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一種五味子有機(jī)酸分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種五味子有機(jī)酸分析方法。本發(fā)明提供了采用GC-MS分析五味子炮制品中有機(jī)酸的分析方法，同時(shí)提供了五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量測(cè)定方法。該分析方法是：取五味子粉加入硫酸甲醇、NaCl及乙醚-氯仿混合液、無(wú)水硫酸鈉，干燥，制得樣品；進(jìn)行GC-MS分析。本發(fā)明針對(duì)五味子炮制品的有機(jī)酸的分析方法具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性，為五味子炮制前后有機(jī)酸的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。
【專利說(shuō)明】一種五味子有機(jī)酸分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥飲片的質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及五味子飲片有機(jī)酸的分析方法及其中代表性物質(zhì)4-氧代戊酸的質(zhì)量控制方法。
【背景技術(shù)】
[0002]五味子是木蘭科五味子Schisandra Chinese (Turcz.) Baill.的干燥成熟的果實(shí)，具有收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心之效。臨床用于久嗽虛喘，夢(mèng)遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗，盜汗，津傷口渴，短氣脈虛，內(nèi)熱消渴，心悸失眠?！吨袊?guó)藥典》2010版收載的五味子的炮制品種是五味子及醋蒸五味子，在五味子的臨床應(yīng)用上亦以此兩種為主，醋蒸后酸澀作用增強(qiáng)，澀精止瀉作用增強(qiáng)。五味子中主要成分包括木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸類等。其中，木脂素的成分主要為聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素，現(xiàn)代研究多認(rèn)為其為五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化等藥理作用，以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等為代表，揮以油主要以a-菔烯，莰烯，(6-菔烯，月桂烯，a-萜品烯，檸檬烯，Y -萜品烯等為主，而有機(jī)酸多以小分子有機(jī)酸為主，如枸櫞酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸等。
[0003]目前藥典及各研究報(bào)道主要集中在對(duì)其所含木脂素成分的研究，有較多的文獻(xiàn)對(duì)五味子炮制前后的木脂素含量進(jìn)行了分析，其結(jié)果說(shuō)明五味子經(jīng)醋蒸后木脂素含量稍有增加，但基本無(wú)顯著性差異，現(xiàn)版藥典中關(guān)于五味子飲片及醋五味子飲片的質(zhì)量控制均只以木脂素代表性成分五味 子醇甲作為其指標(biāo)性成分，且限度相同。但五味子在醋蒸前后的藥效作用及臨床運(yùn)用有較大的差異，且五味子醋蒸后主要體現(xiàn)的是止瀉作用增強(qiáng)，尚無(wú)其增強(qiáng)止瀉的相關(guān)成分的文獻(xiàn)報(bào)道。因此對(duì)五味子炮制品進(jìn)行全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)，特別是選擇與藥效作用相關(guān)成分并確定其限度，才能更加有效地保證五味子炮制品的質(zhì)量，以保證其在臨床上發(fā)揮最大的功效。
[0004]作為收斂固澀藥的代表，五味子中的有機(jī)酸成分亦不容忽視。五味子的藥效作用應(yīng)是多成分的綜合作用，不僅僅體現(xiàn)在其主要的木脂素類成分，因此對(duì)五味子中有機(jī)酸的化學(xué)成分、藥理作用亦應(yīng)深入研究，特別是炮制前后在有機(jī)酸上的差異。文獻(xiàn)上對(duì)五味子有機(jī)酸的分析主要采取的是電位滴定法測(cè)定其所含的總有機(jī)酸含量，而對(duì)其具體的有機(jī)酸成分報(bào)道較少，特別是醋蒸后有機(jī)酸成分的變化無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有研究的空白，采用新的手段對(duì)五味子中的有機(jī)酸進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，特別是對(duì)生五味子及醋五味子有機(jī)酸采取了直接甲酯化的方法，并采用氣質(zhì)聯(lián)用的方法進(jìn)行了全面的分析，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)五味子醋蒸后4-氧代戊酸的含量明顯增加，通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)證明4-氧代戊酸具有止瀉的作用，測(cè)定了其中4-氧代戊酸的含量并規(guī)定了限度，解決了五味子炮制品有機(jī)酸質(zhì)量控制的難題，充分體現(xiàn)了與藥效相關(guān)的指標(biāo)來(lái)控制飲片質(zhì)量的要求，提高后的有機(jī)酸質(zhì)量檢測(cè)能更好地控制五味子炮制品中的有機(jī)酸的質(zhì)量，本方法具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種五味子有機(jī)酸分析檢測(cè)的方法，并建立五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量測(cè)定方法。為了達(dá)到這個(gè)目的，采用如下技術(shù)方案:
[0007]—種五味子炮制品有機(jī)酸的分析方法，包括以下步驟:
