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專利名稱：馬立克氏病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒快速聯(lián)檢試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)馬立克氏病和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的器具，特別是涉及一種一步法快速檢測(cè)馬立克氏病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的聯(lián)檢膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
馬立克氏病(Marek，s disease, MD)是由馬立克氏病病毒(Marek，s diseasevirus, MDV)引起的一種禽類高度接觸性、傳染性、淋巴組織增生性腫瘤病，主要危害雞，鵪鶉、山雞也有發(fā)病。該病可引起內(nèi)臟器官、肌肉和外周神經(jīng)的淋巴細(xì)胞瘤的神經(jīng)腫大。臨床上MD發(fā)病雞群表現(xiàn)為生長(zhǎng)不均勻、極度消瘦、死亡等癥狀，最常見(jiàn)的病變是神經(jīng)損害和多種實(shí)質(zhì)臟器的淋巴腫瘤，以肝臟、脾臟腫瘤最為多見(jiàn)，因神經(jīng)損害導(dǎo)致的不對(duì)稱性進(jìn)行性麻痹，最終可引起單個(gè)或多個(gè)肢體的完全性麻痹。MDV屬于皰疹病毒科，有三種不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含有特異性抗原。I型MDV感染能引起腫瘤，II型和III型MDV毒株無(wú)致病性，可用于疫苗株。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)引起雞、鴨、鵝、火雞及其他禽類以網(wǎng)狀細(xì)胞增生為主要特征的一組綜合征，包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞增生病、矮小綜合征和淋巴組織及其它組織的慢性腫瘤增生性疾病。REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，是另外一種可引起禽類腫瘤的病毒，雖然不同毒株的致病力不太相同，但都具有相似的抗原性，即屬于同一血清型。RE是禽類最重要的免疫抑制性和腫瘤性疾病之一。作為能誘發(fā)禽類腫瘤及免疫抑制疾病最重要的兩種病毒，MDV和REV已在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。近年來(lái)，免疫抑制性病毒共感染的報(bào)道越來(lái)越多，不同臨床癥狀的雞群中MDV和REV共感染的現(xiàn)象已經(jīng)相當(dāng)普遍，在疑似MD腫瘤的病例中，至少有三分之一的病例可以同時(shí)分離到MDV和REV。MDV和REV單獨(dú)感染雞均可導(dǎo)致腫瘤病變，二者協(xié)同作用會(huì)導(dǎo)致更加明顯的腫瘤病變。盡管MDV和REV誘導(dǎo)產(chǎn)生淋巴瘤的機(jī)制不同，但腫瘤在組織臟器的分布卻非常相似。此外，國(guó)外已有多項(xiàng)研究證實(shí)，MDV和REV在CEF細(xì)胞共培養(yǎng)數(shù)代后會(huì)發(fā)生體外重組。更加令人擔(dān)憂的是，我國(guó)學(xué)者已從發(fā)病雞群中分離到含有REV病毒基因組片段的MDV自然重組毒株，這種重組增加了 MDV在感染雞群中的水平傳播能力。由于臨床癥狀和剖檢病變非常相似，再加上MDV和REV的共感染普遍存在，增加了這兩種家禽病毒性腫瘤病的臨床診斷尤其是鑒別診斷的難度，一些傳統(tǒng)的診斷方法很難將其準(zhǔn)確、快速地區(qū)分開(kāi)來(lái)，給臨床診斷及防制工作帶來(lái)了困難。目前，臨床上最常用鑒別診斷方法是病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)方法等。病毒分離鑒定不但對(duì)臨床診斷很有價(jià)值，對(duì)流行病學(xué)及病原學(xué)研究亦至關(guān)重要，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，約需I 2個(gè)月，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的操作要求高，局限性較大。血清學(xué)方法如ELISA等主要用于檢測(cè)羽毛囊上皮、溶細(xì)胞感染的淋巴細(xì)胞組織及細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品。此類方法檢測(cè)成本相對(duì)較高，并且由于部分病例中的REV感染呈“一過(guò)性”特征、病毒血癥時(shí)間較短，病毒含量低，導(dǎo)致檢出率較低。分子生物學(xué)方法如PCR、熒光定量PCR和LAMP等技術(shù)主要是用于病毒核酸的檢測(cè)，這些技術(shù)雖然能比較準(zhǔn)確的鑒別診斷MDV和REV，但操作復(fù)雜，需要特定的試劑及昂貴的儀器設(shè)備，操作要求高，難以適合生產(chǎn)一線或疫病現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別診斷的需要。