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基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器。為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檢測氨芐青霉素的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題。一種基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器，在電極上依次修飾有capture probe層、HAP和MB probe層。制備方法：對電極進(jìn)行預(yù)處理；將capture probe層修飾到電極表面；將HAP和MB probe層修飾到電極表面。利用了核酸適配體的特異型識別，利用氨芐青霉素的適體作為識別物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物氨芐青霉素的高特異性檢測；利用聚合酶的聚合作用，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，起到了信號放大的作用。
【專利說明】基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器，還涉及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]氨芐青霉素是一種廣譜半合成青霉素，抗菌譜與青霉素相似。現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中來治療細(xì)菌感染。他可以有效的治療很多細(xì)菌，例如:流感嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌等。然而在畜牧業(yè)中濫用氨芐青霉素造成的食品和農(nóng)產(chǎn)品中的藥物殘留以及由于這些殘留引發(fā)的疾病，如:過敏反應(yīng)，呼吸困難和癲癇發(fā)作等。因此，確定食品及農(nóng)產(chǎn)品中的氨芐青霉素的殘留量已經(jīng)變得至關(guān)重要。目前包括美國食品和藥物管理局(FDA)，食品添加劑聯(lián)合委員會(JECFA)，日本健康與福利等機(jī)構(gòu)都建立了確定食品中氨芐青霉素是否超標(biāo)的檢測體系。
[0003]目前，主要用來檢測氨芐青霉素的方法包括微生物法和高效液相色譜法(HPLC)。但是這兩種方法都存在自身不可避免的缺點(diǎn)與限制。微生物分析法的特異性和靈敏度都比較低，而HPLC需要較為昂貴的樣品預(yù)處理。因此，目前急需建立一種快速，準(zhǔn)確，靈敏且高特異性的檢測方法來檢測食品中氨芐青霉素的殘留。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檢測氨芐青霉素的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器。還涉及其制備方法
本發(fā)明還提供了基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器的制備方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
本發(fā)明中一共用到了 3條DNA鏈，其序列分別是:
HAP: 5’ -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3>
MB probe: 5， -Methylene blue_GCGGGCGAAC_3，
capture probe: 5’ -GTTCGCCCGC-SH-3’
其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列HAP中，5’端畫橫線的部分為目標(biāo)物氨芐青霉素的適配體，可以與目標(biāo)物特異性的識別并緊密結(jié)合。由于該鏈兩端的堿基是完全互補(bǔ)的，因此可以雜交形成穩(wěn)定的發(fā)夾形二級結(jié)構(gòu)。
[0006]MB probe的5’端修飾有亞甲基藍(lán)，他可以一定的電位下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，我們就是通過檢測該氧化還原信號來達(dá)到定量的檢測目標(biāo)物的目的。
[0007]capture probe的3’端修飾有巰基(_SH),可以與金電極形成穩(wěn)定的Au-S鍵,從而將capture probe固定在電極表面。
[0008]本發(fā)明中用到了兩種酶:Phi 29 DNA聚合酶和Nt.AlwI內(nèi)切酶。Phi 29 DNA聚合酶同時具有鏈延伸和置換功能，核酸內(nèi)切酶可以在特異性位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對DNA雙鏈的特異性切割，其特異性的切割識別序列是:GGATCNNNNN，切割位點(diǎn)是最后兩個堿基之間。
[0009]本發(fā)明中氨芐青霉素的檢測是在均相溶液中實(shí)現(xiàn)的，通過兩步循環(huán)的方式來實(shí)現(xiàn)信號的放大，從而實(shí)現(xiàn)氨芐青霉素的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。
[0010]均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有:發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA中有目標(biāo)物的適配體，在有目標(biāo)物存在的情況下，該適配體序列能夠特異性的識別目標(biāo)物并與之結(jié)合，發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，從而將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈打開。此時均相中的MB probe就可以與打開的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’端發(fā)生互補(bǔ)配對，從而將MB probe與HAP固定到一起。此時在Phi 29 DNA聚合酶與dNTP的共同作用下，以發(fā)夾DNA為模板、以MB probe為引物發(fā)生鏈延長,最后長成一條完全雜交互補(bǔ)的雙鏈，并釋放目標(biāo)物。此時目標(biāo)物成游離的狀態(tài)，并可進(jìn)一步結(jié)合別的為打開的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)第一次循環(huán)放大，即目標(biāo)物誘導(dǎo)的循環(huán)放大。在第二步循環(huán)放大中，利用了第一步產(chǎn)生的雜交雙鏈，因?yàn)樵撴溨泻泻怂醿?nèi)切酶Nt.AlwI的識別切割位點(diǎn)，形成的雙鏈可以被特異性的識別并切割，切斷相鄰兩個堿基之間的磷酸二酯鍵。由于本發(fā)明中使用的聚合酶Phi 29 DNA具有鏈置換功能。因此在聚合酶與dNTP的共同作用下，被核酸內(nèi)切酶切割的鏈會以原有的鏈為模板，繼續(xù)生長成新的雜交雙鏈，從而替換下amplificat1n probe (酶切循環(huán)放大):5’-GTTCGCCCGC-3’單鏈。該酶切循環(huán)放大探針的序列與MB probe完全互補(bǔ)，因?yàn)榭梢孕纬呻s交的雙鏈。而經(jīng)過鏈置換生成的新的雙鏈中又包含了新的內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)，從而繼續(xù)新一輪的循環(huán)放大，即第二步的循環(huán)放大。
