此，通過本發(fā)明實(shí)施例的方法，可以有效地制備大小均一、位置固定并且分別具有特定濃度抗原、抗體的檢測(cè)線和質(zhì)控線，從而獲得具有檢測(cè)線和質(zhì)控線的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條，進(jìn)而有效地對(duì)萊克多巴胺、西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā) 明的實(shí)施例，金標(biāo)墊是通過下列步驟獲得的:分別選用能與萊克多巴胺、西馬特羅檢測(cè)抗原結(jié)合的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體用膠體金標(biāo)記；把所述的用膠體金標(biāo)記過的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體混合后，噴在玻璃纖維膜上。由此，通過本發(fā)明實(shí)施例的方法，可以有效地制備具有能與萊克多巴胺、西馬特羅檢測(cè)抗原結(jié)合的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體用膠體金標(biāo)記的金標(biāo)墊，從而獲得具有金標(biāo)墊的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條，進(jìn)而有效地對(duì)萊克多巴胺、西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種前面所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條檢測(cè)萊克多巴胺、西馬特羅的方法，包括以下步驟:配制已知系列濃度的萊克多巴胺、西馬特羅混合標(biāo)準(zhǔn)品并加入所述膠體金讀取儀的樣本孔中，10分鐘后檢測(cè)對(duì)應(yīng)的光密度數(shù)值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將含有檢測(cè)樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中，讀取檢測(cè)數(shù)值，以及通過所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所述檢測(cè)樣品中萊克多巴胺、西馬特羅含量。由此，通過本發(fā)明所提供的方法，可以有效地制備采用該膠體金讀取儀檢測(cè)萊克多巴胺、西馬特羅的校準(zhǔn)曲線，從而配合本發(fā)明提供的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條有效地對(duì)萊克多巴胺、西馬特羅進(jìn)行定量檢測(cè)。有益效果1、多殘留監(jiān)測(cè):本發(fā)明采用萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條能根據(jù)T線和C線的顯色情況同時(shí)監(jiān)測(cè)樣品中萊克多巴胺、西馬特羅的污染情況。2、靈敏度高:本發(fā)明采用萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，能通過儀器替代肉眼觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，克服了肉眼判斷帶來的誤差，從而提高了檢測(cè)靈敏度，本方法檢測(cè)萊克多巴胺和西馬特羅的靈敏度分別為0.5ppb和lppb。3、定量:本發(fā)明采用萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，可以根據(jù)膠體金讀取儀顯示器上的顯示數(shù)值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可分別得出被檢樣品中萊克多巴胺和西馬特羅的含量。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條的結(jié)構(gòu)圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的一種膠體金讀取儀的示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的定量檢測(cè)萊克多巴胺、西馬特羅流程圖。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1免疫抗原的合成1.1合成萊克多巴胺免疫抗原采用混合酸酐法制備萊克多巴胺-BSA免疫抗原:稱取萊克多巴胺34mg和IOmg丁二酸酐在2mL吡啶中反應(yīng)，室溫下攪拌過夜，置于通風(fēng)櫥中將吡啶完全蒸發(fā)，此反應(yīng)產(chǎn)物為萊克多巴胺-半丁二酸酐；將其溶于2mL N, N- 二甲基甲酰胺和2mLl，4- 二氧六環(huán)混合物中，再加26.2μ L的三正丁胺，在冰浴中攪拌10分鐘，再加氯甲酸異丁酯15L，室溫反應(yīng)，攪拌I小時(shí)；將此混合物逐滴加入預(yù)冷的蛋白溶液(IOOmg BSA溶解于0.1M硼酸鈉pH8.5)，室溫反應(yīng)過夜，在PBS中透析72小時(shí)以上，透析后即得到純化的萊克多巴胺-BSA免疫抗原。
權(quán)利要求
1.一種萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 其中，所述金標(biāo)墊上是含有膠體金標(biāo)記的抗萊克多巴胺單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的西馬特羅單克隆抗體， 所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線， 所述檢測(cè)線依次由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合的萊克多巴胺檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣組成， 所述質(zhì)控線由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合和抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體線狀點(diǎn)樣組成。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條的方法，其特征在于，包括下列步驟: 制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線； 制備金標(biāo)墊；以及 組裝試紙條， 其中， 用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合的萊克多巴胺檢測(cè)抗原和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣分別作為所述兩條檢測(cè)線； 用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進(jìn)行線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)線和質(zhì)控線是通過下列步驟獲得的: 將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的萊克多巴胺、西馬特羅檢測(cè)抗原，在膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測(cè)線，其中，檢測(cè)線點(diǎn)樣位置離膜底邊15mm 18mm,兩條檢測(cè)線之間相隔5mm ； 將經(jīng)純化濃度調(diào)整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點(diǎn)樣作為質(zhì)控線，質(zhì)控線點(diǎn)樣位置離膜底邊Ilmm 13mm ； 將所述硝酸纖維素膜于37攝氏度烘干處理過夜后，在室溫干燥的環(huán)境下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，金標(biāo)墊是通過下列步驟獲得的: 分別選用能與萊克多巴胺、西馬特羅檢測(cè)抗原結(jié)合的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體用膠體金標(biāo)記； 把所述的用膠體金標(biāo)記過的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體混合后，噴在玻璃纖維膜上。
5.一種采用如權(quán)利要求1所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙配膠體金讀取儀定量檢測(cè)的方法，其特征在于，包括下列步驟: 配制已知系列濃度的萊克多巴胺、西馬特羅混合標(biāo)準(zhǔn)品并加入所述膠體金讀取儀的樣本孔中， 10分鐘后檢測(cè)對(duì)應(yīng)的光密度數(shù)值并建 立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將含有檢測(cè)樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中，讀取檢測(cè)數(shù)值，以及通過所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì) 算所述檢測(cè)樣品中萊克多巴胺、西馬特羅含量。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條及其制備方法，其中萊克多巴胺、西馬特羅二聯(lián)膠體金試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述金標(biāo)墊上是含有膠體金標(biāo)記的抗萊克多巴胺單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的西馬特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線依次由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合的萊克多巴胺檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣和能與抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的西馬特羅檢測(cè)抗原線狀點(diǎn)樣組成，所述質(zhì)控線由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結(jié)合和抗西馬特羅單克隆抗體結(jié)合的驢抗小白鼠抗體線狀點(diǎn)樣組成。利用該試紙配合膠體金讀取儀能有效的定量檢測(cè)萊克多巴胺、西馬特羅。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103235125SQ201310121479
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者賴衛(wèi)華, 彭濤, 楊萬春, 陳媛, 劉文娟 申請(qǐng)人:江西中德生物工程有限公司