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用于早期糖尿病診斷的多肽標(biāo)志物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了用于早期糖尿病診斷的多肽標(biāo)志物，首先選擇人外周血高豐度蛋白HSA建立體外模擬糖基化模型，優(yōu)化條件下酶切，將酶切后的空白對(duì)照組樣品進(jìn)行18O標(biāo)記，與采用16O平行處理的反應(yīng)組樣品1:1(v/v)混合，進(jìn)行HPLC/ESI-TOF?MS檢測。通過對(duì)HSA肽段的定量分析，找到最不易被葡萄糖修飾的肽段如SEQ?ID?NO.1所示，作為內(nèi)標(biāo)肽段，將易發(fā)生糖基化修飾的肽段與內(nèi)標(biāo)肽段峰面積之比用以衡量葡萄糖敏感肽的糖基化修飾程度，通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法最終發(fā)現(xiàn)3條肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可作為生物標(biāo)志物用于糖尿病的早期診斷?！緦＠f明】用于早期糖尿病診斷的多肽標(biāo)志物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，具體地，涉及用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物及其應(yīng)用。【
背景技術(shù)：
】[0002]糖尿病是一組以慢性血葡萄糖(簡稱血糖)水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起。目前，醫(yī)學(xué)上將空腹血糖和糖化血紅蛋白水平作為臨床診斷糖尿病的直接標(biāo)準(zhǔn)。但對(duì)于糖尿病前期的人群來講，血糖水平并不會(huì)明顯率先表現(xiàn)出居高不下的狀態(tài)，而是由于肌體對(duì)血糖水平調(diào)節(jié)能力的下降，表現(xiàn)為血糖水平的忽高忽低。糖化血紅蛋白的測定則通常反映人相對(duì)長期(8-12周)的血糖狀況。通常情況下一旦空腹血糖和糖化血紅蛋白的水平達(dá)到了病理值，則“患有糖尿病”的結(jié)論不太可能出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。雖然胰島素及其它藥物在很大程度上使糖尿病及其并發(fā)癥得到了有效的控制，但目前糖尿病尚不能完全治愈，因此早期診斷對(duì)于糖尿病的治療起著至關(guān)重要的作用。[0003]目前，醫(yī)學(xué)上將空腹血糖和糖化血紅蛋白的水平定義為臨床診斷糖尿病的直接標(biāo)準(zhǔn)。空腹血糖大于等于7.0mmol/L或者糖化血紅蛋白水平大于等于6.5%即可診斷為糖尿病。盡管這一標(biāo)準(zhǔn)是現(xiàn)行權(quán)威的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但由于性別、年齡，家族病史等不同個(gè)體差異的影響，單次空腹糖或糖化血紅蛋白水平偏高并不能百分之百的準(zhǔn)確預(yù)測所有的糖尿病病例，尤其在該疾病的早期階段。在這種情況下，其它生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和研究應(yīng)用于糖尿病的早期診斷越來越受到人們的重視。生物標(biāo)志物可用于監(jiān)測一個(gè)生理或者病理的過程，也可以用于跟蹤一個(gè)藥理反應(yīng)，一個(gè)理想的生物標(biāo)志物能夠鑒定疾病發(fā)展的程度、也可有效提高疾病預(yù)警的準(zhǔn)確性，還可指導(dǎo)疾病的治療，甚至可以幫助研究人員洞悉疾病的發(fā)病機(jī)制。[0004]人的血漿蛋白來源于各種組織或細(xì)胞的分泌或者泄漏，已有研究表明血漿蛋白的動(dòng)態(tài)變化反映了人的生理或病理狀態(tài)的變化，因此血漿蛋白質(zhì)組的變化能很好地指示機(jī)體生理或病理狀況。血漿蛋白執(zhí)行著人體的許多生物功能，在人類健康與疾病中有著重要的意義，人類的很多疾病都會(huì)引起血漿中蛋白質(zhì)性質(zhì)和含量的改變。由于血漿取材容易，且血漿中蛋白具有許多重要的生理功能，血清中某種蛋白濃度的變化往往預(yù)示某些疾病的發(fā)生。因此，監(jiān)測血清蛋白濃度對(duì)于疾病的早期診斷、病因的闡明及藥物療效的監(jiān)測方面都具有重要的意義。早期發(fā)現(xiàn)的某種蛋白在表達(dá)數(shù)量、水平及修飾狀態(tài)上出現(xiàn)的差異，很有可能作為疾病診斷的重要生物標(biāo)志物。[0005]在蛋白質(zhì)組學(xué)中，最常用的鑒定蛋白的方法之一是基于二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE)技術(shù)和質(zhì)譜聯(lián)用，通常在一塊膠上可以使幾千個(gè)蛋白得到分離，由于其第一維是等電聚焦，采用PH梯度根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同使之分離，第二維是聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行分離，故可直接反映不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的信息，而且也能反映蛋白質(zhì)異構(gòu)體和翻譯后修飾等變化。由于2DE是在蛋白水平上進(jìn)行定量，該技術(shù)存在自身難以克服的缺陷，故人們轉(zhuǎn)向在肽段水平上進(jìn)行定性和定量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白的定量?；谫|(zhì)譜技術(shù)的定量方法大體上可以分為兩種，一種是無標(biāo)記定量技術(shù)，另外一種是同位素標(biāo)記定量技術(shù)?；谕凰貥?biāo)記定量技術(shù)主要包括體內(nèi)代謝標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記兩種。體內(nèi)代謝標(biāo)記指生物體的外界培養(yǎng)環(huán)境中某一種元素或者氨基酸被某一同位素所取代，這樣在生物體生長的過程中，同位素逐漸取代自身的天然元素或氨基酸，在蛋白水平或肽段水平上形成質(zhì)量差。代謝標(biāo)記主要包括細(xì)菌或細(xì)胞的15N標(biāo)記法和細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記法(StableIsotopeLabelingbyAminoacidsinCellculture,SILAC)。[0006]目前絕大多數(shù)生物標(biāo)志物均處于蛋白水平，常見的檢測手段為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)0酶具有較高的催化效率，因此ELISA法具有較高的靈敏度，但該方法需要預(yù)先知道生物標(biāo)志物及其相應(yīng)的特異性抗體，在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的挑戰(zhàn)。鑒于此，近年來以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法越來越多被應(yīng)用與生物標(biāo)志物的尋找。