[0011]在均相反應(yīng)中，兩步放大的反應(yīng)條件均為37°C，反應(yīng)時間是2h。
[0012]一種基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器，在電極上依次修飾有capture probe 層、HAP 和 MB probe 層；
capture probe 層中 capture probe:為 5，-GTTCGCCCGC-SH-3，；
HAP和MB probe層中含有HAP、MB probe、聚合酶、核酸內(nèi)切酶和dNTP，
HAP 為 5’ -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3>
MB probe 為 5， -Methylene blue-GCGGGCGAAC-3，。
[0013]所述的生物傳感器，capture probe層的厚度大約為10±2nm、HAP和MB probe層的厚度約為15±2nm。
[0014]所述的生物傳感器，HAP和MB probe層中HAP (摩爾)、MB probe (摩爾)、聚合酶(活性)、核酸內(nèi)切酶(活性)和dNTP (活性)的摩爾與活性的比為1:1:250:250:250。
[0015]所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)對電極進(jìn)行預(yù)處理；
(2)將captureprobe層修飾到電極表面；
(3)將HAP和MBprobe層修飾到電極表面。
[0016]所述的制備方法,優(yōu)選將capture probe層修飾到電極表面的操作步驟如下:將10 μ M的capture probe 10 μ L滴加到經(jīng)過預(yù)處理的電極表面,在25°C下孵育2h。
[0017]所述的制備方法，優(yōu)選將HAP和MB probe層修飾到電極表面的操作步驟如下:
(1)將滅菌水，10X的buffer緩沖液、HAP和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中孵育2h ；
(2)向離心管中加入MBprobe、聚合酶、核酸內(nèi)切酶和dNTP，震蕩30s，放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
(3)將孵育好的混合溶液滴加到修飾好capture probe層的電極上，將電極繼續(xù)放在37 0C的恒溫箱中孵育2h，清洗。
[0018]所述的制備方法，優(yōu)選對電極進(jìn)行預(yù)處理操作為電極在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水沖洗。
[0019]所述的制備方法，優(yōu)選所述電極為金電極。
[0020]該發(fā)明的檢測方式是電化學(xué)檢測，利用傳統(tǒng)的三電極體系。Ag/AgCl為參比電極，鉬絲為對電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過Au-S鍵將capture probe固定到電極表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液修飾到電極表面，然后在37°C孵育2h使均相中的MB probe與電極表面的capture probe完成雜交反應(yīng),從而將MB probe固定到電極表面。然后用三電極工作體系檢測MB的氧化還原峰。以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為O到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號的變化，檢測待測目標(biāo)物。
[0021]本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，具有鏈置換功能的DNA聚合酶的鏈延伸和置換作用，核酸內(nèi)切酶在特異性位點(diǎn)對核酸鏈的切割作用以及亞甲基藍(lán)的氧化還原特性構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)氨芐青霉素現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
1、利用了核酸適配體的特異型識別，利用氨芐青霉素的適體作為識別物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物氨芐青霉素的高特異性檢測；
2、利用聚合酶的聚合作用，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的循環(huán)利用，起到了信號放大的作用；
3、利用核限制性核酸內(nèi)切酶對特異性序列的識別和切割作用，結(jié)合聚合酶的鏈置換作用，實(shí)現(xiàn)了第二步循環(huán)放大。信號的兩次循環(huán)放大實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物的高敏檢測，提高了檢測的靈敏度；
4、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快；
5、由于使用金電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用；
6、檢測原理的主要過程均是在均相中實(shí)現(xiàn)的，提高的反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡單，靈敏的檢測；
7、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復(fù)性好，適用于食品安全中氨芐青霉素的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用；
8、制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為該實(shí)驗(yàn)的原理圖；
圖2為實(shí)施例1 HAP濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；
圖3為實(shí)施例2 MB probe濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；
圖4為實(shí)施例3 capture probe濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；
圖5為實(shí)施例4檢測不同濃度目標(biāo)物的DPV圖；
圖6為基于圖5做的該生物傳感器的工作曲線，該圖的橫坐標(biāo)為目標(biāo)物的濃度，縱坐標(biāo)為檢測的電流值。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0025]實(shí)施例1
電極修飾過程的主要步驟如下:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；
b、將10μL的capture probe( 10 μ Μ)滴加到電極表面,在室溫下(25°C )孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟:
a、將滅菌水，1X的緩沖液(buffer)，Iμ L發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈(濃度分別為20 μ Μ，10 μ Μ, 5 μ Μ, 2 μ Μ, I μ Μ)和目標(biāo)物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
