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基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及電化學(xué)免疫【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法。包括以下步驟：以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍(lán)微粒子標(biāo)記待測物的類似物作為標(biāo)記抗原；將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應(yīng)液中；形成競爭性免疫反應(yīng)、電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量。該檢測方法采用普魯士藍(lán)代替生物酶分子標(biāo)記小分子抗原，并結(jié)合磁性微粒進(jìn)行競爭性免疫反應(yīng)，通過電化學(xué)檢測標(biāo)記抗原對于過氧化氫和對苯二酚的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號，由于其電信號大小與待測小分子濃度呈線性相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)對小分子化合物的高靈敏度定量檢測。
【專利說明】基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學(xué)免疫【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在目前的生物醫(yī)藥檢測領(lǐng)域，對于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測已成為廣大研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。為了實(shí)現(xiàn)微量或痕量的小分子化合物的高靈敏度檢測，各種基于生物特異性反應(yīng)，如抗原抗體技術(shù)、蛋白配體技術(shù)等不同的方法和體系已經(jīng)被建立。其中，具有典型性的是競爭性免疫檢測技術(shù)，其利用標(biāo)記抗原和待測分析物對抗體的競爭，通過檢測被抗體吸附的標(biāo)記抗原可以推斷出體系中含有的待測分析物的濃度。但常用的標(biāo)記技術(shù)有放射性標(biāo)記、辣根過氧化物酶(HRP)等酶標(biāo)記，以及熒光化學(xué)探針等光學(xué)標(biāo)記。
[0003]電化學(xué)免疫分析技術(shù)是將免疫分析技術(shù)與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合的一種免疫分析方法，通過將一些易于測定并具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到抗原或抗體分子上，并結(jié)合抗原與抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記物的產(chǎn)生或放大的電信號，可以實(shí)現(xiàn)對于待測物質(zhì)的高靈敏度特異性檢測。電化學(xué)免疫標(biāo)記的物質(zhì)一般是生物酶類，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶等，但這些酶類對于溫度、溶劑等外界條件要求嚴(yán)格，難以制備且價(jià)格昂貴。
[0004]普魯士藍(lán)微粒具有類似過氧化物酶的催化能力，可以催化過氧化氫的分解，通過電化學(xué)工作站檢測其分解的過氧化氫對還原性物質(zhì)對苯二酚氧化產(chǎn)生的電流。通過靜電作用，可以將普魯士藍(lán)標(biāo)記在帶氨基的殼聚糖等分子的表面，再通過化學(xué)偶聯(lián)方法將待測小分子與帶普魯士藍(lán)標(biāo)記的殼聚糖分子偶聯(lián)，可以制得普魯士藍(lán)標(biāo)記的小分子標(biāo)記抗原。
[0005]磁性納米粒子具有比表面積大、易富集等特點(diǎn)，經(jīng)修飾后可以在其表面標(biāo)記抗體，制得磁性抗體。通過分散在反應(yīng)體系中和外加磁場的作用，可以快速富集分離與抗體特異性識別的小分子化合物。因此，建立基于仿生材料標(biāo)記結(jié)合磁性微粒競爭性免疫反應(yīng)及電化學(xué)技術(shù)的小分子化合物檢測體系，對于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了 一種基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法檢測方法，以實(shí)現(xiàn)對于環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的高靈敏度定量免疫檢測的目的。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008]a)以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍(lán)微粒子標(biāo)記待測物的類似物作為標(biāo)記抗原；[0009]b)將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應(yīng)液中；
