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沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法【專利摘要】沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，涉及微型藻的分離。提供一種用于穩(wěn)定同位素測定的沿岸水體泥質(zhì)或泥沙質(zhì)沉積物表層的底棲微型藻類樣品的提取方法。采集沉積物，在沉積物表層鋪設(shè)第一層沙層，在第一層沙層表面覆上篩絹，篩絹上再鋪設(shè)第二層沙層，從上到下形成“第二層沙層-篩絹-第一層沙層-沉積物層”的四層結(jié)構(gòu)，在第二層沙層上噴灑過濾海水濕潤沙表面，蓋上透光外罩并放在有光的環(huán)境中；收集篩絹上的沙至海水中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮，待沙沉淀后，導(dǎo)出上層水液，經(jīng)篩絹過濾攔截可能的細(xì)沙顆粒，然后將濾液過濾至GF/F膜上，即得沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類，可用于碳、氮穩(wěn)定同位素的測定?！緦＠f明】沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及微型藻的分離，尤其是涉及一種用于穩(wěn)定同位素測定的沿岸水體泥質(zhì)或泥沙質(zhì)沉積物表層的底棲微型藻類樣品的提取方法，主要用于提取具有運(yùn)動能力的羽紋硅藻和具鞭毛的甲藻等藻類，通過該技術(shù)可以提取環(huán)境中含量較低的微型藻類，用于穩(wěn)定同位素測定以及用于底棲微型藻類的進(jìn)一步純化、培養(yǎng)的粗樣品需求。【
背景技術(shù)：
】[0002]在沿岸海洋生態(tài)系統(tǒng)中，初級生產(chǎn)者是支持食物網(wǎng)正常流轉(zhuǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)或有機(jī)碳的來源。在這些初級生產(chǎn)者中，底棲微型藻類在河口、潟湖、潮灘等沿岸淺水系統(tǒng)的營養(yǎng)貢獻(xiàn)得到廣泛的關(guān)注(MillerDC,GeiderRJ,MacIntyreHL.Microphytobenthos:theecologicalroleofthe“secretgarden，，ofunvegetated,shallow-watermarinehabitats.11.Roleinsedimentstabilityandshallow-waterfoodwebs.Estuaries,1996,19:202-212;AnselIA,GibsonR,BarnesM.Theroleofbenthicmicroalgaeinneriticecosystems.0ceanographyandmarinebiology:anannualreview,1999，37:47-86)。許多研究表明，在近岸的海草床生態(tài)系統(tǒng)和鹽沼濕地，底棲微型藻類在食物網(wǎng)的營養(yǎng)動態(tài)中扮演著重要的角色(MoncreiffCA,SullivanMJ.Trophicimportanceofepiphyticalgaeinsubtropicalseagrassbeds:evidencefrommultiplestableisotopeanalyses.MarineEcology-ProgressSeries,2001，215:93-106)。[0003]在食物網(wǎng)研究中，穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)是用于追溯消費(fèi)者有機(jī)碳源及確定其營養(yǎng)級的有效工作。在底質(zhì)為泥質(zhì)或泥沙質(zhì)沉積物的沿岸淺水系統(tǒng)，卻很少人關(guān)注底棲微型藻類在食物網(wǎng)營養(yǎng)動態(tài)中的作用。這主要是由于泥質(zhì)或泥沙質(zhì)水質(zhì)渾濁，傳統(tǒng)的方法很難獲取純凈、無污染的底棲微型藻類樣品。有研究表明，在無植被覆蓋的沿岸淺水系統(tǒng)底棲微型藻類生物量和生產(chǎn)力高(MacIntyreHL,GeiderRJ,MillerDC.Microphytobenthos:theecologicalroleofthe“secretgarden^ofunvegetated,shallow-watermarinehabitats.1.Distribution,abundanceandprimaryproduction.Estuaries,2006,19:186-201)。許多研究也顯示，底棲微型藻類可能是消費(fèi)者重要的碳源，如棲息在沉積物中的多毛類，小型甲殼動物以及植食性螺和濾食性雙殼類等軟體動物(KangCK,KimJB,LeeKS,KimJB,LeePY,HongJS.TrophicimportanceofbenthicmicroalgaetomacrozoobenthosincoastalbaysystemsinKorea:dualstableCandNisotopeanalyses.MarineEcologyProgressSeries,2003,259:79-92;YokoyamaH,IshihiY.FeedingofthebivalveTheoralubricaonbenthicmicroalgae:1sotopicevidence.MarineEcologyProgressSeries,2003，255:303-309)。