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研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法
【專利摘要】一種研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法：1）對動物腦切片進(jìn)行5溴脫氧尿嘧啶和雙腎上腺皮質(zhì)激素、5溴脫氧尿嘧啶和神經(jīng)元核心抗原、5溴脫氧尿嘧啶和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子雙標(biāo)免疫熒光染色，以及唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子單標(biāo)免疫熒光染色；2）使用GraphPad?Prism6.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并繪圖，5溴脫氧尿嘧啶陽性細(xì)胞為單因素多組數(shù)據(jù)使用one-way方差分析；所述動物腦切片經(jīng)過以下處理：在腦右側(cè)紋狀體內(nèi)立體定位注射6-羥多巴溶液后，在側(cè)腦室注射PSA特異性裂解酶原液，再腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液。本發(fā)明為研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移影響提供了一種有效的研究方法。
【專利說明】研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地本發(fā)明涉及一種研究腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、增值、分化等影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)是一種常見的以黑質(zhì)紋狀體通路病變?yōu)橹饕卣鞯闹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退變性疾病。目前ro的發(fā)病機(jī)制尚未明確，是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。臨床上的療法都不能從根本上阻止ro病人黑質(zhì)紋狀體通路的進(jìn)行性退變，近來越來越多的人認(rèn)為啟動腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞參與腦損傷修復(fù)很可能發(fā)展成為一個嶄新的治療腦損傷的策略。這一治療策略尤其適用于修復(fù)慢性腦損傷疾病-帕金森病。
[0003]目前經(jīng)典藥物治療如口服左旋多巴(L-dopa)在初期可以減輕或緩解癥狀，但并不能延緩病程的進(jìn)展，且長期使用有明顯的副作用，即L-dopa誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙。外科手術(shù)如深部腦刺激下丘腦核也只能暫時減輕或緩解癥狀。這些療法都不能從根本上阻止H)病人黑質(zhì)紋狀體通路的進(jìn)行性退變，啟動腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞參與ro腦損傷修復(fù)是一個嶄新的治療慢性腦損傷的策略。
[0004]神經(jīng)發(fā)生就是指神經(jīng)元發(fā)育的整個過程，從一個前體細(xì)胞分裂開始，一直到新的神經(jīng)元成熟、整合并具有功能的過程。神經(jīng)前體細(xì)胞能自我更新，但多處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)CNS受損或變性時，細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生改變，NSCs被激活，發(fā)生增殖、遷移、分化、整合，促進(jìn)神經(jīng)元再生及損傷部位腦組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。成年腦有兩個神經(jīng)生發(fā)區(qū)，在那里神經(jīng)再生比較活躍:一個是側(cè)腦室傍邊的腦室管膜下區(qū)(SVZ);—個是海馬的粒細(xì)胞下區(qū)(SGZ)。這兩個部位神經(jīng)干細(xì)胞所產(chǎn)生的未成熟的神經(jīng)細(xì)胞(NeuiOblast)有各自的傳統(tǒng)遷移通路，SVZ所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞形成細(xì)胞簇，沿著嘴側(cè)遷移流(RMS)遷移到嗅球、分化成中間神經(jīng)元；SGZ所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞則遷移到海馬齒狀回的粒細(xì)胞層，分化成中間神經(jīng)元加入到神經(jīng)回路中。揭示這些細(xì)胞遷移的分子機(jī)制和規(guī)律將會給引導(dǎo)這些細(xì)胞向腦損傷區(qū)遷移提供重要的理論依據(jù)。大量研究發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞的共同特點(diǎn)是細(xì)胞表面均表達(dá)很高水平的唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子。當(dāng)這些細(xì)胞到達(dá)目的地、分化成成熟中間神經(jīng)元后，細(xì)胞表面的PSA表達(dá)就會消失，提示PSA-NCAM在未成熟神經(jīng)細(xì)胞定向遷移中起重要的作用。有實(shí)驗(yàn)表明如果將Endo-N注射到側(cè)腦室，傳統(tǒng)遷移通路RMS就會遭到破壞，SVZ所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞則向其他腦組織包括紋狀體異位遷移明顯增多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法，為研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化等影響提供一種有效的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法:
[0007]I)對動物腦切片進(jìn)行BrdU (5溴脫氧尿嘧啶)和DCX (雙腎上腺皮質(zhì)激素)、BrdU和NeuN (神經(jīng)元核心抗原)、BrdU和GFAP (膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)雙標(biāo)免疫熒光染色，以及PSA-NCAM (唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子)單標(biāo)免疫熒光染色；