[0010]C)在反應(yīng)液中加入步驟a中制得的標(biāo)記抗原和待測物后，標(biāo)記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應(yīng)；
[0011]d)通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取上清，在其中加入含有對苯二酚和過氧化氫的溶液，通過差分脈沖伏安法，電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量。
[0012]可選的，所述小分子化合物是指分子量在1000以下，且不能直接產(chǎn)生免疫原性的有機(jī)化合物分子。
[0013]可選的，所述四氧化三鐵微粒和普魯士藍(lán)微粒子的尺寸是μ m級或nm級的。
[0014]可選的，所述具有類過氧化氫酶催化活性的材料為普魯士藍(lán)。
[0015]可選的，所述的待測物是有機(jī)小分子化合物。
[0016]可選的，在所述電化學(xué)檢的步驟中，電化學(xué)電極為玻碳電極及其經(jīng)修飾后的電極。
[0017]可選的，所述普魯士藍(lán)微粒子通過化學(xué)方法固定待測物小分子的類似物，形成標(biāo)記抗原。
[0018]可選的，所述競爭性免疫反應(yīng)在磷酸緩沖液中發(fā)生。
[0019]可選的，所述競爭性免疫反應(yīng)通過借助磁性微粒以及外加磁場的作用形成。
[0020]可選的，在步驟d)中，所述電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量，具體包括:
[0021]通過檢測上清中殘留的標(biāo)記抗原對于含有過氧化氫和對苯二酚的溶液的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號，實(shí)現(xiàn)對于待測小分子的定量電化學(xué)檢測。
[0022]該檢測方法采用普魯士藍(lán)代替生物酶分子標(biāo)記小分子抗原，并結(jié)合磁性微粒進(jìn)行競爭性免疫反應(yīng)，通過電化學(xué)檢測標(biāo)記抗原對于過氧化氫和對苯二酚的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號，由于其電信號大小與待測小分子濃度呈線性相關(guān)，可實(shí)現(xiàn)對小分子化合物的高靈敏度定量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的方法中，普魯士藍(lán)催化免疫電化學(xué)差分脈沖伏安圖；
[0024]圖2利用本發(fā)明實(shí)施例的方法所測的濃度與電流的線性關(guān)系圖；
[0025]圖3利用本發(fā)明實(shí)施例的方法所測的濃度的對數(shù)與電流的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明提出了一種利用普魯士藍(lán)催化活性作為抗原標(biāo)記的競爭免疫反應(yīng)電化學(xué)檢測方法。本方法首先借助帶多個(gè)氨基的殼聚糖，將普魯士藍(lán)粒子標(biāo)記于待測小分子化合物的類似物上構(gòu)成標(biāo)記抗原。通過將抗體與磁性納米粒子偶聯(lián)，借助標(biāo)記抗原與待測目標(biāo)物對磁性抗體的競爭以及外加磁場對于磁性抗體結(jié)合目標(biāo)物和標(biāo)記抗原后的分離，構(gòu)建了競爭免疫反應(yīng)體系。然后通過電化學(xué)檢測上清液中剩余的標(biāo)記抗原對過氧化氫的催化分解及其對對苯二酚的氧化電流，建立了小分子化合物高靈敏度的檢測體系。
[0027]另外，需要指出的是，在本發(fā)明的所有實(shí)施例中，優(yōu)選的，可以具備以下一個(gè)或者多個(gè)限定條件；可選的，所述小分子化合物是指分子量在1000以下，且不能直接產(chǎn)生免疫原性的有機(jī)化合物分子?？蛇x的，所述四氧化三鐵微粒和普魯士藍(lán)微粒子的尺寸是μπι級或nm級的。可選的，所述具有類過氧化氫酶催化活性的材料為普魯士藍(lán)?？蛇x的，所述的待測物是有機(jī)小分子化合物?？蛇x的，在所述電化學(xué)檢的步驟中，電化學(xué)電極為玻碳電極及其經(jīng)修飾后的電極。可選的，所述普魯士藍(lán)微粒子通過化學(xué)方法固定待測物小分子的類似物，形成標(biāo)記抗原?？蛇x的，所述競爭性免疫反應(yīng)在磷酸緩沖液中發(fā)生?？蛇x的，所述競爭性免疫反應(yīng)通過借助磁性微粒以及外加磁場的作用形成?？蛇x的，在步驟d)中，所述電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量，具體包括:通過檢測上清中殘留的標(biāo)記抗原對于含有過氧化氫和對苯二酚的溶液的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號，實(shí)現(xiàn)對于待測小分子的定量電化學(xué)檢測。
