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檢測羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途，該比率型熒光探針是將蛋白質包裹具有熒光的BSA-AuNCs（金納米簇）和對羥基自由基有特定響應的有機分子HPF（2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoicacid）共價鍵和在一起，從而形成比率型熒光探針。此探針無羥基自由基的條件下僅BSA-AuNCs會發(fā)射出參比熒光，當環(huán)境中存在羥基自由基時，探針上的HPF會與羥基自由基發(fā)生反應，生成熒光產(chǎn)物，發(fā)射出羥基自由基的響應熒光。由于參比熒光的存在，可以有效的降低由于激光光源穩(wěn)定性，激光強度，探針濃度，光學對焦，細胞內環(huán)境變化等原因引起的測定誤差，能夠更準確的測定羥基自由基的濃度。
【專利說明】檢測羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測技術及臨床醫(yī)學檢測領域，具體涉及一種檢測羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途。
【背景技術】
[0002]活性氧是生物體生命代謝不可避免的副產(chǎn)物，它在機體的先天性免疫、信號轉導、細胞的增生、分化、凋亡等方面有重要的作用，但是同時，活性氧自由基對生物機體也存在著氧化損傷，使組織細胞的結構發(fā)生破壞性修飾，損傷正常組織細胞的形態(tài)和功能(文獻
1:Chen X.，.Probing oxidative stress: Small molecule fluorescent sensors ofmetal ions, reactive oxygen species, and thiols，Coord.Chem.Rev.,2011,40:4783-4804)。 [0003]羥基自由基是目前已知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，它能夠造成細胞中DNA、脂質、糖類、蛋白質等分子過度氧化，而造成細胞傷害。相關研究證據(jù)顯示，這些損傷可進一步造成多種退化性疾病、老化、突變以及癌癥的形成(Tang，B.，Probing Hydroxyl Radicals and Their Imaging in Living Cells by Use of FAM -DNA-Au Nanoparticles, Chem.Eur.J.,2008, 14，522-528)，因此，對羥基自由基的測定尤為重要。
[0004]羥基自由基的壽命短，含量低，對其的檢測是化學分析和生命科學分析領域最困難的問題之一。目前，國內外文獻報道的檢測羥基自由基的方法主要有電子自旋共振法(Yim，Μ.B.，Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radicalproduction from hydrogen peroxide, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，1990，87，5006-5010)，電化學法(Li，L，An Electrochemical Strategy for Fast Monitoring of?OH Released from Live Cells at Electroactive FcHT-Functional Surface Amplifiedby Au Nanoparticles, Chem.Commun.，2013，49，1279-1281 )，以及焚光法(Czili，Η.，Applicability of coumarin for detecting and measuring hydroxyl radicalsgenerated by photoexcitation of TiO2 nanoparticles, App1.Catal.B.，2008，81，295-302)等。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性高、線性范圍寬、方法簡便快速等優(yōu)點，且與激光共聚焦顯微技術結合后，可以實現(xiàn)活體細胞和組織內目標物的“實時、定量、可見”的檢測。目前已報道用于檢測細胞內羥基自由基的探針多為單發(fā)射型，不能有效避免測定環(huán)境所引起的誤差。
[0005]比率型熒光探針測定時包含兩個熒光信號峰，其中一個作為參比熒光型號，另一個作為對待測物有響應的響應熒光信號，根據(jù)兩個熒光信號的光強度比值度待測物進行定量，由于參比熒光的存在，在測定的過程中可以有效的避免復雜環(huán)境變化所引起的誤差(A.Zhu.Carbon-Dot-Based Dual-Emission Nanohybrid Produces a RatiometricFluorescent Sensor for In Vivo Imaging of Cellular Copper 1ns， Angew.Chem.1nt.Ed.,2012,51: 7185—7189)。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種對細胞滲透性好，毒副作用小，適用于生物體內羥基自由基檢測的比率型熒光探針。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供一種工藝簡單的該熒光探針的合成方法。
[0008]本發(fā)明的目的之三是提供該熒光探針的用途。
[0009]本發(fā)明提出的一種檢測羥基自由基的比率型熒光探針，以牛血清蛋白為還原劑和保護劑，制備具有熒光的BSA-AuNCs (金納米簇)中，使牛血清蛋白上的胺基和對羥基自由基有特定響應的有機分子 HPF(2-[6- (4，-Hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-on_9-yl]benzoicacid)的羧基反應，產(chǎn)生共價鍵，從而形成比率型熒光探針。
[0010]本發(fā)明提出的一種檢測羥基自由基的比率型熒光探針的合成方法，具體步驟如下:
(1)在37°C和充分磁力攪拌的條件下，將5體積，濃度為10 mM的氯金酸水溶液加入到5體積、質量濃度為50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5體積濃度為I M的NaOH溶液，持續(xù)反應12 h ;用透析膜(MWC0: 3500)將反應得到的產(chǎn)物在超純水中透析24h,得到BSA-AuNCs溶液；
(2)室溫條件下，將體積為10μ L濃度為5 mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入催化劑0.0400 g 1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和0.0400 g N-羥基琥珀酰亞胺活化，再加入步驟(I)得到的AuNCs溶液反應10 h ;所得產(chǎn)物在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析，得到比率型熒光探針溶液。