然而，與蛋白類生物標(biāo)志物相比，肽類生物標(biāo)志物可能更便于采用質(zhì)譜進(jìn)行檢測，其原因在于，蛋白在體內(nèi)可能經(jīng)歷多種翻譯后修飾，如:磷酸化、糖基化、乙酰化等等。每一種翻譯后修飾都可能改變蛋白的分子質(zhì)量，從而導(dǎo)致質(zhì)譜這一基于對(duì)分子量進(jìn)行測定的儀器在檢測上的困難。相反，若采用多肽作為生物標(biāo)志物則不存在這個(gè)問題。[0007]近年來，糖尿病及其并發(fā)癥的生物標(biāo)志物逐漸成為研究的熱點(diǎn)之一，目前已經(jīng)有許多糖尿病生物標(biāo)志物被廣泛報(bào)道，例如C反應(yīng)蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯等。這些生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和檢測為早期糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)現(xiàn)和治療提供了有利依據(jù)。但在一般情況下，分析過程中的需要添加內(nèi)標(biāo)物使得待測物質(zhì)得以準(zhǔn)確定量。但是內(nèi)標(biāo)物的尋找也常常成為分析方法的難點(diǎn)之一，主要因?yàn)閷?duì)內(nèi)標(biāo)的選擇有諸多要求，如:內(nèi)標(biāo)物添加至樣品中能完全溶解、不與待測組分發(fā)生反應(yīng)，且內(nèi)標(biāo)物與待測組分在色譜保留時(shí)間上應(yīng)盡可能接近。若能解決內(nèi)標(biāo)肽段溶解性差且容易與其他肽段存在相互反應(yīng)的問題，對(duì)于下一步篩選葡萄糖敏感肽段的糖尿病多肽標(biāo)志物，用于糖尿病的早期診斷具有重要意義?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種人外周血蛋白HAS中對(duì)葡糖糖不敏感的內(nèi)標(biāo)肽段。[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供用于糖尿病早期診斷的多肽標(biāo)志物。[0010]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種基于質(zhì)譜技術(shù)的早期糖尿病診斷試劑盒。[0011]本發(fā)明提供的用于檢測早期糖尿病的內(nèi)標(biāo)多肽，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.1所述的氨基酸序列，m/z=977.4。[0012]本發(fā)明提供了上述內(nèi)標(biāo)多肽在制備早期糖尿病診斷試劑盒中的應(yīng)用。[0013]本發(fā)明提供了一種篩選上述內(nèi)標(biāo)多肽的方法，包括以下步驟:[0014](I)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照；[0015]所述HSA的生理濃度為40mM/mL。[0016](2)胰酶消化，將蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經(jīng)糖基化的HSA與空白對(duì)照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT(二硫蘇糖醇)溶液進(jìn)行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封閉氨基酸側(cè)鏈的活潑基團(tuán)，于黑暗處反應(yīng)lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質(zhì)量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;[0017](3)180標(biāo)記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；向未經(jīng)修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=I~125:l，w/w)，在37°C水浴中標(biāo)記8~24小時(shí)；[0018](4)對(duì)樣品分別進(jìn)行HPLC/ES1-TOFMS定量分析和HPLC/ES1-1onTrapMS定性分析；[0019](5)數(shù)據(jù)分析與內(nèi)標(biāo)肽段的選擇，Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數(shù)據(jù)特征，提取參數(shù):保留時(shí)間8.00-45.0Omin;質(zhì)荷比m/Z300-1800;信噪比閾值S/N5;譜峰數(shù)目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應(yīng)肽段的160/180峰對(duì)，并計(jì)算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經(jīng)修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點(diǎn)，經(jīng)過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經(jīng)過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對(duì)葡萄糖敏感的糖基化位點(diǎn)；在TOFMS數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)I個(gè)葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次質(zhì)譜檢測中穩(wěn)定地被檢測到，質(zhì)譜信號(hào)達(dá)到105，肽段的160/180峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內(nèi)標(biāo)肽段。[0020]優(yōu)選地，步驟(2)中，HSA:胰蛋白酶的質(zhì)量比=50:1，于37°C水浴孵育20h。[0021]優(yōu)選地，步驟(3)中，肽段樣品溶于50mMpH6.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；HSA:胰蛋白酶=50:1，在37°C水浴中標(biāo)記20小時(shí)[0022]進(jìn)一步地，步驟(3)還包括在標(biāo)記完成后，殘余的胰蛋白酶需經(jīng)滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再按照體積比加入5%的甲酸。[0023]更進(jìn)一步地，步驟(3)中標(biāo)記體系尿素濃度控制在2M以下。[0024]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(4)中樣品定量分析采用AgilentllOO系列高效液相色譜儀串聯(lián)ES1-TOF(Agilent6210)進(jìn)行。[0025]優(yōu)選地，在HPLC/ES1-TOFMS分析之前，樣品需經(jīng)過離心處理，離心條件為17，OOOXgj15min。