[0008](I)樣品制備方法:取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min)，取上清液，加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得。
[0009](2)GC-M S分析條件:質(zhì)譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C;四級(jí)桿溫度150°C;檢測(cè)電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱(30mX 250 u m,0.5 u m);氦氣(99.999%)為載氣，流速 1.0mL/min ;柱前壓 0.17IMPa ;進(jìn)樣 口溫度 250°C ；分流進(jìn)樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至260°C (恒溫lOmin)。
[0010]采用上述方法分析五味子炮制品有機(jī)酸，結(jié)果表明:五味子醋蒸后，4-氧代戊酸在生五味子飲片中其相對(duì)含量為0.692%，而在醋五味子飲片中相對(duì)含量達(dá)到1.653%，醋五味子中4-氧代戊酸相對(duì)含量是生五味子中的2.38倍。
[0011]本發(fā)明還公開一種利用上述有機(jī)酸分析方法的4-氧代戊酸的含量測(cè)定方法，該方法包括以下步驟:
[0012](I)對(duì)照品溶液的制備:分別精密吸取4-氧代戊酸對(duì)照品適量置5mL量瓶中，各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度。
[0013](2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯適量至IOOmL量瓶中，用乙醚-氯仿混合液(2:1)溶解并稀釋至刻度。
[0014](3)供試品溶液的制備取五味子飲片粉末(60目)0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液，置于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1) 2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min)，精密吸取上清液lmL，加入水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液lmL，加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得。
[0015](4) GC-MS分析條件質(zhì)譜條件:EI離子源；電子能量70eV;離子源溫度230°C ；四級(jí)桿溫度150 °C ;檢測(cè)電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱(30mX250umX0.5um);氦氣(99.999%)為載氣，流速 1.0mL/min ;柱前壓 0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至140。。。
[0016](5)含量測(cè)定:精密吸取對(duì)照品及供試品溶液I U 1，注入氣相色譜儀，測(cè)定(n=3)，即得。
[0017]本發(fā)明還公開了一種五味子質(zhì)量控制方法，是用上述方法測(cè)定五味子中4-氧代戊酸含量，按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量計(jì)，結(jié)果不少于設(shè)定值。生五味子與醋五味子的設(shè)定值分別為0.28%,0.60%。本發(fā)明對(duì)五味子有機(jī)酸進(jìn)行了全面的分析并提出了質(zhì)量控制方法，該方法提供了氣相色譜法測(cè)定藥物中4-氧代戊酸成分的含量，本發(fā)明的質(zhì)量控制方法具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為五味子炮制品有機(jī)酸甲酯化GC-MS總離子流色譜圖。
[0019]圖2為五味子炮制品有機(jī)酸部位甲酯化GC-MS總離子流色譜圖。
[0020]圖3為4-氧代戊酸甲酯質(zhì)譜圖。
[0021]圖4為4-氧代戊酸含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0022]圖5為五味子炮制品4-氧代戊酸含量測(cè)定GC-MS總離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明如下:
[0024]實(shí)施例1、五味子不同炮制品有機(jī)酸的分析比較
[0025]1.1儀器與試藥
[0026]1.1.1 儀器
[0027]美國(guó)Agilent GC6890-MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有NIST2005標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù))，LXJ-2B多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，METTLER AE240電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司)，THZ-D臺(tái)式恒溫振蕩器(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。
[0028]1.1.2 試劑
[0029]甲醇、濃硫酸、氯仿、乙醚、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純。
[0030]1.2樣品的制備
[0031]1.2.1五味子飲片甲酯化樣品的制備
[0032]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加A 10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,力口適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得。
[0033]1.2.2飲片試樣空白的制備
[0034]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得。