魚類胃含物的分析結(jié)果顯示，底棲微型藻類是鯔魚，羅非魚等雜食性魚類的重要食物來源(黃良敏，張雅芝，潘佳佳，等.廈門東海域魚類食物網(wǎng)研究.臺灣海峽，2008，27:64-73;LinHJ,KaoWY,WangYT.Analysesofstomachcontentsandstableisotopesrevealfoodsourcesofestuarinedetritivorousfishintropical/subtropicalTaiwan.Estuarine,CoastalandShelfScience,2007，73:527-537)。因此，在利用穩(wěn)定同位素技術(shù)研究沿岸系統(tǒng)的食物網(wǎng)動態(tài)時(shí)，底棲微型藻類的作用不容忽視，這對充分理解沿岸生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能具有重要的意義?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于穩(wěn)定同位素測定的沿岸水體泥質(zhì)或泥沙質(zhì)沉積物表層的底棲微型藻類樣品的提取方法。[0005]本發(fā)明包括以下步驟:[0006]I)采集沉積物，在沉積物表層鋪設(shè)第一層沙層，在第一層沙層表面覆上篩絹，篩絹上再鋪設(shè)第二層沙層，從上到下形成“第二層沙層-篩絹-第一層沙層-沉積物層”的四層結(jié)構(gòu)，在第二層沙層上噴灑過濾海水濕潤沙表面，蓋上透光外罩并放在有光的環(huán)境中；[0007]2)收集篩絹上的沙至海水中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮，待沙沉淀后，導(dǎo)出上層水液，經(jīng)篩絹過濾攔截可能的細(xì)沙顆粒，然后將濾液過濾至GF/F膜上，即得沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類，可用于碳、氮穩(wěn)定同位素的測定。[0008]在步驟I)中，所述沉積物的厚度可為I?2cm，沉積物的表面積最好在0.04m2以上，保證可以在環(huán)境較低的藻密度下提取足夠用于穩(wěn)定同位素分析的樣品；所述沉積物的表面最好完整，沒有被擾動和翻轉(zhuǎn)；[0009]所述第一層沙層的厚度最好是0.5mm,第一層沙層的沙顆粒粒徑最好是0.5?1mm，第一層沙層的沙可采用石英砂，所述沙最好預(yù)先在馬弗爐550°C灼燒4h以去除其中的有機(jī)質(zhì)，然后將灼燒過的沙子濾洗，烘干；[0010]所述篩絹的孔徑可為63μm;篩絹是用于阻止棲息沉積物中的底棲動物進(jìn)入沙層，但又能讓底棲微型藻類自由進(jìn)出沙層，由于底棲微型藻類個(gè)體小，粒徑大多在63μm以下，因此所述的篩絹篩絹孔徑最好是63μm左右的孔徑；[0011]所述第二層沙層的厚度可為0.5cm;[0012]所述過濾海水可取自采樣區(qū)域的海水且需經(jīng)過0.22μm的微孔濾膜過濾(無菌水)；[0013]所述透光外罩可米用玻璃外罩或亞克力外罩等；[0014]所述有光的環(huán)境可以是現(xiàn)場或?qū)嶒?yàn)室，但以現(xiàn)場為最佳，可以避免運(yùn)輸過程中可能的污染和干擾。[0015]在步驟2)中，所述海水可采用經(jīng)0.22μm濾膜過濾的海水；所述篩絹可采用孔徑為63μm的篩絹；所述GF/F膜可采用預(yù)先在馬弗爐550°C灼燒過的GF/F膜，GF/F膜可采用玻璃纖維膜等，GF/F膜最好經(jīng)酸化、水洗去酸和烘干。[0016]所述收集篩絹上的沙的容器最好是玻璃容器，且經(jīng)過酸泡、用超純水洗凈、烘干；所述攪拌用的棒最好是玻璃棒，且經(jīng)過酸泡、用超純水洗凈、烘干。[0017]本發(fā)明的意義在于獲取一種提取泥、泥沙質(zhì)沉積物表層底棲微型藻類的分離技術(shù)，通過該方法獲得比較純凈，少有機(jī)碎屑干擾的底棲微型藻類樣品用于碳、氮穩(wěn)定同位素測定。[0018]本發(fā)明旨在獲得可以用于碳、氮穩(wěn)定同位素測定的底棲微型藻類樣品。本發(fā)明的原理是利用底棲微型藻類大多是具有一定運(yùn)動能力的羽紋硅藻和具鞭毛的甲藻等藻類，可在沉積物表面上下移動。本發(fā)明是根據(jù)底棲微型藻類的趨光特性而設(shè)計(jì)的提取方法。本發(fā)明簡單有效，提取的底棲微型藻類純度較高，有機(jī)碎屑少。通過本發(fā)明獲得的底棲微型藻類還可以進(jìn)一步用于單個(gè)藻種的純化培養(yǎng)。【專利附圖】【附圖說明】[0019]圖1為鋪設(shè)沙層后整個(gè)技術(shù)框架的示意圖。[0020]圖2為利用該方法獲取的底棲微型藻類?！揪唧w實(shí)施方式】[0021]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。[0022]用箱氏采樣器采集沉積物，用鏟子采集表層Icm的沉積物I于搪瓷盆2中。沉積物表層鋪灑0.2?0.5cm厚的第一沙層4，細(xì)沙的粒徑在0.5?1mm，且須預(yù)先在馬弗爐550°C灼燒，水洗和烘干。第一沙層4表面覆上孔徑為63μm的篩絹5。篩絹5上再鋪設(shè)0.5cm厚的第二沙層6，從上到下形成“沙-篩絹-沙-沉積物”的四層結(jié)構(gòu)(參見圖1)。