[0026]其中，步驟(4)所述的HPLC/ES1-TOFMS定量分析的液相色譜條件為:色譜柱為GraceC18柱,300人，2.1mmX150mm;流速0.2mL/min;進(jìn)樣量10μg;所用流動(dòng)相為:A相為含0.1%甲酸的水溶液；B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件為:3%B，O—8min;3-40%B,8—35min;40-95%B,35—40min;95%B,40—43min以及95_3%Bfrom43—45min;Postrun為IOmin；ES1-TOFMS條件為:以氮?dú)庾鳛楦稍餁夂挽F化氣，干燥氣流速10L/min;干燥氣溫度為350°C;霧化器壓力為35psi;采用正離子模式；毛細(xì)管電壓為-3.5kV;毛細(xì)管出口電壓160V;錐孔電壓60V；MS掃描范圍為m/z300-1800；[0027]另外，步驟(4)中，對(duì)于樣品的定性分析，采用HPLC/ES1-1onTrapMS方法分析，樣品定性分析的液相色譜條件和質(zhì)譜ESI離子源條件與上述HPLC/ES1-TOF分析的條件相同；MS掃描范圍為m/z300-1800;最大累積時(shí)間100ms，MS譜圖平均2次；目標(biāo)質(zhì)量數(shù)900，化合物穩(wěn)定性100%，阱深100%；MS/MS才有優(yōu)選方法；隔離寬度4;母離子數(shù)2;母離子強(qiáng)度絕對(duì)閾值100000，相對(duì)閾值0.1%;動(dòng)態(tài)排除2次并在0.5min釋放；MS/MS碎裂電壓1.2V；MS/MS譜圖平均2次。[0028]本發(fā)明還提供了一種與上述內(nèi)標(biāo)多肽聯(lián)合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列，m/z=614.8。[0029]本發(fā)明提供了具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列的多肽在制備糖尿病早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。[0030]本發(fā)明提供了一種與上述內(nèi)標(biāo)多肽聯(lián)合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列，m/z=537.7。[0031]本發(fā)明提供了具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列的多肽在制備糖尿病早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。[0032]本發(fā)明提供了一種與上述內(nèi)標(biāo)多肽聯(lián)合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列，m/z=820.5。[0033]本發(fā)明提供了具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列的多肽在制備糖尿病早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。[0034]本發(fā)明提供一種用于診斷早期糖尿病的試劑盒，其工作程序?yàn)?(1)采集血液以及獲得血漿；(2)將血漿樣本按照進(jìn)行酶切，酶切條件為:向例血漿樣品中加入16μL含8Μ尿素的IOmMDTT溶液進(jìn)行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封閉氨基酸側(cè)鏈的活潑基團(tuán)，于黑暗處反應(yīng)lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質(zhì)量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)HPLC-ES1-TOFMS檢測多肽樣品；(4)讀取生物標(biāo)志物肽段(FKDLGEENFK、LDELRDEGK和/或KVPQVSTPTLVEVSR)與內(nèi)標(biāo)肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的質(zhì)譜峰面積，分別計(jì)算生物標(biāo)志物肽段和內(nèi)標(biāo)肽段質(zhì)譜峰面積的比值；(5)考察比值所處的范圍，判斷糖尿病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)程度，對(duì)早期糖尿病進(jìn)行診斷:若肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8)與內(nèi)標(biāo)肽段離子(m/z=977.4)峰面積之比在0.012-0.026之間，則有樣品來源的宿主有較大的罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)；若比值在0.034-0.121之間，則有潛在的罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)；若比值在0.115-0.330之間，則說明宿主罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)較小。若LDELRDEGK(m/z=537.7)與內(nèi)標(biāo)肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)峰面積之比值在0.075-0.609之間，則樣品來源的宿主有較大的罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5)與內(nèi)標(biāo)肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)的比值中，若比值在0.010-0.031之間，則有較大的罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)；若比值在0.021-0.100之間，則有潛在的罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)；若比值在0.070-0.289之間，則說明樣品來源的宿主罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)較小。