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制備抗Lp（a）多克隆抗血清的方法及多克隆抗血清的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開(kāi)了一種制備高特異性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法，該方法包括采用Seq?ID?No.1所示序列的抗原通過(guò)動(dòng)物免疫制備獲得抗Lp（a）多克隆抗血清。本申請(qǐng)的制備高特異性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法克服了傳統(tǒng)方法的血漿來(lái)源困難、社會(huì)供給不足的問(wèn)題；并且，所制備的抗Lp（a）多克隆抗血清效價(jià)高，特異性強(qiáng)，不會(huì)與LDL或PLG發(fā)生交叉反應(yīng)，從而提高了Lp(a)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，為L(zhǎng)p(a)檢測(cè)的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】制備抗Lp (a)多克隆抗血清的方法及多克隆抗血清

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及免疫檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血 清的方法，以及有該方法制備的抗Lp (a)多克隆抗血清。

【背景技術(shù)】
[0002] 血漿脂蛋白按密度分為四大類：乳糜微粒（縮寫(xiě)，CM)、極低密度脂蛋白（縮寫(xiě)， VLDL)、低密度脂蛋白（縮寫(xiě)，LDL)和高密度脂蛋白（縮寫(xiě)，HDL)。同時(shí)，在血漿中還存在一 類特殊的脂蛋白：脂蛋白（a)(縮寫(xiě)，Lp(a))，它是一個(gè)獨(dú)立的脂蛋白系統(tǒng)。Lp(a)的脂質(zhì)成 分與LDL相似，主要由膽固醇脂和甘油三酯組成，表面被覆一層磷脂和游離膽固醇，甘油三 酯的組份大于LDL，Lp(a)與LDL均是膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白的底物。Lp(a)含有兩類載脂蛋白： ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，前者與LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，ΑροΒΙΟΟ上有LDL受體結(jié)合位點(diǎn)；后者是 Lp (a)的獨(dú)特載脂蛋白，ΑροΒ 100和Apo (a)通過(guò)1至2個(gè)二硫鍵共價(jià)相連。
[0003] 從Apo (a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通過(guò)兩兩之間的大約30個(gè)氨 基酸的中間序列依次相連。除最靠近C端的Kringle域與纖溶酶原中的Kringle5同源外， 其余Kringle域均與纖溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名為Kringle IV 1?10型； 需要說(shuō)明的是，人類Apo (a)與人纖維蛋白溶酶原（英文名，Plasminogen.縮寫(xiě)，PLG)在DNA 和蛋白質(zhì)水平均存在80%的同源性，從而具有共同的抗原決定簇，呈免疫交叉反應(yīng)。在所有 這10型的Kringle IV中，不同個(gè)體的Kringle IV 2型的串聯(lián)重復(fù)數(shù)一般在3?43之間變 化，因此Apo (a)的分子量也就在250?838kD的范圍中變化，其體積與分子量在相同的個(gè) 體內(nèi)或不同的個(gè)體間都具有較大的差異，因其這種特性，決定了 Lp(a)在不同的個(gè)體間具 有較大的差異。Kringle IV 9型中有7個(gè)半胱氨酸，其中未參與分子內(nèi)二硫鍵的第4057位 半胱氨酸（縮寫(xiě)，Cys4057)與載脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸（縮寫(xiě)，Cys4326)形 成分子間二硫鍵，進(jìn)而組成完整的Lp (a)。
[0004] Lp(a)是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是冠心?。–HD)、心肌梗塞（MI)、腦卒中、 動(dòng)脈重新狹窄的危險(xiǎn)因子。另外，Lp (a)水平可作為慢性腎功能衰竭合并心腦血管病及血栓 形成的預(yù)示指標(biāo)。Lp(a)的血清水平受遺傳因素的高度影響，個(gè)體差異很大，主要由Apo(a) 基因決定，因種族而異，與性別、年齡無(wú)關(guān)，不易受環(huán)境，生活方式和一般降脂藥物的干擾， 僅能夠被腎衰、急性免疫反應(yīng)輕微影響。一般把人血清Lp (a)正常值定為<300mg/L。因此， Lp (a)的檢測(cè)對(duì)臨床分析和病理分析具有重要的參考價(jià)值。