[0035]1.2.3醋甲酯化試樣的制備
[0036]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工藝，常壓蒸5h后，加水定容至25mL,精密吸取0.1mL溶液(相當(dāng)于0.2g藥材中加入的輔料醋的量)，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得。
[0037]1.2.4醋試樣空白的制備
[0038]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工藝，常壓蒸5h后，加水定容至25mL,精密吸取
0.1mL溶液(相當(dāng)于0.2g藥材中加入的輔料醋的量)，置具塞試管中，精密加入甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,加適量無(wú)水硫酸鈉,干燥，即得。
[0039]1.2.5試劑甲酯化空白的制備
[0040]精密吸取10%的硫酸甲醇1.0mL溶液置具塞試管中，于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1)2mL,混旋3min，離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無(wú)水硫酸鈉,干燥，即得。
[0041]1.2.6試劑空白的制備
[0042]精密吸取甲醇1.0mL置具塞試管中，于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2: l)2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min)，取上清液，加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得。
[0043]1.3GC-M S 分析條件
[0044]質(zhì)譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150°C ;檢測(cè)電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。
[0045]色譜條件:HP-5色譜柱(30mX250iim，0.5iim);氦氣(99.999%)為載氣，流速
1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至260°C (恒溫IOmin)。
[0046]將各供試品溶液1.0 ii L按1.3項(xiàng)下條件進(jìn)行GC-MS分析。
[0047]1.4 結(jié)果
[0048]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)甲酯化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)選:分別比較了甲酯化試劑10%硫酸甲醇溶液和苯-10%硫酸甲醇溶液(1: 1)，硫酸濃度8%硫酸-甲醇、10%硫酸-甲醇、12%硫酸-甲醇，甲酯化試劑的用量lmL、2mL、3mL，甲酯化時(shí)間12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)，根據(jù)GC分析結(jié)果，以出峰的個(gè)數(shù)與豐度為指標(biāo)，確定10%硫酸-甲醇ImL振蕩24小時(shí)甲酯化基本完全；對(duì)萃取溶劑苯和氯仿-乙醚進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)以苯為提取溶劑的色譜圖，溶劑出峰時(shí)間晚，為了避免對(duì)有機(jī)酸成分的干擾，選用氯仿-乙醚(2:1)作為萃取溶劑；為促進(jìn)甲酯化液分液，在其中加入了飽和氯化鈉溶液，并對(duì)其的用量比例進(jìn)行了為1、1.5mL、2mL考察，確定2mL飽和氯化鈉符合酸度要求。
[0049]將五味子炮制品有機(jī)酸甲酯化物及空白樣品用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分離、鑒定，經(jīng)與NIST2005標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比檢索，結(jié)果從生、醋五味子飲片中檢出69、70種成分，分別占其總量的93.360%、92.226%。具體結(jié)果見(jiàn)表I及圖1。
[0050]從表I檢出的結(jié)果可以看出，生五味子與醋五味子的有機(jī)酸在化學(xué)成分組成有一定的相似性。同時(shí)，兩者在化學(xué)成分的種類及成分組成的相對(duì)比例上均有一定的差別。
[0051]有些成分在五味子醋蒸后已無(wú)法檢測(cè)到，即生五味子飲片中有，而對(duì)應(yīng)的醋品中未檢測(cè)到，如9.478min的丙二酸二甲酯(生五味子中的百分含量為0.033%)。
[0052]但同時(shí)在醋蒸后，有一些新的化合物的被檢測(cè)到，如4.522min的2-羥基丙酸甲酯為醋的特征峰，醋五味子及輔料醋中均檢出此物，而在對(duì)應(yīng)的生品中均無(wú)此物。22.807min的a -羥基苯丙酸甲酯(醋五味子中的百分含量為0.041%), 32.89min的未知物(醋五味子中的百分含量為0.029%), 39.148min的未知物(醋五味子中的百分含量為0.076%)，以上物質(zhì)在生五味子中均未檢測(cè)到，因此說(shuō)明此物質(zhì)可能是醋蒸加熱過(guò)程所產(chǎn)生。
