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一種細菌染色方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細菌染色方法，利用該方法對石蠟切片進行快速染色，可以對其中的細菌進行很好的定位，而且，該方法對細菌抹片也同樣適用，而且步驟簡單，容易控制。本發(fā)明公開的一種細菌染色方法，是用甲苯胺藍溶液進行染色。本發(fā)明公開的方法具有如下優(yōu)點：1、本發(fā)明的方法不僅可以對細菌抹片進行染色，而且也可以顯示石蠟切片組織中的細菌。2、本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的細菌染色方法相比較，具有方便、快捷的優(yōu)點。
【專利說明】一種細菌染色方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細菌染色方法，屬于微生物領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 細菌是一類原核細胞型微生物，因為菌體小、半透明，要想更清楚的觀察其大小和 形態(tài)，需經(jīng)染色和顯微鏡放大后才能看到。常用的細菌染色法有單染法、復染法和鑒別染色 法，主要有革蘭氏染色、美藍染色、抗酸染色、瑞氏染色和姬姆薩染色等方法。在進行上述染 色之前，需要制備細菌抹片，但是對石蠟切片的組織中的細菌染色報道還不多見。開發(fā)一種 既適用于石蠟切片又適用于細菌抹片的細菌染色方法具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種細菌染色方法--甲苯胺藍法，利用該方法對石蠟切片 進行快速染色，可以對其中的細菌進行很好的定位，而且，該方法對細菌抹片也同樣適用， 而且步驟簡單，容易控制。
[0004] 本發(fā)明提供一種細菌染色方法，是用甲苯胺藍溶液進行染色；
[0005] 所述甲苯胺藍溶液按照如下方法制備：
[0006] A液：將0. 8g甲苯胺藍在80毫升蒸餾水中溶解；
[0007] B液：將0. 6g高錳酸鉀在20毫升蒸餾水中溶解；
[0008] 將A液煮沸，再將B液滴入A液中，再煮沸，用蒸餾水補足至100毫升，自然冷卻后 過濾即得；
[0009] 所述煮沸的時間為lOmin。
[0010] 上述方法中，所述染色的時間為5-15s，具體為10s。
[0011] 上述任一所述的方法中，所述細菌是石蠟切片或細菌抹片中的細菌。
[0012] 上述任一所述的方法中，所述染色之后還包括如下步驟：將甲苯胺藍溶液染色后 的石蠟切片或細菌抹片放入體積百分含量95%的乙醇水溶液中洗去浮色；
[0013] 所述洗去浮色的標準是石蠟切片的組織顏色變?yōu)闇\藍色或細菌抹片中的細菌顯 示出明顯的藍色形態(tài)。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述石蠟切片在甲苯胺藍溶液中染色之前，還包括脫蠟 至水的步驟；
[0015] 所述脫蠟至水具體是將石蠟切片依次經(jīng)過二甲苯、等體積二甲苯和無水乙醇的混 合液、無水乙醇、體積百分含量為95%的乙醇水溶液、體積百分含量為90%的乙醇水溶液、 體積百分含量為80%的乙醇水溶液、體積百分含量為70%的乙醇水溶液、蒸餾水，石蠟切 片在各試劑中的時間為3-5min ;
[0016] 所述細菌抹片在甲苯胺藍溶液中染色之前，還包括火焰固定的步驟；
[0017] 所述火焰固定是將自然干燥的細菌抹片涂抹面向上，以其背面在火焰外焰上加 熱，以不燙手為度進行固定。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述石蠟切片在洗去浮色之后，還包括將其依次經(jīng)過無 水乙醇，等體積的二甲苯和無水乙醇的混合液、二甲苯，最后將切片用中性樹膠封片的步 驟；
[0019] 所述石蠟切片在所述無水乙醇，等體積的二甲苯和無水乙醇的混合液、二甲苯中 的時間為5-10min，具體為5min ;
[0020] 所述細菌抹片在洗去浮色之后，還包括自然晾干的步驟。
[0021] 上述任一所述的方法中，所述石蠟切片為鴿子嗉囊組織的石蠟切片或孟加拉虎動 物腸道組織的石蠟切片；
[0022] 所述細菌抹片為蠟樣芽孢桿菌的抹片。
[0023] 本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點：
[0024] 1、本發(fā)明的方法不僅可以對細菌抹片進行染色，而且也可以顯示石蠟切片組織中 的細菌。
[0025] 2、本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的細菌染色方法（比如革蘭氏染色法和瑞氏染色法）相比 較，具有方便、快捷的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為甲苯胺藍染色顯示嗉囊組織石蠟切片中的細菌圖1。
[0027] 圖2為甲苯胺藍染色顯示嗉囊組織石蠟切片中的細菌圖2。
[0028] 圖3為甲苯胺藍染色顯示腸道組織石蠟切片中的細菌圖1。
[0029] 圖4為甲苯胺藍染色顯示腸道組織石蠟切片中的細菌圖2。
[0030] 圖5為甲苯胺藍染色顯示蠟樣芽孢桿菌純培養(yǎng)物圖1。
[0031] 圖6為甲苯胺藍染色顯示蠟樣芽孢桿菌純培養(yǎng)物圖2。

【具體實施方式】
[0032] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0033] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034] 甲苯胺藍溶液的配制方法：
[0035] A液：甲苯胺藍0. 8g溶于80毫升蒸餾水中；
[0036] B液：高錳酸鉀0.6g溶于20毫升蒸餾水中；