[0028]實(shí)施例一
[0029]本實(shí)施例提供的檢測方法包括以下步驟:
[0030]1、普魯士藍(lán)標(biāo)記分子抗原的制備:
[0031]將帶有氨基或羧基等活性基團(tuán)的小分子化合物通過酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))、重氮化法、戊二醛法等偶聯(lián)到殼聚糖分子上，通過調(diào)節(jié)PH值，使標(biāo)記了小分子化合物的殼聚糖帶正電，然后在其分散液中加入硫酸亞鐵和鐵氰化鉀，其表面合成帶負(fù)電的普魯士藍(lán)，通過靜電作用實(shí)現(xiàn)普魯士藍(lán)對小分子抗原的標(biāo)記。
[0032]2、磁性抗體的制備:
[0033]將氯化亞鐵和三氯化鐵比例1: 2，分別加入水中溶解加熱至70°C，加入氯化亞鐵摩爾數(shù)8倍的氫氧化鈉溶液，迅速混合，可見生成棕黑色的磁性納米粒子，然后緩慢滴加與氯化亞鐵等摩爾數(shù)的油酸，熟化20min后加入高錳酸鉀溶液，氧化24h，使磁性納米粒子表面的油酸被氧化成羧基，用超純水洗滌數(shù)次，獲得帶有羧基的磁性納米粒子。將帶羧基的磁性納米粒子分散在磷酸鹽緩沖液中，并加入一定量的抗體，通過酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))與抗體偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應(yīng)的羧基，洗滌一次，即獲得磁性抗體。
[0034]3、電化學(xué)檢測方法:
[0035]該方法為基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，具體包括以下步驟:
[0036]步驟1:以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍(lán)微粒子標(biāo)記待測物的類似物作為標(biāo)記抗原:
[0037]具體的，稱取一定量修飾有氨基的半抗原溶于含有甲醇的ddH20構(gòu)成I液；稱取一定量脫乙酰度為90%的殼聚糖溶于PH值6.5的磷酸鹽緩沖液中，構(gòu)成II液；量取100 μ 125%的戊二醛，加蒸餾水稀釋至5ml，構(gòu)成III液。在室溫?cái)嚢柘?，將I液和III液逐滴加入II液中攪拌，8h后裝入透析袋，用蒸餾水透析3d，每天更換2到3次透析液至透析完全，即獲得偶聯(lián)殼聚糖的抗原(Ag-CS)。在其中加入lmllmol/1氯化亞鐵和2%。的鹽酸，再加入lmol/1鐵氰化鉀即可見藍(lán)色的普魯士藍(lán)粒子的形成，冷凍干燥，即可獲得標(biāo)記了普魯士藍(lán)的殼聚糖待測物分子標(biāo)記抗原(PB/CS/Ag)。
[0038]步驟2:合成帶羧基的磁性納米粒子，將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應(yīng)液中:將8.1g FeCl3.6H20在142.5mL去離子水中溶解后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70°C。稱取4.4gFeCl2.4Η20溶于IOmL去離子水，過濾，取7.5mL加入到三口燒瓶中。在劇烈攪拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，Imin后逐滴加入4.66g油酸，于70°C下繼續(xù)快速攪拌20min。反應(yīng)結(jié)束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場將所得的沉淀從反應(yīng)體系中分離出來。
[0039]用乙醇洗滌2次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH = 7。然后加入160mL濃度為10mg/mL的KMnO4溶液，在超聲波清洗儀中超聲振蕩24h，磁分離后用去離子水洗滌3次，得到磁流體?；蛘咴谙礈旌笳婵绽鋬龈稍?0h，得到表面修飾有羧基的磁性納米粒子。將25mg帶羧基的磁性納米粒子分散在ImL PH = 6.5的PBS磷酸鹽緩沖液中，在其中分別加入25mgEDC和NHS，在37°C中活化30min，并加入一定量的抗體，通過酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))與抗體偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應(yīng)的羧基，洗滌一次，即獲得磁性抗體。