在第二沙層6表面噴灑過濾海水濕潤沙表面。在搪瓷盆2上蓋上一個(gè)方形的亞克力外框3。[0023]5h后，收集篩絹上的沙至過濾海水(0.22μm)中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮。約Imin后，導(dǎo)出上層水液，經(jīng)63μm的篩絹過濾去除細(xì)沙后，將濾液過濾至經(jīng)預(yù)先在馬弗爐550°C灼燒過的GF/F膜上，所得的樣品即為底棲微型藻類。將取0.5μI過濾液在顯微鏡下檢查，所得的底棲微型藻類為羽紋硅藻(參見圖2)。[0024]實(shí)施例1:表層沉積物葉綠素a含量的測定[0025]在某潟湖的內(nèi)湖(NI?N5)、外湖(Wl?W4)設(shè)置站位，用重力式沉積物采樣器(參見中國專利CN201335783Y)采集沉積物樣品。用切去針頭端的50ml針筒采集采樣管中的樣品，在保溫箱中避光保存。帶回實(shí)驗(yàn)室后，利用洗凈的竹片分層，每層1cm，共將沉積物分成3層。葉綠素a的濃度采用熒光法測量。在裝有樣品的IOml離心管內(nèi)加90%丙酮研磨，經(jīng)超聲、萃取、冷凍離心、定容，在HitachiF2500型熒光光度計(jì)上測定，整個(gè)過程盡量避光。計(jì)算公式為:葉綠素a濃度(μg/g)=FdX(Rb-Ra)Xr/(r-1)Xv/M。其中為萃取液定容體積(ml);M為樣品質(zhì)量(g);&和Ra為樣品酸化前后的熒光值；Fd和r分別為由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得到的換算因子和純?nèi)~綠素a的酸化比。結(jié)果表明(參見表I)，沉積物葉綠素a的含量基本隨著沉積物深度的增加逐漸降低，表層Icm的沉積物平均葉綠素a含量最高(4.03μg/g),遠(yuǎn)高于I?2cm和2?3cm的沉積物的葉綠素a含量(1.47μg/g和0.87μg/g)。因此，在采集表層沉積物分離底棲微型藻類時(shí)，采集的表層沉積物的厚度至少Icm以上，最好在I?2cm左右。[0026]表I沉積物葉綠素a含量[0027]【權(quán)利要求】1.沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于包括以下步驟:1)采集沉積物，在沉積物表層鋪設(shè)第一層沙層，在第一層沙層表面覆上篩絹，篩絹上再鋪設(shè)第二層沙層，從上到下形成“第二層沙層-篩絹-第一層沙層-沉積物層”的四層結(jié)構(gòu)，在第二層沙層上噴灑過濾海水濕潤沙表面，蓋上透光外罩并放在有光的環(huán)境中；2)收集篩絹上的沙至海水中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮，待沙沉淀后，導(dǎo)出上層水液，經(jīng)篩絹過濾攔截可能的細(xì)沙顆粒，然后將濾液過濾至GF/F膜上，即得沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類，可用于碳、氮穩(wěn)定同位素的測定。2.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述沉積物的厚度為I?2cm，沉積物的表面積在0.04m2以上。3.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述第一層沙層的厚度為0.5mm，第一層沙層的沙顆粒粒徑最好是0.5?1mm，第一層沙層的沙可采用石英砂，所述沙最好預(yù)先在馬弗爐550°C灼燒4h以去除其中的有機(jī)質(zhì)，然后將灼燒過的沙子濾洗，烘干。4.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)和2)中，所述篩絹的孔徑為63μm。5.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述第二層沙層的厚度為0.5cm。6.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述過濾海水取自采樣區(qū)域的海水且需經(jīng)過0.22μm的微孔濾膜過濾。7.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述透光外罩米用玻璃外罩或亞克力外罩。8.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述海水采用經(jīng)0.22μm濾膜過濾的海水。9.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述GF/F膜采用預(yù)先在馬弗爐550°C灼燒過的GF/F膜，GF/F膜可采用玻璃纖維膜，GF/F膜最好經(jīng)酸化、水洗去酸和烘干。10.如權(quán)利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述收集篩絹上的沙的容器是玻璃容器，且經(jīng)過酸泡、用超純水洗凈、烘干；所述攪拌用的棒最好是玻璃棒，且經(jīng)過酸泡、用超純水洗凈、烘干?！疚臋n編號】G01N1/34GK103884537SQ201410136307【公開日】2014年6月25日申請日期:2014年4月4日優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日【發(fā)明者】鄭新慶,藍(lán)文陸,林榮澄申請人:國家海洋局第三海洋研究所