[0035]本發(fā)明還提供了一種體外模型篩選糖尿病多肽標(biāo)志物的方法，包括以下步驟:[0036](1)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液40mM/mL，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照；[0037](2)胰酶消化，將蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經(jīng)糖基化的HSA與空白對(duì)照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT(二硫蘇糖醇)溶液進(jìn)行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封閉氨基酸側(cè)鏈的活潑基團(tuán)，于黑暗處反應(yīng)lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質(zhì)量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;[0038](3)180標(biāo)記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；向未經(jīng)修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=1~125:1，w/w)，在37°C水浴中標(biāo)記8~24小時(shí)，標(biāo)記完成后，殘余的胰蛋白酶需經(jīng)滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再加入5%的甲酸(v/v)；在HPLC-MS進(jìn)行分析之前，樣品需經(jīng)過高速離心處理(17，OOOXg,15min)，以確保無不溶物進(jìn)到HPLC-MS分析系統(tǒng)里。體系尿素濃度控制在2M以下；[0039](4)HPLC/ES1-TOFMS方法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法對(duì)樣品進(jìn)行定性分析；[0040](5)數(shù)據(jù)分析與內(nèi)標(biāo)肽段的選擇，Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數(shù)據(jù)特征，提取參數(shù):保留時(shí)間8.00-45.0Omin;質(zhì)荷比m/Z300-1800;信噪比閾值S/N5;譜峰數(shù)目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應(yīng)肽段的160/180峰對(duì)，并計(jì)算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經(jīng)修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點(diǎn)，經(jīng)過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經(jīng)過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對(duì)葡萄糖敏感的糖基化位點(diǎn)；在TOFMS數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)I個(gè)葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次質(zhì)譜檢測中穩(wěn)定地被檢測到，質(zhì)譜信號(hào)達(dá)到105，肽段的160/180峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內(nèi)標(biāo)肽段；[0041](6)分別考察濃度為6.0mM,24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液，在不同孵育時(shí)間10天、20天和30天下HSA糖基化修飾的濃度依賴性，以內(nèi)標(biāo)肽段的單同位素峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，用其他3反應(yīng)時(shí)間延長或葡萄糖溶液濃度變大而下調(diào)的肽段單同位素峰面積之t匕，選擇具有質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度、肽段離子在每次質(zhì)譜檢測中均可被穩(wěn)定的捕捉到，且在HPLC/ES1-TOFMS和HPLC/ES1-1onTrapMS檢測中同時(shí)滿足相同的保留時(shí)間和質(zhì)荷比的誤差在可接受范圍內(nèi)，其中ΔRt=±0.2min,—級(jí)質(zhì)譜Δm/z=±0.3,側(cè)重于表現(xiàn)糖基化修飾具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的離子，篩選得到易被修飾的葡萄糖敏感肽段。[0042]上述方法中，在本發(fā)明的實(shí)施例中，樣品HPLC/ES1-TOFMS定量分析采用AgilentllOO系列高效液相色譜儀串聯(lián)ES1-T0FMS(Agilent6210)進(jìn)行，樣品定性分析采用均AgilentllOO系列高效液相色譜儀串聯(lián)ES1-1onTrapMSD。[0043]HPLC/ES1-TOFMS分析液相色譜條件為:色譜柱為GraceC18柱(300A，2.1mmX150mm);流速0.2mL/min;進(jìn)樣量IOyg;所用流動(dòng)相為:A相為含0.1%甲酸的水溶液相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件為:3%B，0—8min;3-40%B，8—35min;40-95%B,35—40min;95%B,40—43min以及95_3%Bfrom43—45min;Postrun為IOmin；ES1-TOFMS條件為:以氮?dú)庾鳛楦稍餁夂挽F化氣(干燥氣流速10L/min;干燥氣溫度為350°C;霧化器壓力為35psi);采用正離子模式；毛細(xì)管電壓為-3.5kV;毛細(xì)管出口電壓160V;錐孔電壓60V；MS掃描范圍為m/z300-1800amu；[0044]HPLC/ES1-1onTrapMS分析，樣品定性分析的液相色譜條件和質(zhì)譜ESI離子源條件與上述HPLC/ES1-TOF分析的條件相同；MS掃描范圍為m/z300-1800;最大累積時(shí)間100ms,MS譜圖平均2次；目標(biāo)質(zhì)量數(shù)900，化合物穩(wěn)定性100%，阱深100%；MS/MS才有優(yōu)選方法；隔離寬度4;母離子數(shù)2;母離子強(qiáng)度絕對(duì)閾值100000，相對(duì)閾值0.1%;動(dòng)態(tài)排除2次并在0.5min釋放；MS/MS碎裂電壓1.2V；MS/MS譜圖平均2次。[0045]在過往的研究中，研究者們的傳統(tǒng)觀點(diǎn)普遍是認(rèn)為功能性蛋白為低豐度蛋白，因而生物標(biāo)志物也會(huì)來自低豐度蛋白，因而研究思路也往往偏離了本發(fā)明的方向。而本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于選擇了高豐度蛋白作為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)，糖基化反應(yīng)屬于非酶催化的化學(xué)反應(yīng)，不具有選擇性。因此外周血高豐度蛋白有更高的概率被葡萄糖所修飾，而修飾的程度則反映體內(nèi)尚未代謝掉的葡萄糖的水平，且血糖的改變也會(huì)在蛋白上得到體現(xiàn)，因而可以比測量血糖水平更敏銳的發(fā)現(xiàn)罹患糖尿病的趨勢，同時(shí)規(guī)避了低豐度蛋白在檢測上的困難，包括難以達(dá)到準(zhǔn)確定量等不利因素。[0046]本發(fā)明篩選并驗(yàn)證得到了一組有效、典型葡萄糖敏感肽段，這既彌補(bǔ)了單一生物標(biāo)志物特異性不高、準(zhǔn)確性欠佳等問題，又創(chuàng)新性的提出了用HSA自身酶切得到葡萄糖不敏感肽段作為內(nèi)標(biāo)，以葡萄糖敏感肽段和內(nèi)標(biāo)肽段峰面積之比作為糖基化修飾程度指標(biāo)，這一新思路巧妙地解決了臨床樣品中存在較大個(gè)體差異，而使得相對(duì)定量存在較大困難的問題。