因此，急需研究一種快速鑒別檢測(cè)MDV和REV的新技術(shù)，這對(duì)于MD和RE的有效防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、結(jié)果直觀、肉眼可判的一步法快速檢測(cè)馬立克氏病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的試紙條，該試紙條特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、成本低廉，并且可以同時(shí)檢測(cè)兩種病毒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種一步法快速檢測(cè)馬立克氏病病毒MDV和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜層上標(biāo)記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對(duì)照印跡，以及分別含有MDV抗體和REV抗體的檢測(cè)印跡，所述MDV抗體和REV抗體分別為抗MDV和抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測(cè)印跡對(duì)應(yīng)的以膠體金標(biāo)記的抗MDV和抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。所述支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成；所述金標(biāo)抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水層上敷設(shè)有保護(hù)膜，且在樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向樣品吸附纖維層一側(cè)0.3 0.7cm處印制有樣品標(biāo)記線，檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列組合為“ I I I ”、“/ / /”、“ + + + ”、 “丁丁丁”、“ |_ p’中的一種。所述膠體金標(biāo)記的抗MDV和抗REV的單克隆抗體是通過(guò)以下方法制備的:
將篩選獲得的抗MDV和抗REV的單克隆細(xì)胞株分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用PBS洗滌2遍后1000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，以每只I X IO6 2X IO6個(gè)細(xì)胞的量分別對(duì)經(jīng)產(chǎn)母鼠進(jìn)行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清，分別獲得抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水；
用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5 2 % (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑為15 20 nm的膠體金溶膠；以0.lmol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶膠的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將所述抗MDV的單克隆抗體腹水或抗REV的單克隆抗體腹水分別加入膠體金溶膠中，印跡10 min后，加20 % (wt)的PEG-10000至PEG-10000的終濃度為0.05 %(wt), 4°C下、1500 3000 r/min離心20 min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,在4°C、15000 r/min條件下離心I h，棄上清液，獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分別分離純化金標(biāo)蛋白，得到膠體金印跡的抗MDV單抗和抗REV單抗。所述抗MDV和抗REV的單克隆抗體細(xì)胞株是由以下方法分別制備的:
分別用原核表達(dá)MDV囊膜糖蛋白gB的重組質(zhì)粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重組質(zhì)粒PET-28a-gp90，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21并挑選陽(yáng)性克隆菌株；搖菌培養(yǎng)后用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，菌液上清經(jīng)超聲波裂解后過(guò)鎳柱純化，分別得到純化的MDV gB表達(dá)蛋白和REV gp90表達(dá)蛋白；
將純化的gB表達(dá)蛋白和gp90表達(dá)蛋白分別以20 30 u g/只的劑量用福氏佐劑乳化，制備免疫原免疫6周齡Balb/c系小鼠兩組,每組免疫三次,每次間隔15 30 d ;最后一次加強(qiáng)免疫后3 4 d，分別將兩組免疫鼠眼球放血，拉頸處死后置于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無(wú)菌摘取免疫鼠的脾臟，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用GNK洗液混懸脾細(xì)胞，1000 r/min離心10 min,收集脾細(xì)胞；將每組收集的免疫鼠的I X IO8個(gè)脾細(xì)胞分別與2 X IO7 5 X IO7個(gè)NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，再用GNK洗液混懸稀釋至總體積為40 ml，1000 r/min離心10 min，棄上清，分別將兩種混合細(xì)胞沉淀置于37°C水浴中，在I min內(nèi)分別緩緩加入0.7 1.0 mL pH值為8.5 9.0的PEG-1500，邊加邊輕輕搖晃，然后再分別緩慢加入GNK洗液15 ml，37°C水浴5 min，最后補(bǔ)足GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min，棄上清；將兩種細(xì)胞沉淀分別重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，最后以200 ML/孔分別鋪板至96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10 d，雜交瘤的培養(yǎng)上清分別用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，挑選熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆，分別用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次細(xì)胞亞克隆，最后分別篩選獲得特異性抗MDV和抗REV的單抗雜交瘤細(xì)胞株。所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取NaCl 24 g、KCl 1.2 g、Na2HPO4 12H20