[0008]2)使用GraphPad Prism6.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并繪圖，BrdU陽性細(xì)胞為單因素多組數(shù)據(jù)使用one-way ANOVA分析。
[0009]所述的方法中，動物腦切片經(jīng)過以下處理:在腦右側(cè)紋狀體內(nèi)立體定位注射6-0HDA (6-羥多巴胺)溶液后，在側(cè)腦室注射Endo-N (PSA特異性裂解酶)原液，再腹腔注射BrdU溶液。
[0010]所述的方法中，動物腦切片是指動物左右腦切片。
[0011 ] 所述的方法中，所述動物腦切片中包括有對照組腦切片。
[0012]所述的方法中，所述對照組腦切片是立體定位注射6-0HDA溶液后，在側(cè)腦室注射PBS緩沖液，再腹腔注射BrdU溶液。
[0013]所述的方法中，所述動物腦切片腹腔注射BrdU溶液是連續(xù)注射數(shù)天。
[0014]所述的方法中，所述統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)的結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean土SEM)表示，以p〈0.05作為在統(tǒng)計學(xué)差異的界限。
[0015]本發(fā)明的方法可以用于研究神經(jīng)干細(xì)胞的遷移特點(diǎn)，分析6-0HDA損傷的紋狀體中的遷移來的細(xì)胞的分化能力，為進(jìn)一步深入研究如何啟動腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化等影響奠定了重要的工作基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明一個實(shí)施例的方法研究路線。
[0017]圖2是本發(fā)明一個實(shí)施例對C57BL/6J小鼠側(cè)腦室注射Endo-N去除PSA后，PSA-NCAM的免疫熒光染色結(jié)果；其中:圖a為對照組，圖b為實(shí)驗(yàn)組，切片為矢狀位切片，圖中虛線表示的是RMS。LV,側(cè)腦室；0B，嗅球；RMS，嘴側(cè)遷移流。比例尺，250 μ Μ。
[0018]圖3是本發(fā)明一個實(shí)施例6-0HDA注射13天后BrdU+細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果；其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實(shí)驗(yàn)組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實(shí)驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀位切片。圖c是圖b的虛線框的放大的矢狀位切片共聚焦圖，圖f是圖e的虛線框的放大，圖g是單因素多組數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果圖，對照小鼠n=5，實(shí)驗(yàn)組小鼠n=5，*p〈0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0019]圖4是本發(fā)明一個實(shí)施例的6-0HDA注射13天后BrdU/DCX+雙標(biāo)細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果；其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實(shí)驗(yàn)組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實(shí)驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀位切片。小鼠腦矢狀位切片紋狀體共聚焦圖圖f為放大圖c的虛線框的激光共聚焦正交投影圖，顯示的雙標(biāo)細(xì)胞為BrdU/DCX+細(xì)胞；圖c比例尺500 μ M，圖e比例尺25 μ Μ。
[0020]圖5是本發(fā)明的一個實(shí)施例的6-0HDA注射23天后BrdU+細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果矢狀位切片共聚焦圖。其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實(shí)驗(yàn)組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實(shí)驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀位切片。圖c是圖b的虛線框的放大，圖f是圖e的虛線框的放大。圖g是單因素多組數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果圖。(對照小鼠n=5，實(shí)驗(yàn)組小鼠n=5，*p〈0.05#p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義)
[0021 ] 圖6是本發(fā)明的一個實(shí)施例的6-0HDA注射23天后BrdU/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果。其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實(shí)驗(yàn)組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實(shí)驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀位切片。小鼠腦矢狀位切片紋狀體共聚焦圖圖f為放大圖c的虛線框的激光共聚焦正交投影圖，顯示的雙標(biāo)細(xì)胞為BrdU/GFAP+細(xì)胞，圖c比例尺100 μ M，圖e比例尺25 μ M0
[0022]圖7是本發(fā)明的一個實(shí)施例的6-0HDA注射23天后BrdU/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果。其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實(shí)驗(yàn)組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實(shí)驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀位切片。小鼠腦矢狀位切片紋狀體共聚焦圖圖f為放大圖c的虛線框的激光共聚焦正交投影圖，顯示的雙標(biāo)細(xì)胞為BrdU/NeuN+細(xì)胞，圖c比例尺100 μ M，圖e比例尺25 μ M0