[0005] 目前，已知的檢測(cè)Lp (a)濃度的方法有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫測(cè)定法 和免疫比濁法，以上免疫檢測(cè)方法均需要特異性強(qiáng)的Lp(a)抗血清/抗體作為核心原料。目 前基本上都是采用提純?nèi)搜宓姆椒ㄖ苽涿庖咴璍p (a)或Apo (a)，即利用超高速離心機(jī)通 過(guò)密度梯度離心制取Lp (a)，或者利用SDS-PAGE電泳分離獲得Apo (a)抗原；再利用抗原免 疫動(dòng)物獲得抗血清。如前面分析，因?yàn)長(zhǎng)p (a)含有兩類載脂蛋白：ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，其中 ΑροΒΙΟΟ與LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，所以利用Lp (a)作為免疫原制備的抗血清會(huì)與LDL存在免 疫交叉反應(yīng)。而利用Apo (a)作為免疫原，因Apo (a)的氨基酸結(jié)構(gòu)與PLG很相似，而PLG是 一種以較高濃度存在于人血液中的蛋白質(zhì)，因此，利用Apo (a)作為免疫原制得的抗血清會(huì) 因與PLG發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，無(wú)論是Lp (a)還是Apo (a)作為抗原制備的抗血清都無(wú)法準(zhǔn) 確地測(cè)定Lp (a)含量。并且，采用提純?nèi)搜宓姆椒ㄖ苽涿庖咴璍p (a)或Apo (a)所需血漿 來(lái)源困難、社會(huì)供給不足；制備的抗血清不僅會(huì)與LDL或PLG有交叉反應(yīng)，特異性較差；而 且，抗血清的效價(jià)也不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請(qǐng)的目的是提供一種制備抗Lp (a)多克隆抗血清的方法，以及由該方法制備 的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本申請(qǐng)的一方面公開(kāi)了一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆 抗血清的方法，該方法包括采用Seq ID No. 1所示序列的抗原通過(guò)動(dòng)物免疫制備獲得所述抗 Lp (a)多克隆抗血清。
[0008] 優(yōu)選的，動(dòng)物免疫包括選擇青壯年時(shí)期并對(duì)Apo(a)易感的山羊或兔子，以濃度為 l-5mg/mL的Seq ID No. 1所示序列的抗原進(jìn)行多點(diǎn)多次免疫，直至抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期值后， 頸動(dòng)脈放血提取純化本申請(qǐng)的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0009] 優(yōu)選的，Seq ID No. 1所不序列的抗原為提純的克隆表達(dá)的融合蛋白；克隆表達(dá)具 體包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插入片段構(gòu)建質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化 和融合蛋白表達(dá)，然后提純獲得Seq ID No. 1所不序列的抗原。
[0010] 進(jìn)一步的，Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增具體包括 采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的引物，以LPA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò) 增。
[0011] 本申請(qǐng)的另一面還公開(kāi)了本申請(qǐng)的制備方法制備的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0012] 本申請(qǐng)的再一面還公開(kāi)了一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血清的抗原，該 抗原含有Seq ID No. 1所不序列；并且，該抗原為提純的克隆表達(dá)的融合蛋白；其中，克隆表 達(dá)具體包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插入片段構(gòu)建質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行 轉(zhuǎn)化和融合蛋白表達(dá)，然后提純獲得抗原。
[0013] 優(yōu)選的，Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增具體包括 采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的引物，以LPA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò) 增。
[0014] 本申請(qǐng)的再一面還公開(kāi)了本申請(qǐng)的抗Lp (a)多克隆抗血清，和本申請(qǐng)的抗原在 Lp (a)檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0015] 本申請(qǐng)的再一面還公開(kāi)了一種檢測(cè)Lp(a)濃度的方法，該述方法包括采用本申請(qǐng) 的抗Lp (a)多克隆抗血清，進(jìn)行酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫測(cè)定法和免疫比濁法中 的至少一種。
[0016] 本申請(qǐng)的再一面還公開(kāi)了一種用于Lp (a)檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒中含有本申請(qǐng) 的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0017] 由于采用以上技術(shù)方案，本申請(qǐng)的有益效果在于：
[0018] 本申請(qǐng)的制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法克服了傳統(tǒng)方法的血漿 來(lái)源困難、社會(huì)供給不足的問(wèn)題；并且，所制備的抗Lp (a)多克隆抗血清效價(jià)高，特異性強(qiáng)， 不會(huì)與LDL或PLG發(fā)生交叉反應(yīng)，從而提高了 Lp (a)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和有效性，為L(zhǎng)p (a)檢測(cè) 的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中克隆片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中Μ為marker，l和2為 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品；