10.68 g、NaH2PO4 2H20 2.34 g、葡萄糖6 g、苯酹紅0.03 g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115。。滅菌 15 min。

本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明根據(jù)ELISA的基本原理，用免疫層析試紙檢測(cè)病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細(xì)管作用，將抗原-抗體反應(yīng)由ELISA的傳統(tǒng)液相環(huán)境轉(zhuǎn)到固相濾膜上快速進(jìn)行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況，即時(shí)獲得檢測(cè)結(jié)果，因此該方法比ELISA等血清學(xué)方法更為簡(jiǎn)便、快速。(2)檢測(cè)特異性強(qiáng)，敏感性高。該檢測(cè)試紙條以膠體金印跡高親和力的特異性單抗或多抗為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)對(duì)單抗或多抗特異性和親和力(結(jié)合力)影響很小，且具有較高的印跡率。(3)操作簡(jiǎn)便，快速。使用本發(fā)明的試紙條時(shí)，可以一次同時(shí)進(jìn)行MDV和REV病毒的快速檢測(cè)，大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)費(fèi)用，提高了工作效率。使用時(shí)只需將測(cè)試端插入待檢樣品液中30 s左右,在I 5 min內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。(4)結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確。試紙條以顯示兩條棕紅色的檢測(cè)印跡Tl和T2以及一條對(duì)照印跡C作為檢測(cè)的陽(yáng)性和質(zhì)控印跡，即在纖維素膜上顯示三條棕紅色印跡T1、T2和C，表示MDV和REV均在被檢測(cè)樣品液中被檢出，結(jié)果為雙陽(yáng)性；在纖維素膜上顯示一條棕紅色的檢測(cè)印跡Tl或T2以及一條對(duì)照印跡C，表示只有相對(duì)應(yīng)的MDV或REV的一種病毒在被檢測(cè)樣品液中被檢出，結(jié)果為單陽(yáng)性；在纖維素膜上只顯示一條棕紅色對(duì)照印跡C，表示兩種病毒均在被檢測(cè)樣品液中未檢出，結(jié)果為陰性。結(jié)果判定直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性的誤判。(5)減少投資和檢測(cè)成本。使用該試紙條，不需另配其它儀器、設(shè)備和試劑，節(jié)省大量?jī)x器、設(shè)備和附加試劑費(fèi)用，專業(yè)和非專業(yè)人士均可隨時(shí)隨地進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，無(wú)需支付專家診斷檢查費(fèi)或送樣品去診斷室的路費(fèi)，節(jié)省檢測(cè)成本。使用該試紙條檢測(cè)每份樣品僅需人民幣3 5元，比用通常的儀器分析(每份樣品300元左右)和進(jìn)口 ELISA試劑盒(每份樣品30元左右)的檢測(cè)費(fèi)大幅下降。(6)應(yīng)用范圍廣，便于普遍推廣應(yīng)用。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成“一步式”或“傻瓜式”操作，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖和個(gè)體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益。


圖1為本發(fā)明試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為圖1試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中，I為支撐層，2為樣品吸附纖維層，3為金標(biāo)抗體纖維層，4為纖維素膜層，5為吸水層，6-1為MDV檢測(cè)印跡，6-2為REV檢測(cè)印跡，7為對(duì)照印跡，8-1為測(cè)試端保護(hù)膜，8-2為手柄端保護(hù)膜，9為印跡線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:一種一步法快速檢測(cè)馬立克氏病病毒MDV和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，參見(jiàn)圖1、圖2。支撐層I以塑膠薄片條制成，樣品吸附纖維層2以玻璃棉制成，金標(biāo)抗體纖維 層3為附著有膠體金標(biāo)記的抗MDV、抗REV的兩種單克隆抗體的玻璃棉制成的混合金標(biāo)抗體，纖維素膜層4為硝酸纖維素制成，吸水層5由吸水濾紙制成，將編號(hào)
2、3、4、5各層依次粘貼在支撐層I上，彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層