[0011]本發(fā)明提出的比率型熒光探針用于化學體系、化學模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細胞和活組織內的羥基自由基的熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學上組織和器官中羥基自由基的檢測。
[0012]本發(fā)明提出的比率型熒光探針對羥基自由基的識別是基于有機分子HPF對羥基自由基的特殊響應。在沒有羥基自由基的情況下，比率型熒光探針中只BSA-AuNCs會發(fā)射出熒光；當有羥基自由基存在時，羥基自由基會切斷HPF中的對苯酚基，生成熒光素類熒光物質，成為雙發(fā)射比率型熒光探針。
[0013]本發(fā)明提出的比率型熒光探針通常加入含有細胞及組織的適當緩沖溶液中進行測試，其線性范圍為0μΜ-150μΜ。
[0014]本發(fā)明提出的比率型熒光探針結合激光共聚焦顯微技術被實際應用于Hela細胞在氧化應激條件下的羥基自由基的細胞成像。
[0015]本發(fā)明的熒光探針有如下優(yōu)點:
(I)作為比率型熒光探針，由于參比熒光的存在，可以有效的降低由于激光光源穩(wěn)定性，激光強度，探針濃度，光學對焦，細胞內環(huán)境變化等原因引起的測定誤差，能夠更準確的測定羥基自由基的濃度。
[0016](2)合成方法簡單，在室溫下即可，不需要嚴格的合成條件；
(3)對羥基自由基有良好的選擇性，其它活性氧物質幾乎不會產(chǎn)生干擾熒光信號。
[0017](4)參比熒光的存在可以有效避免由測定環(huán)境的變化而引起的誤差。
[0018](5)探針的細胞毒性低，生物兼容性好。[0019](6)探針的熒光激發(fā)波長為488 nm,對于活性組織和細胞的損傷小。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的比率型熒光探針與不同濃度的羥基自由基作用后體系的熒光發(fā)射圖譜，其橫坐標為波長(Wavelength/nm)，縱坐標為熒光強度(FL)。
[0021]圖2是本發(fā)明的比率型熒光探針與不同濃度的羥基自由基作用的線性關系，橫坐標為’OH的濃度0-0Η]/μ M)，縱坐標為熒光比率探針的熒光強度比率值(15。。_56(|/158(|_69(|)。
[0022]圖3是本發(fā)明的比率型熒光探針對羥基自由基（.0Η)與過氧化氫(H2O2),超氧陰離子自由基(02_)，次氯酸根(C10_)，脂過氧自由基(R00_)，過氧亞硝基陰離子(0N00_ )，單線態(tài)氧(1O2),—氧化氮(NO)，次硝酸(HNO)的熒光響應，橫坐標為各種活性自由基物質，縱坐標為比率熒光探針中響應熒光與參比熒光的熒光光強度比率值(Ι5Μ-56(Ι/Ι5._)。
[0023]圖4是本發(fā)明的比率型熒光探針對細胞的MTT細胞實驗。加入不同倍數(shù)于的原細胞探針溶液濃度的探針與細胞共培養(yǎng)后，細胞的存活率。
[0024]圖5是本發(fā)明的比率型熒光探針研究宮頸癌細胞(Hela)的激光共聚焦顯微成像的灰度圖，(a)是未產(chǎn)生_0H前，探針在細胞里的成像，(b)和(c)是引起氧化應激20 min和40 min后，探針在細胞里的成像。
[0025]圖6是本發(fā)明的比率型熒光探針測定羥基自由基的機理示意圖。
【具體實施方式】
[0026]下面具體實施例是結合技術方案和附圖對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明不受下列實施例的嚴格限定。
[0027]實施例1:羥基自由基的比率型熒光探針的合成
1.在37°C和充分磁力攪拌的條件下，將5 mL濃度為10 mM的氯金酸水溶液加入到5 5 mL質量濃度為50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5 mL濃度為I M的NaOH溶液，持續(xù)反應12 h;用透析膜(MWC0: 3500)將反應得到的產(chǎn)物在超純水中透析，得到BSA-AuNCs 溶液；
2.室溫條件下，將體積為10μ L濃度為5 mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH為
7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入0.0040g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和0.0040gN-羥基琥珀酰亞胺活化HPF中的羧基，再加入400 μ L上述BSA-AuNCs溶液反應10 h ;所得產(chǎn)物在3000 mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析4 h，得到比率型熒光探針溶液。
[0028]實施例2:比率探針與_0H反應后熒光性質的測定
1.羥基自由基的產(chǎn)生方法:
本發(fā)明中的羥基自由基是利用芬頓反應來產(chǎn)生，其根據(jù)如下反應:
【權利要求】
1.一種檢測羥基自由基的比率型熒光探針，其特征在于:以牛血清蛋白為還原劑和保護劑，制備具有熒光的BSA-AuNCs (金納米簇)，使牛血清蛋白上的胺基和對羥基自由基有特定響應的有機分子 HPF (2_[6_(4，-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on_9-yl]benzoicacid)的羧基反應，產(chǎn)生共價鍵，從而形成比率型熒光探針。
2.一種如權利要求1所述的檢測羥基自由基的比率型熒光探針的合成方法，其特征在于具體步驟如下: (1)在37°C和充分磁力攪拌的條件下，將5體積濃度為10 mM的氯金酸水溶液加入到5體積質量濃度為50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5體積濃度為I M的NaOH溶液，持續(xù)反應12 h ;用透析膜(MWC0: 3500)將反應得到的產(chǎn)物在超純水中透析，得到 BSA-AuNCs 溶液； (2)室溫條件下，將一定量5mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入適量催化劑1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺活化，再加入步驟(I)所述BSA-AuNCs溶液反應10 h ;所得產(chǎn)物在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析，得到比率型熒光探針溶液。
3.—種如權利要求1所述的檢測羥基自由基的比率型熒光探針的用途，其特征在于將比率型熒光探針用于化學體系、化學模擬生物體系中羥基自由基的檢測，生物活細胞和活組織內的羥基自由基的熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學上組織和器官中羥基自由基的檢測。
【文檔編號】G01Q60/22GK103760145SQ201410038820
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權日:2014年1月27日
【發(fā)明者】莊梅, 田陽 申請人:同濟大學