本發(fā)明提出了定量肽類生物標(biāo)志物作為臨床糖尿病早期診斷的新策略，獲得了預(yù)防和監(jiān)測糖尿病的相關(guān)指標(biāo)。這對(duì)于糖尿病的早期診斷和有效干預(yù)有重大意義和光明的前景?！緦＠綀D】【附圖說明】[0047]圖1為不同胰蛋白酶與HSA的比例對(duì)酶解效率的影響圖。[0048]圖2為不同酶解時(shí)間對(duì)酶解效率的影響圖。[0049]圖3為18O標(biāo)記與未標(biāo)記肽段單獨(dú)分析或l:l(v/v)混合分析質(zhì)譜圖:圖3A為HSA酶切所得肽段m/z=537.7經(jīng)18O標(biāo)記后的質(zhì)譜圖。其中1^111/2=537.7)為未標(biāo)記18O原子的肽段的單同位素峰；1:011/2=538.7)為標(biāo)記一個(gè)18O原子的肽段的單同位素峰；I2(m/z=539.7)為標(biāo)記一個(gè)18O原子的肽段的單同位素峰。圖3Β1:1(v/v)混合分析時(shí)所得肽段(m/z=614.8，z=2)的16O-18O質(zhì)譜峰對(duì)，18O標(biāo)記與未標(biāo)記肽段的單同位素峰其質(zhì)量數(shù)相差4Da。圖3B顯示的是HSA肽段(m/z=614.8,z=2)在18O標(biāo)記和未標(biāo)記樣品1:1(v/v)混合分析時(shí)的質(zhì)譜圖。其160/180峰面積的比值，按照簡化后的方法僅計(jì)算單同位素的峰面積，應(yīng)為m/z=614.8的峰面積比上m/z=616.8的峰面積等于0.81。[0050]圖4不同尿素濃度對(duì)標(biāo)記比例的影響圖，其中圖4A可被穩(wěn)定檢測到的57個(gè)酶切后HSA肽段，在不同尿素濃度下標(biāo)記比例的平均值；圖4B標(biāo)記比例值最低的4個(gè)肽段，其標(biāo)記效率對(duì)尿素濃度的變化趨勢。[0051]圖5標(biāo)記緩沖液pH值、濃度以及酶切終止方式對(duì)標(biāo)記比例的影響圖，其中圖5A標(biāo)記緩沖液PH值對(duì)標(biāo)記比例的影響；圖5B為KH2PO4-K2HPO4濃度對(duì)4個(gè)標(biāo)記比例最低的肽段的影響；圖5C為使用甲酸終止酶解對(duì)后續(xù)標(biāo)記步驟標(biāo)記比例的影響。[0052]圖6標(biāo)記時(shí)間對(duì)標(biāo)記效率的影響。[0053]圖7為優(yōu)化條件下57個(gè)可被穩(wěn)定檢測的HSA肽段標(biāo)記效率的分布情況。[0054]圖8不同孵育時(shí)間與不同葡萄糖濃度下的葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的160/180相對(duì)峰面積比例。[0055]圖9為比較的方法示意圖，其中比例I是與葡萄糖共育的葡萄糖敏感肽段與內(nèi)標(biāo)肽段的峰面積之比，這一比值越小說明糖基化的程度越高；比例2是對(duì)照組葡萄糖敏感肽段與內(nèi)標(biāo)肽段的峰面積之比，這一比例用于校正不同肽段之間由于其它因素導(dǎo)致的差異，如離子化效率等；而最終衡量一個(gè)葡萄糖敏感肽段的變化的比例為比例I與比例2之比。[0056]圖10為HSA與不同濃度葡萄糖溶液發(fā)生糖基化反應(yīng)的情況，圖1OA為HSA肽段與葡萄糖溶液共育10天后各肽段的160/180峰面積之比；圖1OB為HSA肽段與葡萄糖溶液共育20天后各肽段的160/180峰面積之比；圖1OC為HSA肽段與葡萄糖溶液共育30天后各肽段的160/180峰面積之比。[0057]圖11軟件模擬內(nèi)標(biāo)肽段與葡萄糖敏感肽段在HSA空間結(jié)構(gòu)中的位置圖。[0058]圖12為混合血漿樣品中葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK在不同孵育時(shí)間與不同葡萄糖濃度下的160/180相對(duì)峰面積比例。[0059]圖13HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段FKDLGEENFK，其中圖13A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段FKDLGEENFK在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖13B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況；圖13C為肽段FKDLGEENFK在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。[0060]圖14是肽段ETYGEMADCCAK與6.0mM葡萄糖共孵育10天的質(zhì)譜圖。[0061]圖15HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段YLYEIAR，其中，其中圖15A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段YLYEIAR在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖15B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段YLYEIAR在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況；圖15C為肽段YLYEIAR在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。[0062]圖16HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段LDELRDEGK，其中圖16A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LDELRDEGK在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖16B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LDELRDEGK在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況；圖16C為肽段LDELRDEGK在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。[0063]圖17HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段LSQRFPK，其中圖17A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中目標(biāo)肽段在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖17B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中目標(biāo)肽段在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況；圖17C為肽段LSQRFPK在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。