4上設(shè)有抗MDV和抗REV的兩種多克隆抗體IgG溶液分別標(biāo)記的MDV檢測(cè)印跡6_1和REV檢測(cè)印跡6-2 (代號(hào)分別為T(mén)l和T2)，以及以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液標(biāo)記的對(duì)照印跡7(代號(hào)C);兩檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列形式為“ |||”。測(cè)試端保護(hù)膜8-1覆蓋在樣品吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3上面，為白色；測(cè)試端保護(hù)膜8-1上偏向于樣品吸附纖維層2的一側(cè)0.5 cm處印有印跡線9，印跡線9的右端印有箭頭及MAX字樣，吸水層5上覆蓋有其它顏色(如黃色或藍(lán)色)的手柄端保護(hù)膜8-2。用于對(duì)照印跡的羊(或兔)抗小鼠IgG抗體，及用于檢測(cè)印跡和金標(biāo)抗體纖維層的抗MDV和抗REV的多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法如下:
(I)羊(或兔)抗小鼠IgG的制備
以飽和硫酸銨法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，再加等體積的飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內(nèi)2 h，在4°C、10000 r/min離心15 min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內(nèi)
2h，在4。。、10000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS液(pH7.2)過(guò)夜透析，換液2 3次，在4°C、10000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。按50 y g/kg 100 U g/kg體重的劑量經(jīng)皮下或肌肉注射純化的IgG抗體至陰性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20 d后靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在1:2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，分離制備高免血清。以飽和硫酸銨法提取羊(或兔)抗小鼠的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于標(biāo)記本發(fā)明試紙條的對(duì)照印跡。(2)抗MDV和抗REV單克隆抗體細(xì)胞株的制備
分別用原核表達(dá)MDV囊膜糖蛋白gB的PET-28a-gB重組質(zhì)粒和REV囊膜糖蛋白gp90的PET-28a-gp90重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，挑取兩種陽(yáng)性克隆菌株，分別接種于5 mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取5 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)約3 h，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即OD6tltl約0.8 1.2，按照每毫升培養(yǎng)基加入10 u L、100 mmol/L的IPTG至終濃度為1.0 mmol/L分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28°C條件下緩慢振蕩培養(yǎng)4 5 h。在4°C、5000 r/min條件下分別離心15 20 min,棄上清,按I g濕重菌體/2 5 ml平衡緩沖液的比例充分懸浮菌體沉淀。用超聲波裂解儀分別裂解兩種菌體，直至云霧狀的菌液變得比較清亮，4°C、15000 rpm離心15 min，分別收集上清液備用。將兩種上清液分別上樣至用平衡緩沖液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑
5mmol/L, pH 8.0)平衡的鎳離子親和層析柱,再依次分別用含30 mmol/L、50 mmol/L、75mmol/L咪唑的洗脫緩 沖液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L，pH7.4)進(jìn)行分階段洗脫，分別收集兩種蛋白的各階段洗脫液。將兩種各階段洗脫峰分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，電泳完畢后用考馬斯亮藍(lán)G2250 (甲醇:水:冰乙酸=4.5:4.5: I)室溫染色2 h，用脫色液(40%甲醇、10%冰乙酸)脫色至背景清晰，觀察結(jié)果表明:兩種重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均有明顯的與各自預(yù)期大小相符的目的蛋白條帶，說(shuō)明MDV的gB蛋白和REV的gp90蛋白在疋coli中均獲得了大量表達(dá)，經(jīng)親和層析的重復(fù)洗脫液中，兩種蛋白均在前兩次的洗脫液中含量較大，此后洗脫液中含量迅速減少，電泳與濃度測(cè)定結(jié)果一致，表明各自洗脫液中的gB表達(dá)蛋白和gp90表達(dá)蛋白純度較高，可滿足兩種單抗制備免疫原的需要。將純化gB表達(dá)蛋白和gp90表達(dá)蛋白分別以20 30 U g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原，免疫6周齡Balb/c系小鼠兩組,每組免疫三次,每次間隔15-30 d ;最后一次加強(qiáng)免疫后3 4 d，分別將gB蛋白和gp90蛋白免疫鼠眼球放血，拉頸處死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無(wú)菌分別摘取兩組免疫鼠的脾臟，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用 GNK 洗液(NaCl 24g、KCl 1.2g,Na2HPO4 12H20 10.68 g,NaH2PO4 2H20 2.34 g、葡萄糖6 g、苯酚紅0.03 g，混合后加雙蒸水至3000 ml，115°C滅菌15 min)混懸脾細(xì)胞，1000r/min離心10 min，收集脾細(xì)胞；將各自收集的兩種免疫鼠的I X IO8個(gè)脾細(xì)胞與2 X IO7 5X IO7個(gè)的NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，再用GNK洗液混懸稀釋至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min,棄上清,分別將兩種混合的細(xì)胞沉淀置于37°C水浴中，在I min內(nèi)緩緩加入
