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基于磁性分離和量子點標(biāo)記的鉛中毒快速檢測方法與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于磁性分離和量子點(QDs)標(biāo)記的液體生物樣品中鉛的快速檢測方法，所述方法包括：1)制備抗鉛單克隆抗體；2)將所述抗鉛單克隆抗體與納米磁珠通過共價鍵偶聯(lián)，制備抗鉛免疫納米磁珠；3)向所述液體生物樣品中加入雙功能螯合劑、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，進(jìn)行溫育，之后加入所述抗鉛免疫納米磁珠充分混合，之后進(jìn)行磁分離，向磁分離得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗體和鏈霉親和素化的量子點(QDs)，使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測。本發(fā)明還提供一種用于液體生物樣品中鉛的快速檢測的試劑盒。
【專利說明】基于磁性分離和量子點標(biāo)記的鉛中毒快速檢測方法與試劑
合
Sl
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地。本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點標(biāo)記技術(shù)快速檢測血液中鉛含量的方法以及用于快速檢測血液中鉛含量的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]鉛(Pb)污染因其具有持久性、生物富集性和毒性而備受關(guān)注，一直是國際科學(xué)界的熱點研究課題之一。近年來，隨著我國工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加快，鉛污染呈上升趨勢。通過工業(yè)“三廢”的排放進(jìn)入環(huán)境的重金屬鉛，甚至直接影響到了食物鏈和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，有很多地方糧食、蔬菜、水果等食物中鉛含量嚴(yán)重超標(biāo)或接近臨界值，對人類的健康構(gòu)成了極大威脅。2012年，刊登在美國《移民與難民研究》雜志上的一份關(guān)于“紐約健康和營養(yǎng)檢測調(diào)查報告”顯示，來自中國大陸的移民血液中鉛、鎘、汞等重金屬含量高于來自其他亞洲地區(qū)的移民。鉛比其他亞洲新移民高出44%。與此同時，在我國一些日用品(如，化妝品)中鉛含量嚴(yán)重超標(biāo)，進(jìn)一步增加了鉛中毒患者的數(shù)量。
[0003]目前，醫(yī)院檢測患者血鉛含量的常規(guī)方法為光譜法。主要包括:分光光度法(UV)、原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)和電感耦合等離子體-質(zhì)譜法(ICP-MS)。盡管這些方法成熟，結(jié)果可信度高，樣品需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理，儀器昂貴，不適合進(jìn)行快速檢測和大量樣品的篩選。
[0004]包括鉛在內(nèi)的重金屬快速檢測方法目前主要有酶分析法、生物化學(xué)傳感器法、試紙法和免疫分析法。酶分析法靈敏度高，但選擇性較差，對單一重金屬離子的檢測存在一定的困難。生物化學(xué)傳感器法發(fā)展迅速，靈敏度、自動化程度高，可應(yīng)用于環(huán)境在線監(jiān)測，但傳感器制作工藝較難，成本相對較高。試紙法雖然簡單方便，但只能對金屬離子進(jìn)行定性或半定量分析。上述方法主要集中在環(huán)境水樣的快速檢測，而用于生物樣品中重金屬的快速檢測鮮有報道。
[0005]免疫分析法是檢測重金屬離子的一種新方法，檢測速度快、靈敏度高、選擇性強(qiáng)，迄今為止，已經(jīng)成功用于水中金屬離子的檢測。使用特異性的雙功能螯合劑，可以螯合重金屬離子并與載體蛋白偶聯(lián)，形成完整的免疫原，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備特異性單克隆抗體。將抗重金屬的單克隆抗體連接到新型的Fe3O4磁性納米顆粒表面，可以使Fe3O4磁性納米顆粒具有靶向識別和磁性分離的雙重功能，從而實現(xiàn)重金屬的富集，提高檢測靈敏度。