[0053]但較多的是成分在醋蒸后含量上產(chǎn)生了變化差別。醋蒸后，有的含量增高，如10.184min的2，2-二甲氧基丙酸甲酯(生藥0.016%，醋藥0.084%，);11.46min4_氧代戊酸甲酯(生藥0.692%，醋藥1.653%)； 14.409min的未知物(生藥峰量小未積分，醋藥0.021%,)；16.631min的未知物(生藥1.67%，醋藥3.284%) ；19.646min的未知物(生藥0.213，醋藥0.323%) ；21.536min 的未知物(生藥 0.006%,醋藥 0.019%) ；21.598min 的未知物(生藥0.016%，醋藥 0.024%)；29.71min 的未知物(生藥 0.031%，醋藥 0.043%)；31.163min 的 12-甲基十三酸甲酯(生藥0.068%，醋藥0.105%) ;33.063的未知物(生藥0.199%，醋藥0.516%);33.316min的十五酸甲酯(生藥0.067%，醋藥0.11%) ；33.473的未知物(生藥0.013%，醋藥0.031%) ；37.371min的十七酸甲酯(生藥0.021%,醋藥0.038%) ；39.711min的未知物(生藥0.366%，醋藥0.533%)。也有醋蒸后含量降低的，主要是一些非酸的化合物及未知化合物，且這些化合物的相對(duì)含量均小于0.2%，如22.431min的未知物、24.372min的1-丙烯-1，2，3-三羧酸三甲酯、25.732min 的 I, 2，3，4，4a, 5，6，8a_八氫_4a，8-二甲基-2-( 1-甲乙基)-萘；25.87min的2-十三烷酮；26.461min的1-甲基-4- (1，2，2-三甲基環(huán)戊基)苯；26.812min 的 1，6_ 二甲基-4- (1-甲基乙基)_1，2，3，4-四氫萘、27.326min 的 a -白菖考烯、29.187min 的 I, 2, 4a, 5，8，8a_ 六氫-4，7-二甲基-1-(1-甲乙基)-萘；29.483min的香橙烯；29.925min的1A, 2，3,4, 4A, 5,6, 7B-八氫化_1，1,4, 7-四甲基-1H-環(huán)丙烯并奧；30.096min 的 2,6,6,9-四甲基-三環(huán)[5.4.0.0 (2, 8)] ^^一 _9_ 烯；30.251min 的未知物；30.427min 的 6- 二甲基-4- (1-甲基乙基)萘；30.669 的 2,4a, 5，6，9a_ 六氫-3,5,5,9-四甲基(IH)苯并環(huán)庚烯；30.872min的1，5，5，9-四甲基-1，8-二烯-螺[55] 十一烷；32.171min的未知物；32.514min的未知物；33.563的未知物；33.96的未知物；36.907min的未知物；39.064的未知物。
[0054]從五味子樣品甲酯化后GC-MS總離子流圖可見(jiàn)，五味子醋蒸后，4-氧代戊酸在生五味子飲片中其相對(duì)含量為0.692%，而在醋五味子飲片中相對(duì)含量達(dá)到1.653%，醋五味子有機(jī)酸相對(duì)含量是生五味子有機(jī)酸相對(duì)含量有2.38倍，提示其可能與醋蒸后五味子的藥效作用相對(duì)應(yīng)。
[0055]表1五味子不同炮制品有機(jī)酸GC-MS分析結(jié)果
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種五味子有機(jī)酸分析方法，其特征在于包括以下步驟: (1)樣品制備方法:取五味子粉末約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,離心5min,取上清液,加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得； (2)GC-M S分析條件:質(zhì)譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150°C ;檢測(cè)電壓1235V ;溶劑延遲3.2min ;色譜條件:HP_5色譜柱；氦氣為載氣，流速1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣；程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至260°C，再保持lOmin。
2.一種測(cè)定4-氧代戊酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)對(duì)照品溶液的制備分別精密吸取4-氧代戊酸對(duì)照品適量置5mL量瓶中，各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度； (2)內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯適量至IOOmL量瓶中，用乙醚-氯仿混合液溶解并稀釋至刻度； (3)供試品溶液的制備取五味子粉末0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液，置于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,離心5min,精密吸取上清液ImL,加入水楊酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液lmL，加適量無(wú)水硫酸鈉，干燥，即得； (4)GC-MS分析條件 質(zhì)譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級(jí)桿溫度150°C;檢測(cè)電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱；氦氣為載氣，流速1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進(jìn)樣口溫度250°C ;分流進(jìn)樣；程序升溫:初始溫度40°C，以50C /min的速率升至140°C ； (5)含量測(cè)定精密吸取對(duì)照品及供試品溶液IU 1，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得。
3.—種五味子質(zhì)量控制方法，其特征在于，用權(quán)利要求2的方法測(cè)定五味子中4-氧代戊酸含量，按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量計(jì)，結(jié)果不少于設(shè)定值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述4-氧代戊酸的含量測(cè)定方法，其特征在于按照五味子炮制品干燥品中4-氧代戊酸含量計(jì)，生五味子與醋五味子的設(shè)定值分別為0.28%, 0.60%。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103604890SQ201310654107
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】殷放宙, 殷武, 李林, 陸兔林, 蔡寶昌, 李偉東 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)