0.7 1.0 mL的PEG-1500(pH 8.5 9.0)，邊加邊輕輕搖動(dòng)，然后再分別緩慢加入GNK洗液15 ml, 37。。水浴5 min后補(bǔ)加GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min棄上清，將兩種細(xì)胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，最后以200 ML/孔分別鋪板至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10 d，用間接免疫熒光試驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，挑選熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆，分別用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次細(xì)胞亞克隆，最后分別篩選獲得特異性抗MDV和抗REV的單抗雜交瘤細(xì)胞株。
(3)抗MDV和抗REV金標(biāo)單克隆抗體和金標(biāo)單克隆抗體纖維膜的制備
將篩選獲得的抗MDV和抗REV的單克隆細(xì)胞株分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用PBS洗滌2遍后1000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，以每只I X IO6 2 X IO6個(gè)細(xì)胞量分別對(duì)經(jīng)產(chǎn)母鼠(母鼠至少一周前腹腔注射滅菌弗氏不完全佐劑)進(jìn)行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清，分別獲得抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水。以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05%(wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2%(wt)檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑15 nm左右的膠體金。以0.1 mol/L的K2CO3溶液調(diào)膠體金的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將待印跡的抗MDV和抗REV的單抗腹水分別加入pH8.5 9.5的金溶膠中，印跡10 min 后，加 20%(wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 終濃度達(dá)到 0.05%，4°C、1500 3000 r/min條件下分別離心20 min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、15000 r/min條件下再次分別離心I h，棄上清液，獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分別分離純化金標(biāo)蛋白，獲得膠體金印跡的抗MDV單抗和抗REV單抗。將1:100 1:500稀釋的膠體金印跡的上述兩種單克隆抗體分別吸附于精制玻璃棉(尼龍纖維或聚酯纖維)中，4°C下低溫真空干燥，即分別制得抗MDV和抗REV的金標(biāo)單克隆抗體纖維膜。(4)抗MDV和抗REV的多克隆抗體的制備
用差速離心或蔗糖密度梯度離心的方法分別對(duì)MDV CEF細(xì)胞毒和REV CEF細(xì)胞毒進(jìn)行濃縮、純化，甲醛滅活后用福氏佐劑乳化，分別制備免疫原，單獨(dú)多次分別免疫接種抗體陰性健康羊或兔兩組。末次免疫20 d后靜脈采血，分別以IFA檢測(cè)兩組免疫動(dòng)物血清中抗MDV和抗REV的抗體水平，效價(jià)達(dá)到1:2000以上時(shí)，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，分別分離制備抗MDV和抗REV的高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)。(5)試紙條的檢測(cè)操作方法
a、檢測(cè)樣品液的制備采集病例雞的全血，以抗凝劑生理鹽水作1:10 1:50倍稀釋，低速離心分離血液淋巴細(xì)胞懸液待檢；若取病雞的組織(如羽髓、肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊等)則將其剪碎、研磨，以生理鹽水制成1:2 1:5的待檢測(cè)樣品懸液，置4°C澄清或離心收集上清液備用。b、檢測(cè)操作將試紙條測(cè)試端插入待檢測(cè)樣品上清中，插入深度不超過(guò)印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時(shí)觀察結(jié)果。C、結(jié)果判斷如果在試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對(duì)照印跡C，表示檢測(cè)結(jié)果呈陰性，說(shuō)明在被檢樣品液中MDV和REV均未檢測(cè)出；如果檢測(cè)試紙條上的纖維素膜上出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C和兩條檢測(cè)印跡Tl和T2，表示檢測(cè)結(jié)果呈雙陽(yáng)性，即在待檢樣品中同時(shí)檢測(cè)出MDV和REV ;如果檢測(cè)試紙條上的纖維素膜上出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C和一條檢測(cè)印跡Tl或T2，表示檢測(cè)結(jié)果呈單陽(yáng)性，即在待檢樣品中檢測(cè)出MDV或REV ;如果纖維素膜上沒(méi)有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。(6)本發(fā)明試紙條的靈敏性、特異性試驗(yàn)