【具體實(shí)施方式】
[0023]在此對本發(fā)明說明書中涉及的若干英文縮略語作一說明，后文中提到的英文縮略語均按此說明理解:
[0024]PD (Parkinson，s disease)帕金森?。?br> [0025]AD (Alzheimer disease)阿爾茲海默?。?br> [0026]DA (dopamine)多巴胺；
[0027]L-DOPA (Ievodopa)左旋多巴；
[0028]PB (phosphate buffer)憐酸緩沖液；
[0029]PBS (phosphate buffered saline)憐酸緩沖鹽溶液；
[0030]SN (Substantia nigra)黑質(zhì)；
[0031]TH (tyrosine hydroxylase)酪氨酸輕化酶；
[0032]6-OHDA (6_Hydroxydopamine) 6_ 輕多巴；
[0033]Endo-N (endoneuraminidase) PSA 特異性裂解酶；
[0034]EGF (epidermal growth factor)表皮生長因子；
[0035]BDNF (brain derived neurotrophin factor)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；
[0036]GFAP (glial fibrillary acidic protein)膠質(zhì)源纖維酸性蛋白；
[0037]SGZ (subgranular zone)顆粒下層；
[0038]SVZ (subventricular zone)室管膜下區(qū)；
[0039]RMS (rostral migratory stream)嘴側(cè)遷移流；
[0040]NSCs (neural stem cells)神經(jīng)干細(xì)胞；
[0041]NPCs (neural precursor cells)神經(jīng)前體細(xì)胞；
[0042]DW (distilled water)蒸懼水；
[0043]NeuN (neuron special protein)神經(jīng)兀核心抗原；
[0044]DCX (doublecortin)雙腎上腺皮質(zhì)激素；
[0045]BrdU (5-bromo_2，-deoxyuridine) 5 溴脫氧尿啼唳；
[0046]NGS (normal goat serum)正常山羊血清；
[0047]ANOVA (analysis of Variance)方差分析；
[0048]PFA (paraformaldehyde)多聚甲醒；
[0049]PSA-NCAM (Polysialic acid-neural cell adhesion molecular)唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子；
[0050]GDNF (glial cell derived neurotrophic factor)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。
[0051]本發(fā)明的一個實(shí)施例是通過紋狀體單側(cè)注射6-0HDA來制備慢性腦損傷模型。由于紋狀體是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的主要靶區(qū)，注射于其中的6-0HDA可被前者的末梢吸收，通過逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)至黑質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)元胞體，在經(jīng)單胺氧化酶轉(zhuǎn)化成自由基，可選擇性地破壞這些神經(jīng)元而出現(xiàn)類似H)的癥狀。由于6-0HDA必須通過逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)才能到達(dá)中腦黑質(zhì)，因此多巴胺能神經(jīng)元的死亡是一種間接的、漸進(jìn)的過程。跟黑質(zhì)直接毀損法相比，這種損傷過程更接近于人類H)發(fā)病的臨床特點(diǎn)，在手術(shù)操作上紋狀體較黑質(zhì)更易于解剖定位。本發(fā)明更感興趣的是在局部損傷的紋狀體靠近svz區(qū)，將Endo-N原液注射到側(cè)腦室去除PSA后，細(xì)胞間的同嗜性黏附作用增加，因此，本發(fā)明觀察了它對傳統(tǒng)遷移通路RMS的作用情況。DCX主要表達(dá)于遷移中的神經(jīng)干細(xì)胞胞體和前導(dǎo)突起上，常用于標(biāo)記遷移中神經(jīng)干細(xì)胞。因此，同時觀察了 BrdU和DCX雙標(biāo)細(xì)胞的情況，分析紋狀體中的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量。也觀察了遷移而來的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。這將為進(jìn)一步深入研究如何啟動腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化等影響奠定部分重要的工作基礎(chǔ)。
[0052]本發(fā)明的目的:
[0053](I)用Endo-N去除PSA能否增加SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞異位遷移到6-0HDA損傷的紋狀體；
[0054](2)研究異位遷移的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力，進(jìn)而為研究帕金森病的病理提供部分基礎(chǔ)。
[0055]本發(fā)明采用的腦組織冰凍切片，可以使用以下方法制得:
[0056](I)選取C57BL/6J實(shí)驗(yàn)用雄性小鼠分為四組，每組五只動物，全部在腦右側(cè)紋狀體內(nèi)，立體定位注射2 μ 16-0HDA溶液。
[0057](2) 6-0HDA立體定位注射3天后，實(shí)驗(yàn)組小鼠側(cè)腦室注射5 μ IEndo-N原液，對照組注射相同體積的PBS緩沖液。
[0058](3)在6-0HDA注射后,第8天開始,每天兩次，分別對4組共20只動物按50mg/kg腹腔注射BrdU溶液，連續(xù)注射3天。
[0059](4)分別在6-0HDA注射后第13天、第23天灌殺取材，固定脫水包埋。用冰凍切片機(jī)對實(shí)驗(yàn)小鼠全腦進(jìn)行矢狀切片，切片厚度為35 μ m。
[0060](5)對四組全部動物左右腦切片，進(jìn)行fcdU和DCX、BrdU和NeuNJrdU和GFAP雙標(biāo)免疫熒光染色，以及PSA-NCAM單標(biāo)免疫熒光染色。