[0006]量子點(QDs)，又稱為半導(dǎo)體納米微晶粒，是一種直徑在I?IOOnm能夠接收激發(fā)光產(chǎn)生熒光的納米顆粒。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，QDs具有量子產(chǎn)率高，光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解等優(yōu)良的光學(xué)特性。將量子點與抗體結(jié)合用于熒光免疫分析的報道越來越多，利用親和素修飾量子點后，量子點可以很容易的與生物素化的抗體結(jié)合，為抗體和量子點提供了一種分子連接的橋梁，應(yīng)用這種方法檢測毒素，可以達(dá)到用有機(jī)染料進(jìn)行標(biāo)記的同等的檢測限。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備鉛單克隆抗體(PbMAb);活化的納米磁珠和QDs分別與PbMAb和二抗相連，制備免疫納米探針；利用免疫磁珠的可富集特性和QDs熒光信號的變化，以期建立多重信號協(xié)同放大、具有超高靈敏度的快速檢測人血液中Pb的新方法，具有重要的科學(xué)意義和極廣闊的應(yīng)用前景。
[0008]技術(shù)問題:本發(fā)明的目的在于針對目前尚無的生物樣品中重金屬Pb的快速檢測方法，建立一種利用免疫磁珠高效分離與QDs熒光信號的變化，快速檢測血液中Pb含量的分析方法。
[0009]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的基于磁性分離和量子點標(biāo)記的鉛中毒快速檢測方法與試劑盒包括如下步驟:
[0010]l)Pb免疫抗原合成:Pb、雙功能螯合劑[(R)-2-硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)環(huán)己烷-1,2 二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)、血藍(lán)蛋白(KLH)按照一定比例，在三乙胺(TEA)存在下，25°C振蕩反應(yīng)22h ;使用PBS緩沖液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，并通過超濾管濾掉未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；使用上述緩沖液稀釋抗原，備用。
[0011]2)Pb檢測抗原合成:將Pb、p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA與牛血清白蛋白(BSA)在TEA的作用下合成檢測抗原。
[0012]3)抗Pb單克隆抗體(PbMAb)的制備與純化:小鼠免疫后制備抗Pb雜交瘤細(xì)胞，然后大量制備腹水型PbMAb，最后使用飽和(NH4)2SOjX淀法純化抗體，使用Sephacry S-300進(jìn)一步純化抗體。
[0013]4)抗Pb免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)制備:將PbMAb與Fe3O4納米磁珠偶聯(lián)，制備抗鉛免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)。
[0014]5)檢測方法的效果評價:分別通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，檢出限，精密度，加標(biāo)回收率實驗以及與實際樣品ICP/MS的檢測結(jié)果對比，評價方法的準(zhǔn)確性與可靠性。
[0015]有益效果:在我國鉛污染嚴(yán)重，建立簡便、快速的鉛中毒快速檢測方法不但對中毒病人的診斷、救治具有重要的理論意義和應(yīng)用價值，還將對提高我國公共衛(wèi)生管理水平和公共衛(wèi)生安全事件處置能力具有重要理論意義和現(xiàn)實意義。
[0016]本發(fā)明根據(jù)熒光免疫的雙抗體夾心原理，利用免疫磁珠分離速度快、效率高、操作簡便等優(yōu)點，結(jié)合QDs光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解等優(yōu)良的光學(xué)特性，分別以免疫磁珠和QDs為載體連接PbMAb和二抗，使得快速、準(zhǔn)確地檢測生物樣品中Pb的含量得以實現(xiàn)。
[0017]本發(fā)明僅用100 μ I血，十幾微升的試劑，在少于Ih的時間內(nèi)即可實現(xiàn)對生物樣品中鉛含量的測定。由于使用的儀器為熒光酶標(biāo)儀，可以同時檢測96個樣品，成本低，省時高效。
[0018]更具體地，本發(fā)明提供以下各項:
[0019]1.用于液體生物樣品中鉛的快速檢測的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0020]抗鉛免疫納米磁珠，所述抗鉛免疫納米磁珠通過將抗鉛單克隆抗體與納米磁珠經(jīng)由共價鍵偶聯(lián)制備；
[0021]雙功能螯合劑；
[0022]牛血清白蛋白(BSA)；
[0023]三乙胺(TEA)；[0024]生物素化的BSA抗體；和
[0025]鏈霉親和素化的QDs。
[0026]2.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠。