[0020] 圖2 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中收集的融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖，其中marker為 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)，apo (a)為受檢樣品；
[0021] 圖3 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中收集的融合蛋白的WESTERN-BLOT分析結(jié)果圖，其中 marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)，apo (a)為受檢樣品；
[0022] 圖4 :是本申請(qǐng)實(shí)施例中融合蛋白純化后再次進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)的結(jié)果圖，其中A 為電泳結(jié)果圖，B為基于電泳結(jié)果的數(shù)值分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 本申請(qǐng)采用的抗原針對(duì)性的制備出了僅能與Lp (a)進(jìn)行免疫反應(yīng)的抗Lp (a)多 克隆抗血清，該抗Lp (a)多克隆抗血清不會(huì)與LDL和PLG存在免疫交叉反應(yīng)。只要采用本 申請(qǐng)的抗原即可獲得本申請(qǐng)的特異性強(qiáng)的效果，可以理解，抗原的獲取方法有很多種，而本 申請(qǐng)的一種優(yōu)選方案是，克隆表達(dá)融合蛋白，提取所需抗原，這種方法獲得的抗原純度高， 針對(duì)性強(qiáng)。而獲得克隆表達(dá)融合蛋白的方法是將外源片段插入到載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化表達(dá)，可 以理解，外源插入片段同樣可以采用化學(xué)合成或者直接從基因組中提取或者采用PCR擴(kuò)增 獲得，本申請(qǐng)的優(yōu)選方案中，采用PCR擴(kuò)增獲得外源插入片段；為此，本申請(qǐng)還特別設(shè)計(jì)了 特異性的引物。
[0024] 本申請(qǐng)中，在動(dòng)物免疫時(shí)采用多點(diǎn)多次免疫，使抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期值后再提取純 化，從而使得制備的抗Lp (a)多克隆抗血清效價(jià)高，能夠很好的滿足使用要求。其中，多點(diǎn) 多次免疫是指，分多次對(duì)免疫動(dòng)物的背部、頸部、腋窩皮下結(jié)合皮內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射；抗體效 價(jià)達(dá)到預(yù)期值是指根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，預(yù)期達(dá)到的效價(jià)，這是根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)定的， 在此不作具體限定，比如期望制備出更高效價(jià)的抗Lp (a)多克隆抗血清，則抗體效價(jià)預(yù)期 值可以高些，對(duì)免疫動(dòng)物多進(jìn)行幾次注射，不過(guò)，需要注意的是效價(jià)并不是無(wú)限次增加的。
[0025] 本申請(qǐng)的一個(gè)關(guān)鍵在于采用克隆表達(dá)方法獲得高效、準(zhǔn)確的抗原，從而制備出高 特異性的抗血清。為了使用方便，本申請(qǐng)進(jìn)一步的，將本申請(qǐng)的高特異性的抗Lp (a)多克 隆抗血清制備成便于保存的固體或高濃度溶液，從而制備成試劑盒以方便Lp (a)免疫檢測(cè) 使用。
[0026] 需要說(shuō)明的是，雖然克隆表達(dá)的原理是已知的，并且，克隆表達(dá)制備抗原在多克隆 抗體制備中的應(yīng)用也是蛋白免疫檢測(cè)領(lǐng)域比較常用的；但是，目前并沒(méi)有采用克隆表達(dá)方 法制備抗Lp (a)多克隆抗血清的研究，至少，這方面的研究不甚理想；正是如此，本申請(qǐng)為 了填補(bǔ)該漏洞，通過(guò)對(duì)Lp (a)蛋白基因進(jìn)行研究，創(chuàng)造性的基于LPA基因設(shè)計(jì)了特異性引 物，通過(guò)該特異性引物構(gòu)建可用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清制備的質(zhì)粒，從而制備出特 異性強(qiáng)、效價(jià)高的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0027] 本申請(qǐng)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于所選擇的克隆片段以及特異性的引物序列，可以理解， 對(duì)于本申請(qǐng)的用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，插入片段是其重點(diǎn)，因此，理論 上實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的原核表達(dá)載體，比如PET系列載體、pGEM-T系列載體等都適用于本申 請(qǐng)；本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中選擇的是pet28a+。