[0064]圖18HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段LVTDLTK，其中圖18A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LVTDLTK在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖18B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LVTDLTK在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況；圖18C為肽段LVTDLTK在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。[0065]圖19HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段DVFLGMFLYEYAR，其中圖19A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖19B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段DVFLGMFLYEYAR在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況；圖19C為肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。[0066]圖20HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段RHPDYSVVLLLR。[0067]圖21為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育時(shí)間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況。[0068]圖22A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段CCAAADPHECYAK在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時(shí)間被修飾的情況。圖22B為肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育時(shí)間下與不同濃度葡萄糖共育后經(jīng)HPLC-MS檢測的質(zhì)譜峰圖。圖22CHPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段KVPQVSTPTLVEVSR。[0069]圖23HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段CCTESLVNR。[0070]圖24為糖尿病肽類生物標(biāo)志物臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程圖。[0071]圖25臨床樣品中內(nèi)標(biāo)肽段離子m/z=977.4峰面積信息的獲得。[0072]圖26臨床樣品不同組別中檢測目標(biāo)肽段FKDLGEENFK。[0073]圖27臨床樣品不同組別中檢測目標(biāo)肽段YLYEIAR。[0074]圖28臨床樣品不同組別中檢測目標(biāo)肽段LDELRDEGK。[0075]圖29臨床樣品不同組別中檢測目標(biāo)肽段LVTDLTK。[0076]圖30HPLC-MS無法實(shí)現(xiàn)T2DM臨床樣品中肽段DVFLGMFLYEYAR的檢測。[0077]圖31臨床樣品不同組別中檢測目標(biāo)肽段KVPQVSTPTLVEVSR。[0078]圖32糖尿病肽類生物標(biāo)志物候選物在HSA上空間位置。【具體實(shí)施方式】[0079]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。[0080]若未特別指明，實(shí)施例中所用的生物化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的儀器耗材均為市售；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。[0081]實(shí)施例1體外建立基于HAS單一蛋白篩選葡萄糖敏感肽段的模擬體內(nèi)糖基化模型[0082]1、體外糖基化樣品的制備[0083]體外糖基化樣品的制備基本可依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法【Sattarahmady,N.,etal.,Formationofthemoltenglobule-likestateduringprolongedglycationofhumanserumalbumin.[J].BiochimBiophysActa,2007.1770(6):p.933-42]D將未經(jīng)修飾的人血清白蛋白(HAS)(純度≥96%，購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)于50mMPBS(pH7.4)緩沖液中配成生理濃度的溶液(40mM/mL)，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10天、20天和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415。4個(gè)葡萄糖濃度分別依據(jù)生理葡萄糖濃度(~12.05%糖基化位點(diǎn)覆蓋率)、理論50%糖基化位點(diǎn)覆蓋率、理論100%糖基化位點(diǎn)覆蓋率以及葡萄糖過量5倍而設(shè)計(jì)。每個(gè)濃度和孵育時(shí)間下分別制備三個(gè)平行樣品，以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照。所有溶液事先均經(jīng)過無菌處理，方法如下:在超凈工作臺(tái)中，使用0.2μm無菌針頭式過濾器(PALL,Φ13mm,Supor親水性聚醚砜膜)過濾除菌，將樣品轉(zhuǎn)入經(jīng)無菌處理的離心管中，密封。且共育過程中，使用對(duì)二甲苯作為抑菌劑對(duì)溶液進(jìn)行液封。孵育結(jié)束后的樣品，經(jīng)冷凍干燥后儲(chǔ)存于_80°C冰箱中備用。[0084]2、胰蛋白酶消化條件的考察及優(yōu)化[0085]實(shí)現(xiàn)完全酶解及保持酶解效率的穩(wěn)定性是本發(fā)明的基礎(chǔ)，有必要對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，主要針對(duì)以下兩個(gè)方面。[0086]2.1考察最佳的HSA與胰蛋白酶比例[0087]為了了解最適宜的酶解時(shí)胰蛋白酶與HSA的比例,在固定了酶解時(shí)間為24h(保證充分酶解)的前提下，分別采用了trypsin:HSA=1:125、1:100、1:50、1:25以及1:10(w/w)五個(gè)條件進(jìn)行測試，結(jié)果如圖1所示:[0088]在HSA酶解后進(jìn)行HPLC/ES1-TOF分析時(shí)，隨機(jī)選擇了不同保留時(shí)間的肽段峰面積計(jì)算蛋白的酶解效率，在對(duì)比胰酶用量對(duì)酶切進(jìn)行的影響時(shí)，每個(gè)比例下的進(jìn)樣均選擇相同的肽段。