[0061](6)使用GraphPad Prism6.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并繪圖，BrdU陽性細(xì)胞為單因素多組數(shù)據(jù)使用one-way ANOVA分析。
[0062]制得的腦組織冰凍切片中:
[0063]I)實(shí)驗(yàn)組動物遷移流RMS中，有少量PSA-NCAM陽性細(xì)胞，對照組動物遷移流RMS中，有大量的PSA-NCAM陽性細(xì)胞。
[0064]2)實(shí)驗(yàn)組動物紋狀體中有大量BrdU陽性細(xì)胞，存在BrdU和DCX、BrdU和NeuN、BrdU和GFAP雙標(biāo)細(xì)胞。對照組動物紋狀體有少量BrdU陽性細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)BrdU和DCX、BrdU和NeuN、BrdU和GFAP雙標(biāo)細(xì)胞。
[0065]由此可以得知:[0066]I)用Endo-N去除PSA后，有大量神經(jīng)干細(xì)胞異位遷移到6-0HDA損傷的紋狀體，這些神經(jīng)干細(xì)胞可能來自于SVZ區(qū)。
[0067]2)遷移來的神經(jīng)干細(xì)胞具有分化能力，可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。
[0068]以下舉一個具體實(shí)施例作詳細(xì)說明。
[0069]一、實(shí)驗(yàn)材料
[0070]1、實(shí)驗(yàn)動物
[0071 ] 本實(shí)施例所用的動物為C57BL/6J小鼠，雄性，8_10周，體重22_26g，由首都醫(yī)科大學(xué)動物部提供。每天十二小時光照與十二小時黑暗交替環(huán)境，攝食飲水自由，飼養(yǎng)條件為SPF 級。
[0072]二、實(shí)驗(yàn)方法
[0073]1、小鼠腦立體定位注射與BrdU的腹腔注射標(biāo)記
[0074]I) 6-0HDA的立體定位注射
[0075]將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組(A、B、C、D)，每組五只動物(見圖1)，全部在大腦右側(cè)紋狀體內(nèi)，立體定位注射 6-0HDA 溶液(5mg/ml6-0HDA, 0.2% 的維 C，0.9%NaCl)。
[0076]2)步驟如下:
[0077](I)小鼠稱重，用Equitisin按3ml/kg體重，腹腔注射麻醉，將麻醉好的小鼠腹面向下，在下方墊一塊泡沫，并固定于腦立體定位儀上。
[0078](2)頭部備皮，常規(guī)碘酒酒精消毒后，取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，直至暴露顱骨，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜確定紋狀體注射位點(diǎn)坐標(biāo)。選用的注射位點(diǎn)坐標(biāo)為，前鹵前(AP) +0.5mm，正中線右旁開(ML) +1.9mm，硬腦膜下(DV) -2.65mm,門齒棒低于耳間線(TB) -1mm。
[0079](3)在手術(shù)顯微鏡下，立體定位上述注射位點(diǎn)，用牙科鉆余在相應(yīng)的顱骨處，小心鉆開一小孔，不要用力過大，避免損傷大腦實(shí)質(zhì)，用小鑷子輕輕挑開硬腦膜。
[0080](4)用Hamilton微量注射器，緩緩注入2μ 16-0HDA(5yg/y I)溶液(圖1)，每注射I μ I留針lmin，注射完畢后留針十分鐘，防止液體溢出，最后慢慢退出Hamilton微量注射器。
[0081](5)用碘酒和酒精擦拭傷口消毒抗菌后，縫合皮膚，將動物放置于溫暖環(huán)境中，蘇醒后給予食物和水。
[0082]2、Endo-N原液的立體定位注射
[0083]6-0HDA立體定位注射3天后，實(shí)驗(yàn)組(B、D)小鼠側(cè)腦室注射5 μ I Endo-N原液(lU/μ 1)，對照組(A、C)注射相同體積的0.0lMPBS緩沖液(見圖1)。步驟如下:
[0084](I)小鼠稱重，用Equitisin按3ml/kg體重，腹腔注射麻醉，將麻醉好的小鼠腹面向下，在下方墊一塊泡沫，并固定于腦立體定位儀上。
[0085](2)小鼠頭部酒精消毒后，取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，直至暴露顱骨，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜確定側(cè)腦室注射位點(diǎn)坐標(biāo)。選用的注射位點(diǎn)坐標(biāo)為，前齒(AP) +Omm,正中線右旁開(ML) +0.9mm,硬腦膜下(DV) -2.3mm,門齒棒低于耳間線
(TB) -1mnin
[0086](3)在手術(shù)顯微鏡下，立體定位上述注射位點(diǎn)，用牙科鉆余在相應(yīng)的顱骨處，小心鉆開一小孔，不要用力過大，避免損傷大腦實(shí)質(zhì)，用小鑷子輕輕挑開硬腦膜。[0087](4)用Hamilton微量注射器，緩緩注入5μ I Endo-N原液(IU/μ I)或0.0lM的PBS (見圖1)，每注射Iy I留針3min，注射完畢后留針十分鐘，防止溢出，最后慢慢退出微
量注射器。
[0088](5)用碘酒和酒精擦拭傷口消毒抗菌后，縫合皮膚，將動物放置于溫暖環(huán)境中，蘇醒后給予食物和水。
[0089]3、BrdU的腹腔注射標(biāo)記
[0090]在6-0HDA注射后，第8天開始，每天兩次，間隔4小時，分別對4組共20只動物按50mg/kg腹腔注射BrdU溶液，連續(xù)注射3天(見圖1)。具體步驟:
[0091](I)用Iml的注射器，配合4號針頭進(jìn)行小鼠腹腔注射
[0092](2)注射時右手持注射器，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下。這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止注射器刺入時損傷大腸、小腸等器官。進(jìn)針的動作要輕柔，防止刺傷腹部器官。尤其是對于體重較小的小鼠，腹腔注射時針頭可以在腹部皮下穿行一小段距離，最好是從腹部一側(cè)進(jìn)針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。
[0093]4、取材與固定
[0094]A、B組在6-0HDA注射后第13天灌殺取材，C、D組在6-0HDA注射后第23天灌殺取材(圖1)。
[0095](I)調(diào)試清洗灌注泵:用0.0lM PBS沖洗管道，排凈管道中的氣泡，待管道中充滿PBS時，關(guān)機(jī)備用。
[0096](2)小鼠稱重，用Equitisin按3ml/kg體重，腹腔注射麻醉。