[0027]3.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述納米磁珠的粒徑為280nm。
[0028]4.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述雙功能螯合劑是p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA。
[0029]5.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品選自尿液或血液。
[0030]6.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品是血液。
[0031]7.根據(jù)I所述的試劑盒，其中所述抗鉛單克隆抗體利用鉛免疫抗原制備，所述鉛免疫抗原通過在三乙胺(TEA)的存在下將鉛、雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)和血藍(lán)蛋白(KLH)混合來制備。
[0032]8.根據(jù)I所述的試劑盒,其中用于所述QDs的激發(fā)波長=405nm,發(fā)射波長=585nm。
[0033]9.基于磁性分離和量子點(QDs)標(biāo)記的液體樣品中鉛的快速檢測方法，所述方法包括:
[0034]I)制備抗鉛單克隆抗體；
[0035]2)將所述抗鉛單克隆抗體與納米磁珠通過共價鍵偶聯(lián)，制備抗鉛免疫納米磁珠；
[0036]3)向所述液體生物樣品中加入雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，進(jìn)行溫育，之后加入所述抗鉛免疫納米磁珠充分混合，之后進(jìn)行磁分離，向磁分離得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗體和鏈霉親和素化的量子點(QDs)，使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測。
[0037]10.根據(jù)9所述的方法，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠，其粒徑優(yōu)選為280nm。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1是本發(fā)明鉛免疫抗原紫外光譜圖，圖2是本發(fā)明鉛檢測抗原紫外光譜圖。從圖中可以看出吸收峰發(fā)生偏移，說明抗原合成成功。
[0039]圖3是本發(fā)明小鼠血清抗鉛效價，圖4是本發(fā)明小鼠血清抗鉛特異性。從圖中可以看出，小鼠血清抗鉛效價為32000，抗鉛的特異性為32000左右，表明小鼠免疫成功。
[0040]圖5是本發(fā)明抗鉛雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清液效價圖。從圖中看出我們篩選出了一株抗鉛特異性和效價均較高的細(xì)胞株。
[0041]圖6是本發(fā)明抗鉛雜交瘤細(xì)胞腹水效價圖。圖7是本發(fā)明抗鉛雜交瘤細(xì)胞腹水特異度圖。從圖中可以看出，小鼠雜交瘤細(xì)胞腹水抗鉛效價和特異度均能達(dá)到25600，說明腹水中存在特異性的抗鉛抗體。
[0042]圖8是純化后抗鉛單克隆抗體效價圖。從圖中可以看出，經(jīng)純化后的抗鉛單克隆抗體效價較高。
[0043]圖9是純化后抗鉛單克隆抗體凝膠電泳圖。從圖中可以看出純化后抗鉛單克隆抗體分子量為25KDa和50KDa，沒有異常條帶，純度較高。
[0044]圖10是納米磁珠與單克隆抗體反應(yīng)的示意圖。
【具體實施方式】[0045]通過以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的權(quán)利要求不僅限于實施例。
[0046]實施例1
[0047]l)Pb免疫抗原合成:將Pb (國家有色金屬及電子材料分析測試中心，GSB04-1742-2004)、雙功能螯合劑[(R) _2_硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)環(huán)己烷_1，2 二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA) (Macroyclics，美國)和血藍(lán)蛋白(KLH) (Sigma，美國，H7017)以及三乙胺(TEA)(國產(chǎn)分析純)按照 Pb:p-SCN-Bn-CHX_A "-DTPA:KLH: TEA=9:12:200:13 (ff/ff/ff/ff)的比例，25°C振蕩反應(yīng)22h ;使用PBS緩沖液洗滌反應(yīng)產(chǎn)物，并通過超濾管(30KD)濾掉未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；使用PBS緩沖液稀釋所獲得的Pb免疫抗原。