[0040]步驟3:在反應(yīng)液中加入步驟I中制得的標(biāo)記抗原和待測物后,標(biāo)記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應(yīng):將100 μ L含有25mg磁性四氧化三鐵微粒固定抗體分散在5mL反應(yīng)液中，在反應(yīng)液中加入100 μ L步驟a中制得的標(biāo)記抗原和一組不同濃度待測物(磺胺二甲基嘧啶)后，在37°C下孵育lh，標(biāo)記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應(yīng)。
[0041]步驟4:通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取4mL上清，加入ImL含有77mg對苯二酚和11 μ L30%過氧化氫的溶液中，以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極通，在-0.6?2.0V間，通過差分脈沖伏安法(DPV法)電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量(請參考圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20ng/mL?10μ g/mL之間，電流信號大小與待測目標(biāo)物濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系O
[0042]本發(fā)明方法在實(shí)施過程中使用的試劑包括以下幾種成分:
[0043]抗體和抗原分子:抗體一般是指可特異識別環(huán)境污染物、農(nóng)藥、激素、抗生素等小分子的抗體。殼聚糖，脫乙酰度70%?90%的殼聚糖含有大量氨基，磁性納米粒子(表面帶有羧基)，普魯士藍(lán)粒子，玻碳電極，鉬片電極，飽和甘汞電極，普魯士藍(lán)，待測物抗原分子及其類似物，過氧化氫，對苯二酚，亞硝酸鈉，戊二醛，高錳酸鉀，六水合氯化鐵，四水合氯化亞鐵。
[0044]使用的裝置包括:水浴鍋、電化學(xué)工作站、超純水制水機(jī)。
[0045]以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，采用差分脈沖伏安法，電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量。
[0046]具體的，以普魯士藍(lán)為標(biāo)記催化材料，以四氧化三鐵納米粒子為磁性微粒，以磺胺類抗體為檢測抗體，磺胺二甲基嘧啶為待測分析物，磺胺對二甲氧基嘧啶為待測分析物的類似物為例，說明本方法的具體實(shí)施流程。
[0047]1、普魯士藍(lán)標(biāo)記的待測分析物、類似物作為標(biāo)記抗原的合成方法:
[0048]稱取28mg磺胺對二甲氧基嘧啶溶于含有50 μ I甲醇的Iml ddH20構(gòu)成I液；稱取20mg脫乙酰度為90%的殼聚糖溶于0.35ml PH值6.5的磷酸鹽緩沖液中，構(gòu)成II液；量取100 μ 125%的戊二醛，加蒸餾水稀釋至5ml，構(gòu)成III液。在室溫?cái)嚢柘?，將I液和III液逐滴加入II液中攪拌，8h后裝入透析袋，用蒸餾水透析3d，每天更換2到3次透析液至透析完全，即獲得偶聯(lián)殼聚糖的磺胺二甲基嘧啶(SD-CS)。在其中加入lmllmol/1氯化亞鐵和2%。的鹽酸，再加入lmol/1鐵氰化鉀即可見藍(lán)色的普魯士藍(lán)粒子的形成，冷凍干燥，即可獲得標(biāo)記了普魯士藍(lán)的殼聚糖待測物分子標(biāo)記抗原(PB/CS/SD)。
[0049]2、四氧化三鐵磁性抗體的合成:
[0050]將8.1g FeCl3.6H20在142.5mL去離子水中溶解后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，攪拌加熱至70°C。稱取4.4gFeCl2*4H20溶于IOmL去離子水，過濾，取7.5mL加入到三口燒瓶中。在劇烈攪拌下，快速加入24mL20%的NaOH溶液，Imin后逐滴加入4.66g油酸，于70°C下繼續(xù)快速攪拌20min。反應(yīng)結(jié)束后，得到黑色溶膠狀物質(zhì)，利用外加磁場將所得的沉淀從反應(yīng)體系中分離出來。用乙醇洗滌2次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH = 7。然后加入160mL濃度為10mg/mL的KMnO4溶液，在超聲波清洗儀中超聲振蕩24h，磁分離后用去離子水洗滌3次，得到磁流體?；蛘咴谙礈旌笳婵绽鋬龈稍?0h，得到表面修飾有羧基的磁性納米粒子。將25mg帶羧基的磁性納米粒子分散在ImL PH = 6.5的PBS磷酸鹽緩沖液中，在其中分別加入25mgEDC和NHS，在37°C中活化30min，并加入一定量的抗體，通過酰胺化反應(yīng)(EDC/NHS反應(yīng))與抗體偶聯(lián)2h。之后，與1%的脫脂乳粉在37°C下孵育lh，封閉掉未反應(yīng)的羧基，洗滌一次，即獲得磁性抗體。