[0097](3)將小鼠腹面向上妥善固定于蠟盤上，用止血鉗提起劍突處皮膚，剪開皮膚及皮下組織，繼而向兩側(cè)剪開，直至腋中線，充分暴露胸腹腔交界處及膈肌。再從劍突處剪開膈肌，向兩側(cè)分離，充分暴露胸腔和心臟。注意向上輕輕挑著剪，防止損傷內(nèi)臟引起大量出血；
[0098](4)游離心臟，分離心包膜，將灌注針插入左心室，用止血鉗固定。剪開右心耳，打開灌注泵。灌注0.0lM PBS0盡快暴露腹腔，輕輕按摩腹腔內(nèi)肝臟，以幫助血液的快速排空，待動物肝臟明顯發(fā)白時，關(guān)閉灌注泵，將灌注管移至4%的多聚甲醛溶液中，盛多聚甲醛溶液的燒杯事先放入冰塊中。打開灌注泵，灌注多聚甲醛，前1/3量快速灌注，后2/3量緩慢灌注，動物四肢抽動僵直后，繼續(xù)灌注多聚甲醛IOOml左右。
[0099](5)灌注完畢后，用咬骨鉗剝離顱骨及硬腦膜，去除小腦簾、大腦幕。放入4%的多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定，4°C保存24小時后取出腦組織，放入30%的蔗糖溶液中4°C保存至標(biāo)本沉底。
[0100]5、小鼠腦組織冰凍切片
[0101](I)將脫水完成后的腦組織從30%的蔗糖溶液中取出，用少量的0.0lM的PBS沖洗，用OCT包埋做好標(biāo)記，放入-40°C低溫冰箱過夜。
[0102](2)冰凍切片機(jī)預(yù)冷，安裝固定刀片，待溫度穩(wěn)定在_20°C時，凍出冰臺，準(zhǔn)備小毛
筆一只，備用。
[0103](3)取出包埋塊，置于冰凍切片機(jī)，參考小鼠腦立體定位圖譜，按標(biāo)記從左腦開始至右腦對全腦進(jìn)行矢狀切片，切片厚度為35 μ m。[0104](4)全腦連續(xù)切片，左右腦分別分成5個孔放置，這樣每孔均為一套連續(xù)切片。在小鼠左腦切到皮質(zhì)下Iml時留片，按順序放到放置左腦切片的孔中。在小鼠左腦嗅球和第三腦室不見時，開始留右腦切片。并按順序放到放置右腦切片的孔中。所有切片放入盛有防凍液的24孔板中，4°C保存。
[0105]6、小鼠腦矢狀切片免疫熒光化學(xué)染色，
[0106]四組全部動物左右腦連續(xù)矢狀位腦切片，進(jìn)行了 BrdU的免疫熒光染色。A組和B組(6-0HDA注射后第13天灌殺)，同時還進(jìn)行了 PSA-NCAM免疫熒光染色、BrdU和DCX雙標(biāo)免疫熒光染色。C組和D組出-OHDA注射后第23天灌殺)動物，右腦部分切片同時還進(jìn)行了 BrdU和NeuN雙標(biāo)免疫熒光染色，BrdU和GFAP雙標(biāo)免疫熒光染色。
[0107]I) BrdU的免疫熒光染色
[0108](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0109](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min
[0110](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0111](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/次；
[0112](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0113](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ；
[0114](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次
[0115](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為CyTM3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200 ；
[0116](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次
[0117](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡.[0118](11)顯微鏡下觀察，共聚焦拍照，應(yīng)注意熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0119]2) BrdU和DCX雙標(biāo)免疫熒光染色
[0120](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0121](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min ；
[0122](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0123](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0124](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0125](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ;兔抗Doublecortin (DCX) 1:500 ；
[0126](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0127](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為Alexa FluorR488_ 山羊抗兔 1:200 ；Cy?3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200 ；
[0128](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0129](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡；[0130](11)顯微鏡下觀察，共聚焦拍照；應(yīng)注意熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0131]3) PSA-NCAM免疫熒光染色。
[0132](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0133](2) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0134](3) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為小鼠抗PSA-NCAM單克隆抗體1:350 ;
[0135](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0136](5) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為DyLightTM488-山羊抗小鼠 1:200 ；