[0037] 將已溶解的A液煮沸10分鐘，再將已溶解的B液逐滴加入A液中，再煮沸10分鐘， 用蒸餾水補足至1〇〇毫升，待自然冷卻后過濾備用。
[0038] 錯樣芽抱桿菌（Bacillus cereus)在文獻"Mizuka Yamaguchi, Takao Kawai. A new method for rapid and quantitative detection of the Bacillus cereus emetic toxin cereulide in food products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. Food Microbiology34 (2013) 29-37" 中公開過，公眾可從中國農(nóng) 業(yè)大學獲得。
[0039] 鴿子嗉囊組織的石蠟切片可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0040] 孟加拉虎腸道組織的石蠟切片可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得。
[0041] 實施例1、石蠟切片中細菌的甲苯胺藍法染色
[0042] 一、取鴿子嗉囊組織的石蠟切片，脫蠟至水（依次經(jīng)二甲苯、二甲苯：無水乙醇（體 積比1 :1)、無水乙醇、體積百分含量為95%的乙醇水溶液、體積百分含量為90%的乙醇水 溶液、體積百分含量為80%的乙醇水溶液、體積百分含量為70%的乙醇水溶液、蒸餾水（各 步驟時間3-5min))，將切片放入配制好的甲苯胺藍溶液中5-15s，將其放入體積百分含量 95%的乙醇水溶液中洗去浮色，顯微鏡控制（組織顏色變?yōu)闇\藍色），將切片依次經(jīng)過無水 乙醇（脫水），二甲苯：無水乙醇（體積比1:1)、二甲苯（脫乙醇）（各5min，5-10min均可）， 最后將切片用中性樹膠封片。
[0043] 常溫狀態(tài)下封好的切片自然晾干，用顯微鏡觀察（細菌呈藍色），甲苯胺藍溶液中 染色10s的鴿子嗉囊組織的石蠟切片中的細菌染色結(jié)果如圖1和圖2所示。
[0044] 二、取孟加拉虎腸道組織的石蠟切片，按照步驟一的方法進行甲苯胺藍法染色，甲 苯胺藍溶液中染色l〇s的石蠟切片中的細菌染色結(jié)果如圖3和圖4所示。
[0045] 實施例2、細菌抹片的甲苯胺藍法染色
[0046] 蠟樣芽孢桿菌純培養(yǎng)物（將蠟樣芽孢桿菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37°C， 培養(yǎng)24小時），進行細菌抹片（挑取一個蠟樣芽孢桿菌菌落溶于1毫升蒸餾水中，然后用 滅菌接種環(huán)取一環(huán)菌液，于玻片的中央均勻地涂布成適當大小薄層），得到蠟樣芽孢桿菌純 培養(yǎng)物的抹片，自然干燥?；鹧婀潭ǎ▽⒏稍锖玫哪ㄆ?，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈 外焰上如鐘擺樣來回拖過數(shù)次，略作加熱，不能太熱，以不燙手為度，進行固定），在抹片位 置滴加甲苯胺藍溶液染色5-15 8，用體積百分含量95%的乙醇水溶液沖洗3〇8(158-3〇8均 可）洗去浮色，顯微鏡控制（看到藍色的細菌為止），自然晾干顯微鏡觀察，結(jié)果如圖5和圖 6所示。
【權(quán)利要求】
1. 一種細菌染色方法，是用甲苯胺藍溶液進行染色； 所述甲苯胺藍溶液按照如下方法制備： A液：將0. 8g甲苯胺藍在80毫升蒸餾水中溶解； B液：將0. 6g高錳酸鉀在20毫升蒸餾水中溶解； 將A液煮沸，再將B液滴入A液中，再煮沸，用蒸餾水補足至100毫升，自然冷卻后過濾 即得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述染色的時間為5-15s，具體為10s。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述細菌是石蠟切片或細菌抹片中 的細菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述染色之后還包括如下步驟：將 甲苯胺藍溶液染色后的石蠟切片或細菌抹片放入體積百分含量95%的乙醇水溶液中洗去 浮色。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述石蠟切片在甲苯胺藍溶液中 染色之前，還包括脫蠟至水的步驟； 所述脫蠟至水具體是將石蠟切片依次經(jīng)過二甲苯、等體積二甲苯和無水乙醇的混合 液、無水乙醇、體積百分含量為95 %的乙醇水溶液、體積百分含量為90 %的乙醇水溶液、體 積百分含量為80%的乙醇水溶液、體積百分含量為70%的乙醇水溶液、蒸餾水，石蠟切片 在各試劑中的時間為3-5min ; 所述細菌抹片在甲苯胺藍溶液中染色之前，還包括火焰固定的步驟； 所述火焰固定是將自然干燥的細菌抹片涂抹面向上，以其背面在火焰外焰上加熱，以 不燙手為度進行固定。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述石蠟切片在洗去浮色之后，還 包括將其依次經(jīng)過無水乙醇，等體積的二甲苯和無水乙醇的混合液、二甲苯，最后將切片用 中性樹膠封片的步驟； 所述石蠟切片在所述無水乙醇，等體積的二甲苯和無水乙醇的混合液、二甲苯中的時 間均為5-10min，具體為5min ; 所述細菌抹片在洗去浮色之后，還包括自然晾干的步驟。
【文檔編號】G01N1/30GK104089807SQ201410321905
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】佘銳萍, 杜芳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學