在圖1中，橫坐標(biāo)為胰蛋白酶用量從少到多的5個(gè)比例，縱坐標(biāo)為胰蛋白酶與HSA不同比例下,HSA酶解效率與trypsin:HSA=l:50(w/w)時(shí)酶解效率的比值。從圖1所示的結(jié)果來看，隨著胰蛋白酶用量的增加，酶解效率從trypsin:HSA=1:125至1:50(w/w)逐漸增加，當(dāng)胰蛋白酶的用量超過trypsin:HSA=l:50(w/w)時(shí),酶解效率不隨胰酶用量的增多而提高，因此過多的胰酶使用量只能帶來胰酶的浪費(fèi)。經(jīng)過考察，最佳的胰蛋白酶與HSA比例為I:50(w/w)ο[0089]2.2考察最佳的酶解時(shí)間[0090]將HSA變性、封閉，加入胰酶之后在37°C水浴孵育，按設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)取樣，進(jìn)樣至HPLC/ES1-TOFMS，按照肽段的峰面積計(jì)算酶解效率，情況如圖2所示。[0091]圖2的橫坐標(biāo)表示不同取樣時(shí)間點(diǎn),縱坐標(biāo)為不同酶解時(shí)間下,HSA酶解效率與酶解16小時(shí)酶解效率的比值。從圖2所示的結(jié)果來看，隨著酶解時(shí)間的延長，酶解效率從0.5h至16h逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間超過16h以后，無論孵育時(shí)間延長多久，酶解效率不再隨時(shí)間的延長而提高，而是穩(wěn)定在一個(gè)平衡的狀態(tài)。但是，最終的實(shí)驗(yàn)方案將酶解時(shí)間定為20h，這是為了確保HSA得到充分的酶解。[0092]3,18O標(biāo)記條件的考察及優(yōu)化[0093]用分步法分別實(shí)現(xiàn)蛋白的酶解和酶解后肽段的18O標(biāo)記。在第一步的酶解過程中，需要引入尿素作為變性劑，使得蛋白結(jié)構(gòu)變松散，有利于酶切位點(diǎn)的識(shí)別，而尿素會(huì)滯留在反應(yīng)體系內(nèi)，對(duì)接下來的18O標(biāo)記過程具有一定的干擾作用。因此需考察標(biāo)記反應(yīng)時(shí)體系內(nèi)的尿素濃度對(duì)標(biāo)記效率的影響。標(biāo)記緩沖液的條件也需要被考察，包括緩沖液的PH值及其濃度。PH值直接關(guān)系到催化標(biāo)記反應(yīng)的胰酶的活性，因此pH值的選擇可能對(duì)標(biāo)記效率有很大影響。此外，標(biāo)記時(shí)間對(duì)18O標(biāo)記效率也具有一定影響，時(shí)間過短達(dá)不到最大標(biāo)記比例；時(shí)間過長亦不會(huì)對(duì)提高標(biāo)記效率起到有利作用。最終，還要對(duì)優(yōu)化條件在完成的18O標(biāo)記的標(biāo)記質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，以確定可達(dá)到穩(wěn)定且高效率的標(biāo)記。[0094]不同的肽段由于其氨基酸序列不同，會(huì)有空間結(jié)構(gòu)上的差異，以至于被胰酶催化進(jìn)行18O標(biāo)記的活性也不同，因此不同種類的肽段的標(biāo)記效率也存在差異。但盡管如此，標(biāo)記作為一個(gè)可逆反應(yīng)，不同肽段在達(dá)到標(biāo)記平衡時(shí)所能獲得的最大標(biāo)記比例是相同的。其原因在于，當(dāng)達(dá)到標(biāo)記平衡時(shí)，標(biāo)記比例不再取決于胰酶催化的活性，而只與H218O純度有關(guān)。對(duì)于本發(fā)明使用的97%的!12180而言，達(dá)到標(biāo)記平衡時(shí)所標(biāo)記上2個(gè)18O的最大比例為:97%X97%=94.09%。標(biāo)記的速率不同，到達(dá)最大標(biāo)記比例所用的時(shí)間就不同。[0095]肽段經(jīng)過18O標(biāo)記后，由于無法實(shí)現(xiàn)完全標(biāo)記因而存在三種類型的肽段:未標(biāo)記上18O原子的肽段、標(biāo)記上一個(gè)18O原子的肽段和標(biāo)記上兩個(gè)18O原子的肽段，如圖3A所示。在本發(fā)明中，標(biāo)記比例指的是標(biāo)記上兩個(gè)18O原子的肽段占總肽段的百分比；而相對(duì)標(biāo)記效率指的是標(biāo)記比例與理論最大標(biāo)記效率的相對(duì)比值。于是在本發(fā)明中，標(biāo)記效率被定義為相對(duì)標(biāo)記比例。為了簡化計(jì)算，擬采用單同位素峰的峰面積來計(jì)算標(biāo)記比例，計(jì)算方法如下:【權(quán)利要求】1.一種用于早期糖尿病診斷的內(nèi)標(biāo)多肽，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.1所述的氨基酸序列。2.權(quán)利要求1所述的內(nèi)標(biāo)多肽在制備早期糖尿病診斷試劑盒中的應(yīng)用。3.一種篩選權(quán)利要求1所述內(nèi)標(biāo)多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照；(2)胰酶消化，蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經(jīng)糖基化的HSA與空白對(duì)照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT溶液進(jìn)行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封閉氨基酸側(cè)鏈的活潑基團(tuán)，于黑暗處反應(yīng)lh，再加入溶于PH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質(zhì)量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)180標(biāo)記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后凍干備用；向未經(jīng)修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶，HSA:胰蛋白酶質(zhì)量比=1~125:1，在37°C水浴中標(biāo)記8~24小時(shí)；(4)HPLC/ES1-T0FMS方法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法對(duì)樣品進(jìn)行定性分析；(5)數(shù)據(jù)分析與內(nèi)標(biāo)肽段的選擇,Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數(shù)據(jù)特征，提取參數(shù):保留時(shí)間8.00-45.0Omin;質(zhì)荷比m/z300_1800；信噪比閾值S/N5;譜峰數(shù)目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應(yīng)肽段的160/180峰對(duì)，并計(jì)算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經(jīng)修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點(diǎn)，經(jīng)過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經(jīng)過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對(duì)葡萄糖敏感的糖基化位點(diǎn)；在--MS數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)I個(gè)葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7min均可在每一次質(zhì)譜檢測中穩(wěn)定地被檢測到，質(zhì)譜信號(hào)達(dá)到105，肽段的160/180峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內(nèi)標(biāo)肽段。