a、靈敏性試驗(yàn)。將MDV的CEF細(xì)胞培養(yǎng)液用PBS (PH7.4)或雙蒸水分別配制成不同病毒滴度的 病毒溶液(100 PFU/mL、50 PFU/mL、25 PFU/mL、12.5 PFU/mL)，將REV 的CEF細(xì)胞培養(yǎng)液用PBS (PH7.4)或雙蒸水分別配制不同病毒滴度的溶液(105_°TCID5Q/mL、104_° TCID50/mLUO3 0 TCID50/mLU02 0 TCID50/mLUOL° TCID5(l/mL)，兩種病毒液按 1:1 的比例混合均勻，將試紙條測(cè)試端插入混合病毒液中，插入深度不超過(guò)印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時(shí)觀察結(jié)果。插入MDV的100 PFU/mL、50PFU/mL和REV的105_°TCID50/mL,IO4 0 TCID5(l/mL兩種混合病毒液中的試紙條均出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C和兩條檢測(cè)印跡Tl和T2，即檢測(cè)結(jié)果為雙陽(yáng)性；插入MDV 25 PFU/mL和REV IO3 0 TCID5(l/mL的混合病毒液中的試紙條出現(xiàn)棕紅色的對(duì)照印跡C，但檢測(cè)印跡Tl和T2的棕紅色均較弱，即檢測(cè)結(jié)果為雙弱陽(yáng)性；插入MDV 12.5 PFU/mL和REV IO2 0 TCID5(l/mL的混合病毒液的試紙條只顯示出一條棕紅色對(duì)照印跡C，即檢測(cè)結(jié)果為陰性。由此可見(jiàn)，該試紙條對(duì)MDV和REV均具有較高的靈敏度，檢測(cè)MDV和REV的最低病毒滴度分別為25 PFU/mL和103_° TCID5(l/mL。b、特異性試驗(yàn)。用本發(fā)明的試紙條檢測(cè)其他家禽免疫抑制病病毒如禽白血病病毒(ALV)和雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的病毒培養(yǎng)液，結(jié)果顯示該試紙條的檢測(cè)結(jié)果均為雙陰性，說(shuō)明該試紙條用于檢測(cè)MDV和REV具有良好的特異性，可用于MD和RE的快速檢測(cè)。(7)上述試紙條的測(cè)試原理
當(dāng)該試紙條測(cè)試端(樣品吸附帶)插入待檢測(cè)樣品溶液后，待檢溶液通過(guò)層析作用帶動(dòng)待檢病雞病料中的MDV和/或REV病毒粒子及金標(biāo)抗體纖維膜中的金標(biāo)MDV和REV抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端吸水層中，擴(kuò)散過(guò)程中待檢MDV和/或REV可與相對(duì)應(yīng)的金標(biāo)單抗相結(jié)合,進(jìn)而與纖維素膜上檢測(cè)印跡中的抗MDV和/或抗REV的多抗IgG結(jié)合，從而顯示出棕紅色的檢測(cè)印跡Tl和/或T2 ;而對(duì)照印跡中的羊或(兔)抗小鼠IgG則可與金標(biāo)MDV單抗和金標(biāo)REV單抗結(jié)合，形成棕紅色對(duì)照印跡C。如果待檢樣品液中沒(méi)有MDV和REV，試紙條只顯示出一條棕紅色對(duì)照印跡C ;如果纖維素膜上沒(méi)有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。實(shí)施例2:馬立克氏 病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的快速檢測(cè)試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著以膠體金標(biāo)記的抗MDV和抗REV的混合金標(biāo)多克隆抗體；在硝酸纖維素制成的纖維素膜層4上分別設(shè)有以抗MDV和抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測(cè)印跡Tl和T2，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對(duì)照印跡C。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同，不重述。實(shí)施例3:馬立克氏病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的快速檢測(cè)試紙條，其結(jié)構(gòu)、制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:由聚酯纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著有抗MDV和抗REV的混合金標(biāo)單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上分別設(shè)有以抗MDV和抗REV多克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測(cè)印跡Tl和T2，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對(duì)照印跡C。其它包括檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4:馬立克氏病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的快速檢測(cè)試紙條，與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于:
由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著抗MDV和抗REV的混合金標(biāo)多克隆抗體；聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上分別設(shè)有以抗MDV和抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測(cè)印跡Tl和T2，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對(duì)照印跡C。
實(shí)施例5:馬立克氏病病毒和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的快速檢測(cè)試紙條，與實(shí)施例3基本相同，不同之處在于:
由尼龍纖維制成的金標(biāo)抗體纖維層3上附著有抗MDV和抗REV的混合金標(biāo)單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上分別設(shè)有識(shí)別另一表位的抗MDV和抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測(cè)印跡Tl和T2，以羊(兔)抗鼠IgG溶液標(biāo)記出對(duì)照印跡C，檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列組合為“/ / /”、“ + + + ”、“1~^”、“丁丁 丁”、“ h h h”中的任意一種。實(shí)施例6:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:
支撐層I由不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2由尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用純纖維素膜制成。實(shí)施例7:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:
樣品吸附纖維層2由聚酯纖維膜制成，纖維素膜層4為羧化纖維素膜制成。實(shí)施例8:試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯(PVDF)纖維膜制成。實(shí)施例9:紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例1基本相同，不同之處在于:
樣品吸附纖維層2采用 聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
權(quán)利要求
1.一種一步法快速檢測(cè)馬立克氏病病毒MDV和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，其特征在于:所述纖維素膜層上標(biāo)記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對(duì)照印跡，以及標(biāo)記的MDV抗體、REV抗體的檢測(cè)印跡，所述MDV抗體、REV抗體為抗MDV、抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測(cè)印跡對(duì)應(yīng)的以膠體金標(biāo)記的抗MDV和抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述支撐層由不吸水的硬質(zhì)塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述金標(biāo)抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:在所述樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水層上敷設(shè)有保護(hù)膜 ，且在樣品吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向樣品吸附纖維層一側(cè)0.3 0.7 cm處印制有樣品標(biāo)記線。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:檢測(cè)印跡與對(duì)照印跡的排列為“I II ”、“/ / /，，、“十十+，，、“丄丄丄”、“丁丁 丁，，、“ 1-1-卜”中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征在于:所述膠體金標(biāo)記的抗MDV和抗REV的單克隆抗體是通過(guò)以下方法制備的: 將篩選獲得的抗MDV和抗REV的單克隆細(xì)胞株分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用PBS洗滌2遍后1000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，以每只I X IO6 2X IO6個(gè)的細(xì)胞量分別對(duì)經(jīng)產(chǎn)母鼠進(jìn)行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清，分別獲得抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水； 用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5 2 %(wt)檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑為15 20 nm的膠體金溶膠；以0.lmol/L的K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶膠的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水分別加入膠體金溶膠中，印跡10 