[0028] 另外，在進(jìn)行轉(zhuǎn)化、表達(dá)的過(guò)程中，同樣，目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的原核表達(dá)細(xì)胞，如 大腸桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈霉菌等都適用于本申請(qǐng)，其中，大腸桿菌中常 規(guī)使用的HB101，BL21，JM109和DH5a等也可以用于本申請(qǐng)的融合蛋白表達(dá)。當(dāng)然，原核 表達(dá)細(xì)胞的選擇要和選擇的載體相符。另外，可以理解，除了可以采用原核表達(dá)細(xì)胞體系以 夕卜，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的真核細(xì)胞表達(dá)體系同樣適用于本申請(qǐng)，比如釀酒酵母、畢赤巴斯德酵 母等。
[0029] 下面通過(guò)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅僅對(duì) 本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0030] 一、材料與方法
[0031] 1、載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
[0032] (1)引物設(shè)計(jì)
[0033] 經(jīng)過(guò)大量的分析，本申請(qǐng)以人LPA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，選取基因序列號(hào)： NM_005577. 2, X06290. 1的序列中第12050-12990位片段，共941bp的片段進(jìn)行克隆表達(dá)，并 設(shè)計(jì)其特異性引物，引物序列如表1所示。所設(shè)計(jì)的引物在生物試劑公司合成。
[0034] 表1用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的引物

【權(quán)利要求】
1. 一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法，其特征在于：所述方法包括采 用Seq ID No. 1所示序列的抗原通過(guò)動(dòng)物免疫制備獲得所述抗Lp (a)多克隆抗血清。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述動(dòng)物免疫包括選擇青壯年時(shí)期并對(duì) Apo(a)易感的山羊或兔子，以濃度為l-5mg/mL的所述抗原進(jìn)行多點(diǎn)多次免疫，直至抗體效 價(jià)達(dá)到預(yù)期值后，頸動(dòng)脈放血提取純化所述抗Lp (a)多克隆抗血清。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Seq ID No. 1所示序列的抗原為 提純的克隆表達(dá)的融合蛋白；所述克隆表達(dá)包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插 入片段構(gòu)建質(zhì)粒，將所述質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化和融合蛋白表達(dá)，然后提純獲得所述Seq ID No. 1所 示序列的抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增包括采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的 引物，以LPA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法制備的抗Lp (a)多克隆抗血清。
6. -種制備高特異性的抗Lp(a)多克隆抗血清的抗原，其特征在于：所述抗原含有Seq ID No. 1所示序列；所述抗原為提純的克隆表達(dá)的融合蛋白；所述克隆表達(dá)包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插入片段構(gòu)建質(zhì)粒，將所述質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化和融合蛋白表達(dá)，然 后提純獲得抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原，其特征在于：所述Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為 PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，所述PCR擴(kuò)增包括采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的 引物，以LPA基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗Lp (a)多克隆抗血清或者權(quán)利要求6或7所述的抗原在 Lp (a)檢測(cè)中的應(yīng)用。
9. 一種檢測(cè)Lp (a)濃度的方法，其特征在于：所述方法包括采用權(quán)利要求5所述的抗 Lp (a)多克隆抗血清，進(jìn)行酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、熒光免疫測(cè)定法和免疫比濁法中的至 少一種。
10. -種用于Lp (a)檢測(cè)的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權(quán)利要求5所述的 抗Lp (a)多克隆抗血清。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104059144SQ201410085889
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】謝桂華, 柴寶玲 申請(qǐng)人:深圳市寶凱侖科技有限公司