[0051]3、競爭免 疫反應(yīng)的進(jìn)行和電化學(xué)檢測:
[0052]將100 μ L含有25mg磁性四氧化三鐵微粒固定抗體分散在5mL反應(yīng)液中，在反應(yīng)液中加入100 μ L的標(biāo)記抗原和一組不同濃度待測物(磺胺二甲基嘧啶)后，在37°C下孵育lh，標(biāo)記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應(yīng)。通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取4mL上清，加入ImL含有77mg對苯二酚和11μL30%過氧化氫的溶液中.以玻碳電極為工作電極，鉬片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，在-0.6~2.0V間，通過差分脈沖伏安法(DPV法)電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量(請參考圖2和圖3，其中，在圖2中，橫坐標(biāo)為電流，縱坐標(biāo)為濃度；在圖3中，橫坐標(biāo)為電流，縱坐標(biāo)的濃度的對數(shù))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20ng/mL~10yg/mL之間，電流信號大小與待測目標(biāo)物濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
[0053]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)以一種具有類過氧化氫酶催化活性的普魯士藍(lán)微粒子標(biāo)記待測物的類似物作為標(biāo)記抗原； b)將磁性四氧化三鐵微粒固定抗體，并將其分散在反應(yīng)液中； c)在反應(yīng)液中加入步驟a中制得的標(biāo)記抗原和待測物后，標(biāo)記抗原與待測物競爭抗體，形成競爭性免疫反應(yīng)； d)通過磁鐵分離，將磁性抗體及其吸附的抗原分離至試管底部，吸取上清，在其中加入含有對苯二酚和過氧化氫的溶液，通過差分脈沖伏安法，電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量。
2.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于: 所述小分子化合物是指分子量在1000以下，且不能直接產(chǎn)生免疫原性的有機(jī)化合物分子。
3.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于: 所述四氧化三鐵微粒和普魯士藍(lán)微粒子的尺寸是μ m級或nm級的。
4.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述具有類過氧化氫酶催化活性的材料為普魯士藍(lán)。
5.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述的待測物是有機(jī)小分子化合物。
6.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:在所述電化學(xué)檢的步驟中，電化學(xué)電極為玻碳電極及其經(jīng)修飾后的電極。
7.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述普魯士藍(lán)微粒子通過化學(xué)方法固定待測物小分子的類似物，形成標(biāo)記抗原。
8.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述競爭性免疫反應(yīng)在磷酸緩沖液中發(fā)生。
9.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:所述競爭性免疫反應(yīng)通過借助磁性微粒以及外加磁場的作用形成。
10.如權(quán)利要求1所述的基于普魯士藍(lán)仿生標(biāo)記檢測小分子化合物的方法，其特征在于:在步驟d)中，所述電化學(xué)檢測體系中的氧化電流信號進(jìn)而對待測物實(shí)現(xiàn)定量測量，具體包括: 通過檢測上清中殘留的標(biāo)記抗原對于含有過氧化氫和對苯二酚的溶液的催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生的電信號，實(shí)現(xiàn)對于待測小分子的定量電化學(xué)檢測。
【文檔編號】G01N33/53GK103995103SQ201410258017
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王靜, 王淼, 佘永新, 李騰飛, 劉廣洋, 杜欣蔚, 于海龍, 金芬, 邵華, 金茂俊, 王珊珊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所