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)還包括在標(biāo)記完成后，殘余的胰蛋白酶需經(jīng)滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再按照體積比加入5%的甲酸。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中標(biāo)記體系尿素濃度控制在2M以下。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在HPLC/ES1-TOFMS分析之前，樣品需經(jīng)過離心處理，離心條件為17,OOOXg,15min。7.一種與權(quán)利要求1所述內(nèi)標(biāo)多肽聯(lián)合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。8.一種與權(quán)利要求1所述內(nèi)標(biāo)多肽聯(lián)合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列。9.一種與權(quán)利要求1所述內(nèi)標(biāo)多肽聯(lián)合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標(biāo)志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列。10.一種體外模型篩選糖尿病多肽標(biāo)志物的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應(yīng)體系作為空白對(duì)照；(2)胰酶消化，將蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經(jīng)糖基化的HSA與空白對(duì)照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT溶液進(jìn)行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封閉氨基酸側(cè)鏈的活潑基團(tuán)，于黑暗處反應(yīng)lh，再加入溶于PH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質(zhì)量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)180標(biāo)記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；向未經(jīng)修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶質(zhì)量比=1~125:1，在37°C水浴中標(biāo)記8~24小時(shí)；(4)HPLC/ES1-TOFMS方法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法對(duì)樣品進(jìn)行定性分析；(5)數(shù)據(jù)分析與內(nèi)標(biāo)肽段的選擇,Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數(shù)據(jù)特征，提取參數(shù):保留時(shí)間8.00-45.0Omin;質(zhì)荷比m/z300_1800；信噪比閾值S/N5;譜峰數(shù)目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應(yīng)肽段的160/180峰對(duì)，并計(jì)算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經(jīng)修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點(diǎn)，經(jīng)過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經(jīng)過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對(duì)葡萄糖敏感的糖基化位點(diǎn)；在--MS數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)I個(gè)葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次質(zhì)譜檢測中穩(wěn)定地被檢測到，質(zhì)譜信號(hào)達(dá)到105，肽段的160/180峰面積比例最接近I，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內(nèi)標(biāo)肽段；(6)分別考察濃度為6.0mM,24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液，在不同孵育時(shí)間10天、20天和30天下HSA糖基化修飾的濃度依賴性，以內(nèi)標(biāo)肽段的單同位素峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，用其他3反應(yīng)時(shí)間延長或葡萄糖溶液濃度變大而下調(diào)的肽段單同位素峰面積之t匕，選擇具有質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度、肽段離子在每次質(zhì)譜檢測中均可被穩(wěn)定的捕捉到，且在HPLC/ES1-TOFMS和HPLC/ES1-1onTrapMS檢測中同時(shí)滿足相同的保留時(shí)間和質(zhì)荷比的誤差在可接受范圍內(nèi)，其中ΔRt=±0.2min,—級(jí)質(zhì)譜Δm/z=±0.3,側(cè)重于表現(xiàn)糖基化修飾具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的離子，篩選得到易被修飾的葡萄糖敏感肽段?！疚臋n編號(hào)】G01N30/02GK103897035SQ201410090215【公開日】2014年7月2日申請日期:2014年3月12日優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日【發(fā)明者】鄧玉林,張玫申請人:北京理工大學(xué)