[0137](6)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0138](7)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡；
[0139](8)顯微鏡下觀察激光，共聚焦拍照，應(yīng)注意:熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0140]4 ) BrdU和NeuN雙標(biāo)免疫熒光染色
[0141](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0142](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min ；
[0143](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0144](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0145](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0146](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為小鼠抗NeuN單克隆抗體1:300 ;大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ；
[0147](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0148](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為DyLightTM488-山羊抗小鼠 1:200 ；CyTM3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200;
[0149](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次;
[0150](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡.[0151](11)顯微鏡下觀察，激光共聚焦拍照，應(yīng)注意:熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0152]5 ) BrdU和GFAP雙標(biāo)免疫熒光染色
[0153](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0154](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min ；
[0155](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0156](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次
[0157](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX-100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0158](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為兔抗GFAP多克隆抗體1:1000 ;大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ；[0159](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0160](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為 DyLightTM549-山羊抗兔 1:200 ；CyTM3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200 ;
[0161](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0162](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡。
[0163](11)顯微鏡下觀察激光，共聚焦拍照，應(yīng)注意:熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0164]7、統(tǒng)計學(xué)處理
[0165]數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism6.0軟件統(tǒng)計分析并繪圖，單因素多組數(shù)據(jù)使用one-wayANOVA分析，其結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean土SEM)表示。以p〈0.05作為在統(tǒng)計學(xué)差異的界限。
[0166]本實(shí)施例選取了 A組和B組的小鼠右腦含RMS的腦矢狀位切片進(jìn)行了成神經(jīng)細(xì)胞(Neuroblasts)的特有的蛋白PSA-NCAM的染色，結(jié)果用Endo-N原液(IU/μ I)處理，在6-0HDA注射13天后灌殺的實(shí)驗(yàn)組小鼠(B組)的RMS中基本不表達(dá)PSA-NCAM。而用等量的PBS處理的對照組小鼠(Α組)的RMS中高表達(dá)PSA-NCAM (見圖2)。
[0167]在Endo-N原液(IU/μ I)處理的實(shí)驗(yàn)組B組小鼠(在6-0HDA注射13天后灌殺)的紋狀體中，含中有大量的BrdU陽性細(xì)胞(見圖3)
[0168]本實(shí)施例選取了 A組和B組的小鼠左右腦一整套連續(xù)矢狀位切片進(jìn)行了 BrdU的免疫熒光染色，用倒置熒光顯微鏡觀察全部腦切片，選取含有紋狀體紋理和視神經(jīng)束同時純在的矢狀切片，進(jìn)行BrdU陽性細(xì)胞的統(tǒng)計并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。分為以下各組:Control-left 組和 Contorl-right 組的(原始數(shù)據(jù)見表 I )Endo-N_left 組和 Endo-N-right組(原始數(shù)據(jù)見表2)。使用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，可觀察到Control-left組(圖3a) BrdU 陽性細(xì)胞很少，Contorl-right 組(圖 3b)和 Endo-N-1eft 組(圖 3d) BrdU 陽性細(xì)胞不多，Endo-N-right組(圖3e)有大量BrdU陽性細(xì)胞。四組數(shù)據(jù)使用one-way ANOVA分析，其結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean土SEM)表示。以p〈0.05作為在統(tǒng)計學(xué)差異的界限(圖3g)。結(jié)果Endo-N-right組與其他三組均有統(tǒng)計學(xué)差異。