[0048]2) Pb 檢測抗原合成:將 Pb、p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，美國，A1933)和 TEA 按照 Pb:p-SCN-Bn-CHX_A " -DTPA:BSA: TEA=9:12:200:13 (ff/ff/ff/ff)的比例合成檢測抗原。Pb免疫抗原和Pb檢測抗原的光譜鑒定結(jié)果如圖1、2所示。
[0049]實施例2
[0050]抗Pb單克隆抗體(PbMAb)的制備與純化:
[0051 ] 將1.0mg/ml的Pb免疫抗原與等體積弗氏完全佐劑(FCA)，通過注射器雙推法充分混勻，使其形成白色油包水乳狀物，即抗原乳化齊U。使用多點免疫法，免疫6周齡雌性Balb/C小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，211)，每隔2周免疫I次，共免疫5次。在進(jìn)行第2、3、4次免疫時，將Pb免疫抗原與等體積弗氏不完全佐劑(FIA)混合，以同樣劑量加強(qiáng)免疫，在第5次免疫時,僅用Pb免疫抗原而不加佐劑。小鼠免疫后小鼠血清的效價與特異性如圖3-4所示。取抗血清效價最高的免疫小鼠制備脾細(xì)胞，按照參考文獻(xiàn)(Howard.G.C和Kaser.M.R的抗體制備與使用實驗指南[Μ].北京:科學(xué)出版社，2010)將脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KG075)融合，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，陽性率達(dá)到100%后將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。將陽性細(xì)胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水，評價腹水效價，結(jié)果如圖6、7所示。腹水分別使用飽和(NH4)2SO4沉淀法和Sephacry S-300柱層析法純化腹水中的PbMAb。將純化的抗體進(jìn)行效價檢測和凝膠電泳實驗，結(jié)果分別如圖8和9所示。
[0052]實施例3
[0053]抗Pb免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)制備:因為納米磁珠(Dynabeads?M-280Tosylactivated, lifetechnologies,美國，14203)背景值低，抗體與微珠表面共價連接，是使蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫沉淀的極佳選擇。微珠磁性聚集溫和而快速并且孵育耗時極短。因此納米磁珠選用.Dynabeads? M-280Tosylactivated,其粒徑為280nm。抗Pb免疫磁珠合成步驟如下:
[0054](I)取165 μ L納米磁珠,磁分離Imin,去除上清；
[0055](2)加入100 μ g抗鉛單克隆抗體和0.1M pH7.4的磷酸緩沖液反應(yīng)使體積變?yōu)?50 μ L，渦旋震蕩；
[0056](3)加 100 μ L3M (NH4) 2S040.1M ρΗ7.4 的磷酸緩沖液渦旋震蕩。
[0057](4) 37°C搖動孵化 12_18h ；
[0058](5)磁分離2min,去除上清；[0059](6)移除磁鐵，加入ImL0.5%BSA0.01M pH7.4的磷酸緩沖液，37°C搖動孵化Ih ；
[0060](7)磁分離2min,去除上清；
[0061](8)移除磁鐵，加入ImL0.1%BSA0.01M pH7.4的磷酸緩沖液，渦旋振蕩5_10s ；
[0062](9)磁分離2min,去除上清；
[0063](10)重復(fù)步驟 7-8 ；
[0064](11)用240 μ L0.1%BSA0.01M pH7.4的磷酸緩沖液重懸免疫磁珠。
[0065]納米磁珠與抗鉛單克隆抗體反應(yīng)原理如圖10所示。
[0066]實施例4
[0067]基于磁性分離和量子點標(biāo)記的鉛中毒的快速檢測方法:
[0068](I)向 0.1mL血樣中加入，13 μ 110 μ g/ml p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA、I μ 12.17mg/ml BSA 和 I μ 14.6Χ1θΛοΤΕΑ, 37°C搖床反應(yīng) 15min。
[0069](2)加入2 μ L抗Pb免疫磁珠反應(yīng)15min后磁分離2min。
[0070](3)加入4 μ L生物素化的BSA抗體(abeam,英國，ab7636)和I μ LlmM的鏈霉親和素化得量子點(Qdot?585Streptavidin Conjugate, lifetechnologies,美國，Q10113MP),37°C搖床反應(yīng)15min后磁分離2min。