min后，加 20 % (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的終濃度為 0.05 % (wt)，4°C下、1500 3000r/min離心20 min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,在4°C下、15000 r/min再次分別離心I h,棄上清液，獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分別分離純化金標(biāo)蛋白，得到膠體金印跡的抗MDV和抗REV的單克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試紙條，其特征在于:所述抗MDV和抗REV的單克隆抗體細(xì)胞株是由以下方法分別制備的: 分別用原核表達(dá)MDV囊膜糖蛋白gB的重組質(zhì)粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重組質(zhì)粒PET-28a-gp90轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，挑選陽(yáng)性克隆菌株；搖菌培養(yǎng)后用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，菌液上清經(jīng)超聲波裂解后過(guò)鎳柱純化，分別得到純化的MDV gB表達(dá)蛋白和REVgp90表達(dá)蛋白；將純化的MDV gB表達(dá)蛋白和REV gp90表達(dá)蛋白分別以20 30 Ug/只的劑量用福氏佐劑乳化，制備免疫原免疫6周齡Balb/c系小鼠兩組，每組免疫三次，每次間隔15 30d ;最后一次加強(qiáng)免疫后3 4 d，分別將兩組免疫鼠眼球放血，拉頸處死后置于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無(wú)菌摘取免疫鼠的脾臟，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用GNK洗液混懸脾細(xì)胞，1000 r/min離心10 min,收集脾細(xì)胞；將每組收集的免疫鼠的I X IO8個(gè)脾細(xì)胞分別與2X IO7 5X IO7個(gè)NSO骨髓瘤細(xì)胞混合，再用GNK洗液混懸稀釋至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min,棄上清,分別將兩種混合細(xì)胞沉淀置于37°C水浴中，在Imin內(nèi)分別緩緩加入0.7 1.0 mL pH值為8.5 9.0的PEG-1500，邊加邊輕輕搖晃，然后再分別緩慢加入GNK洗液15 ml，37°C水浴5 min，最后補(bǔ)足GNK洗液至總體積為40 ml,.1000 r/min離心10 min,棄上清；將兩種細(xì)胞沉淀分別重懸于1640/HAT選擇培養(yǎng)基中，最后以200 ML/孔分別鋪板至96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10 d，將雜交瘤的培養(yǎng)上清分別用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)，挑選熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆，分別用有限稀釋法連續(xù)進(jìn)行三次細(xì)胞亞克隆，最后分別篩選獲得特異性的抗MDV和抗REV的單抗雜交瘤細(xì)胞株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試紙條，其特征在于:所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取 NaCl 24 g、KCl 1.2 g、Na2HPO4 12H20 10.68 g、NaH2PO4 2H20 2.34 g、葡萄糖 6 g、苯酹紅0.03 g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115°C滅菌15 min。
全文摘要
發(fā)明公開(kāi)一種一步法快速檢測(cè)馬立克氏病病毒MDV和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，吸附層由樣品吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成；纖維素膜層上標(biāo)記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對(duì)照印跡，以及含有抗MDV和抗REV的抗體檢測(cè)印跡；所述抗MDV和抗REV的抗體為抗MDV和抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標(biāo)抗體纖維層上附著有與檢測(cè)印跡對(duì)應(yīng)的以膠體金標(biāo)記的抗MDV和抗REV的混合多克隆抗體或單克隆抗體。該試紙條檢測(cè)的特異性強(qiáng)、敏感性高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，結(jié)果直觀，適用于MDV和REV病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速聯(lián)合檢測(cè)，亦可用于兩種病毒的單獨(dú)感染或混合感染的鑒別診斷。該試紙條應(yīng)用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/569GK103217527SQ201310133790
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者羅俊, 滕蔓, 張改平, 崔治中, 鄧瑞廣, 江國(guó)托, 柴書(shū)軍, 趙鵬, 邢廣旭, 李學(xué)伍, 喬松林, 程娜, 郝慧芳, 李青梅, 金前躍 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院