[0169]在Endo-N原液(IU/μ I)處理的實(shí)驗(yàn)組B組小鼠(在6-0HDA注射13天后灌殺)的紋狀體中，含有少量BrdU/DCX+雙標(biāo)細(xì)胞(見圖4)。本實(shí)施例選取了 A組和B組的小鼠右腦一套連續(xù)矢狀位切片進(jìn)行了 BrdU/DCX+雙標(biāo)免疫熒光染色，用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，在B組的Endo-N-right (試驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀切片)組，發(fā)現(xiàn)少量BrdU/DCX+雙標(biāo)細(xì)胞(圖4c)，在A組的Contorl-right (對照組右腦紋狀體矢狀切片)組沒有發(fā)現(xiàn)明顯標(biāo)記物。本實(shí)施命例選取了一個BrdU/DCX+雙標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行了共聚焦正交投影(圖4f)。
[0170]在Endo-N原液(IU/μ I)處理的實(shí)驗(yàn)組D組小鼠(在6-0HDA注射23天后灌殺)的紋狀體中，含有大量的BrdU陽性細(xì)胞(見圖5)。本實(shí)施例選取了 C組和D組的小鼠左右腦一整套連續(xù)矢狀位切片進(jìn)行了 BrdU的免疫熒光染色，用倒置熒光顯微鏡觀察全部腦切片，選取含有紋狀體紋理和視神經(jīng)束同時純在的矢狀切片，進(jìn)行BrdU陽性細(xì)胞的統(tǒng)計并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。分為以下各組:Control-left組和Contorl-right組的(原始數(shù)據(jù)見表
3)Endo-N-1eft組和Endo-N-right組(原始數(shù)據(jù)見表4)。使用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，可觀察到Control-left組(圖5a) BrdU陽性細(xì)胞很少，Contorl-right組(圖5b)和Endo-N-1eft組(圖5d) BrdU陽性細(xì)胞不多，Endo-N-right組(圖5e)有大量fcdU陽性細(xì)胞。四組數(shù)據(jù)使用one-wayANOVA分析，其結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean土SEM)表示。以p〈0.05作為在統(tǒng)計學(xué)差異的界限(圖5g)。結(jié)果Endo-N-right組與其他三組均有統(tǒng)計學(xué)差異。Endo-N-1eft組與Control-left組也有統(tǒng)計學(xué)差異。
[0171 ] 在Endo-N原液(IU/ μ I)處理的實(shí)驗(yàn)組D組小鼠(在6-0HDA注射23天后灌殺)的紋狀體中，含有少量BrdU/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞(見圖6)。本實(shí)施例選取了 C組和D組的小鼠右腦一套連續(xù)矢狀位切片進(jìn)行了 BrdU/GFAP+雙標(biāo)免疫熒光染色，用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，在D組的Endo-N-right (試驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀切片)組，發(fā)現(xiàn)少量BrdU/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞(圖6c)，在C組的Contorl-right (對照組右腦紋狀體矢狀切片)組沒有發(fā)現(xiàn)明顯標(biāo)記物。本實(shí)施例選取了一個BrdU/GFAP+雙標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行了共聚焦正交投影(圖6f)。
[0172]在Endo-N原液(IU/ μ I)處理的實(shí)驗(yàn)組D組小鼠(在6-0HDA注射23天后灌殺)的紋狀體中，含有少量BrdU/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞(見圖7)。本實(shí)施例選取了 C組和D組的小鼠右腦一套連續(xù)矢狀位切片進(jìn)行了 BrdU/NeuN+雙標(biāo)免疫熒光染色，用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，在D組的Endo-N-right (試驗(yàn)組右腦紋狀體矢狀切片)組，發(fā)現(xiàn)少量BrdU/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞(圖7c)，在C組的Contorl-right (對照組右腦紋狀體矢狀切片)組沒有發(fā)現(xiàn)明顯標(biāo)記物。本實(shí)施例選取了一個BrdU/NeuN+雙標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行了共聚焦正交投影(圖7f)。
[0173]本發(fā)明的方法中，6-0HDA是一種神經(jīng)毒素可以選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元。當(dāng)把6-0HDA直接注射黑質(zhì)后，小鼠中腦黑質(zhì)中的富含單胺氧化酶的DA能神經(jīng)元會吸收它，并在單胺氧化酶作用下轉(zhuǎn)化成神經(jīng)毒素，如自由基和醌類對神經(jīng)元造成損害。對于神經(jīng)解剖學(xué)而言，黑質(zhì)傳出的纖維主要形成了黑質(zhì)紋狀體投射，也就是投射纖維自黑質(zhì)發(fā)出后，沿黑質(zhì)背內(nèi)側(cè)上行經(jīng)下丘腦外側(cè)、內(nèi)囊內(nèi)側(cè)到達(dá)紋狀體的尾狀核頭部和殼核頭部。當(dāng)6-0HDA注射至小鼠紋狀體后，被多巴胺能神經(jīng)元末梢通過軸突逆轉(zhuǎn)運(yùn)輸至黑質(zhì)部細(xì)胞體內(nèi)，通過破壞多巴胺能神經(jīng)元的抗氧化系統(tǒng)，使線粒體功能、膜的穩(wěn)定性和DNA完整性受到了破壞，最終導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)的功能減退而產(chǎn)生慢性腦損傷癥狀。