[0071](4)用突光酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果檢測(Ex=405nm, Em=585nm)。
[0072]標(biāo)準(zhǔn)曲線測定:取健康人空白`血清100 μ L于200 μ L離心管中，加入不同濃度的鉛配制成濃度為l、10、100、500、1000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)血樣。按本發(fā)明的快速檢測方法處理，以濃度(C)對吸光度(OD)進(jìn)行線性回歸，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C=70.7830D-825.713，R=0.948。該檢測方法線性范圍為l-1000ng/ml,最低檢出限為lng/ml。
[0073]加標(biāo)回收率測定:將0.1mL病人血清(北京朝陽醫(yī)院職業(yè)病與中毒醫(yī)學(xué)中心)分別加入50ng Pb然后將其按照本發(fā)明的快速檢測方法處理后檢測，通過測得量與加入量的比值，計算加標(biāo)回收率。加標(biāo)回收率為94.97%—108.56%。
[0074]精密度測定:配制鉛低、中、高3種濃度的血清樣品，按照本發(fā)明的快速檢測方法處理，進(jìn)樣測定。I天內(nèi)平行操作5次，計算日內(nèi)精密度。結(jié)果如表1所示。
[0075]表1:血清中鉛含量測定精密度(n=5)

濃度(ng/mL) RSD(%)
I8.0%
[0076]
100 8.1%
1000_4.4%
[0077]取病人血樣(北京朝陽醫(yī)院職業(yè)病與中毒醫(yī)學(xué)中心)按照本發(fā)明的快速檢測方法進(jìn)行檢測與ICP/MS法對照評價準(zhǔn)確度，兩種方法的測定結(jié)果間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，顯示建立的方法準(zhǔn)確性可靠，結(jié)果如表2所示。
【權(quán)利要求】
1.用于液體生物樣品中鉛的快速檢測的試劑盒，所述試劑盒包含: 抗鉛免疫納米磁珠，所述抗鉛免疫納米磁珠通過將抗鉛單克隆抗體與納米磁珠經(jīng)由共價鍵偶聯(lián)制備； 雙功能螯合劑； 牛血清白蛋白(BSA)； 三乙胺(TEA)； 生物素化的BSA抗體；和 鏈霉親和素化的QDs。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述納米磁珠的粒徑為280nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述雙功能螯合劑是p-SCN-Bn-CHX-A" -DTPA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品選自尿液或血液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述液體生物樣品是血液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述抗鉛單克隆抗體利用鉛免疫抗原制備，所述鉛免疫抗原通過在三乙胺(TEA)的存在下將鉛、雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A " -DTPA)和血藍(lán)蛋白(KLH)混合來制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中用于所述QDs的激發(fā)波長=405nm，發(fā)射波長=585nm。
9.基于磁性分離和量子點(QDs)標(biāo)記的液體樣品中鉛的快速檢測方法，所述方法包括: 1)制備抗鉛單克隆抗體； 2)將所述抗鉛單克隆抗體與納米磁珠通過共價鍵偶聯(lián)，制備抗鉛免疫納米磁珠； 3)向所述液體生物樣品中加入雙功能螯合劑(優(yōu)選為p-SCN-Bn-CHX-A" -DTPA)、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，進(jìn)行溫育，之后加入所述抗鉛免疫納米磁珠充分混合，之后進(jìn)行磁分離，向磁分離得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗體和鏈霉親和素化的量子點(QDs)，使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述納米磁珠是Fe3O4納米磁珠，其粒徑優(yōu)選為280nm。
【文檔編號】G01N33/577GK103698527SQ201410014500
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】孫志偉, 黃沛力, 孫湖泊, 王萌萌, 王吉龍, 王暉, 郝鳳桐, 李惠玲 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)