因此，使用6-0HDA制備H)動物模型的靶點(diǎn)主要有黑質(zhì)致密部、紋狀體及內(nèi)側(cè)前腦束，最常用的方法為單側(cè)注射6-0HDA至黑質(zhì)或內(nèi)側(cè)前腦束，促使多巴胺能神經(jīng)元在較短時間內(nèi)快速死亡，這樣制備了 H)急性損傷模型，不易模擬早期H)病理表現(xiàn)。而慢性損傷模型大可以直接注射6-0HDA至紋狀體內(nèi)而導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，這種方法可以在一周到幾周的時間內(nèi)緩慢產(chǎn)生神經(jīng)元變性，符合ro進(jìn)行性退變的病程。本發(fā)明中就是采用腦立體定位小鼠單側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-0HDA制造慢性腦損傷。
[0174]2010 年 Daniela Battista 和 Urs Rutishauser 使用 Endo-N (PSA 的特異性裂解酶)去除PAS后，他們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)遷移通路RMS遭到破壞，SVZ所產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細(xì)胞則向其他腦組織包括紋狀體異位遷移明顯增多。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)動物的紋狀體中也觀察到了相同的結(jié)果，同時還發(fā)現(xiàn)小鼠右側(cè)6-0HDA損傷的紋狀體中有大量的BrdU陽性細(xì)胞，與紋狀體未損傷的同只實(shí)驗(yàn)小鼠的左側(cè)比較，這一現(xiàn)象尤為明顯。因此通過本發(fā)明的方法可以考慮到，6-0HDA損傷造成的局部炎性對神經(jīng)干細(xì)胞的吸引性遷移作用是明顯的。使用Endo-N有效的去除PAS后，失去了粘附力的神經(jīng)干細(xì)胞在svz區(qū)和RMS啟始區(qū)的大量聚集為向紋狀體遷移提供了前提。這一結(jié)果提示人們使用Endo-N去除PSA將成為一個有效的啟動內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞治療慢性腦損傷的途徑。
[0175]大量研究發(fā)現(xiàn)腦室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞在遷移過程中表面均表達(dá)很高水平的PSA-NCAM。當(dāng)這些細(xì)胞到達(dá)目的地、分化成成熟中間神經(jīng)元后，細(xì)胞表面的PSA表達(dá)就會消失，提示PSA-NCAM在未成熟神經(jīng)細(xì)胞定向遷移中起重要的作用，同時也有人證明PSA-NCAM有抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用。因此，本發(fā)明可以對遷移到紋狀體的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力進(jìn)行研究。并在做了染色后得到了喜人的結(jié)果，這類遷移而來的神經(jīng)干細(xì)胞已分化成為成熟的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一類神經(jīng)細(xì)胞，它們并不像神經(jīng)元那樣傳導(dǎo)電沖動，長期以來被認(rèn)為只起支持作用。直到近些年來，人們才開始認(rèn)識到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞)在大腦中的調(diào)節(jié)作用并和大腦認(rèn)知能力有關(guān)。本發(fā)明的研究結(jié)果進(jìn)一步提示遷移的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。
[0176]表1:對照組(A組)的小鼠腦紋狀體BrdU+數(shù)量
[0177]
【權(quán)利要求】
1.一種研究腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞遷移、增殖、分化的方法: 1)對動物腦切片進(jìn)行5溴脫氧尿嘧啶和雙腎上腺皮質(zhì)激素、5溴脫氧尿嘧啶和神經(jīng)元核心抗原、5溴脫氧尿嘧啶和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子雙標(biāo)免疫熒光染色，以及唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞粘附因子單標(biāo)免疫熒光染色； 2)使用GraphPadPrism6.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)并繪圖，5溴脫氧尿喃唳陽性細(xì)胞為單因素多組數(shù)據(jù)使用one-way方差分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片經(jīng)過以下處理: 在腦右側(cè)紋狀體內(nèi)立體定位注射6-羥多巴胺溶液后，在側(cè)腦室注射PSA特異性裂解酶原液，再腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片是動物左右腦切片。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片中包括有對照組腦切片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中，所述對照組腦切片是立體定位注射6-羥多巴胺溶液后，在側(cè)腦室注射磷酸緩沖鹽溶液緩沖液，再腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液是連續(xù)注射數(shù)天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)的結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以p〈0.05作為在統(tǒng)計學(xué)差異的界限。
【文檔編號】G01N33/533GK103940985SQ201410140961
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】段維明, 張永鑫, 楊春 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)