b、繼續(xù)向a步的離心管中加入MBprobe (10 μ M)，聚合酶(I μ L)，核酸內(nèi)切酶(I μ L)和dNTP (I μ L)。震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應(yīng)后的溶液(10μ L)滴加到預(yù)先修飾好capture probe的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 1:的恒溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0026]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為O到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號的變化，檢測目標(biāo)物。
[0027]結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著HAP的濃度在0-10μΜ區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10 μ M后，電流趨于穩(wěn)定。所以HAP的最佳濃度為10 μ Mo
[0028]上述過程中用到的溶液的制備方法:
1、PBS 緩沖液是由方法配制=Na2HPO4 (1mM), NaH2PO4 (1mM), NaCl (140mM), KCl(ImM)，MgCl2 (ImM), CaCl2 (ImM),最終溶液的 pH 值為 7.4。
[0029]2、10X的緩沖液(buffer)是隨聚合酶一起買來的,可直接使用。
[0030]3、配置的PBS緩沖液與超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將PBS和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120°C的溫度下滅菌20 min。
[0031]實(shí)施例2
一種本發(fā)明所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法:
電極修飾過程的主要步驟如下:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；
b、將10μ L的capture probe (10 μ Μ)滴加到電極表面,在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟:
a、將滅菌水，1X的緩沖液(buffer)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈(10μ Μ)和目標(biāo)物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
b、繼續(xù)向a步的離心管中加入Iμ L不同濃度的MB probe (濃度分別是20 μ M, 10 μ Μ,5 μ Μ，2 μ Μ，I μ Μ)，聚合酶(I μ L)，核酸內(nèi)切酶(I μ L^PdNTP (IyL)0震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應(yīng)后的溶液(10μ L)滴加到預(yù)先修飾好capture probe的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 1:的恒溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0032]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為O到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號的變化，檢測目標(biāo)物。
[0033]結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著MB probe的濃度在0-10 μ M區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10 μ M后，電流趨于穩(wěn)定。所以MB probe的最佳濃度為10 μ Μ。
[0034]實(shí)施例3
一種本發(fā)明所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；
b、將10 μ L 的不同濃度的 capture probe (20 μ M，10 μ M，5 μ M，2 μ M，I μ Μ)滴力口至Ij電極表面，在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟:
a、將滅菌水，10X的緩沖液(buffer)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈(10μ Μ)和目標(biāo)物加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
b、繼續(xù)向a步的離心管中加入MBprobe (10 μ M)，聚合酶(I μ L)，核酸內(nèi)切酶(I μ L)和dNTP (I μ L)。震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應(yīng)后的溶液(10μ L)滴加到預(yù)先修飾好capture probe的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 1:的恒溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0035]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為O到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號的變化，檢測目標(biāo)物。
[0036]結(jié)果見圖4,從圖中可以看出，檢測到的電流信號隨著capture probe的濃度在0-10 μ M區(qū)間內(nèi)增大而增大，當(dāng)濃度超過10 μ M后，電流趨于穩(wěn)定。所以capture probe的最佳濃度為10 μ M0
[0037]實(shí)施例4
一種本發(fā)明所述電化學(xué)生物傳感器的制備方法:
a、金電極首先在0.3和0.05 --m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗；
b、將10μ L的capture probe (10 μ Μ)滴加到電極表面,在室溫下孵育2h。通過Au-S鍵將巰基鏈固定到電極表面；
至此電極的修飾過程先告一段落，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟:
a、將滅菌水，1X的緩沖液(buffer)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈(10μ Μ)和I μ L不同濃度的目標(biāo)物(ΙΟΟρΜ，500pM, InM, 5nM, 1nM, 50nM, 10nM, 500nM, I μ M)加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的離心管中。震蕩30s，然后將混勻的混合液放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
b、繼續(xù)向a步的離心管中加入MBprobe (10 μ M)，聚合酶(I μ L)，核酸內(nèi)切酶(I μ L)和dNTP (I μ L)。震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37°C的恒溫箱中孵育2h ；
C、將b步反應(yīng)后的溶液(10μ L)滴加到預(yù)先修飾好capture probe的電極上。然后將電極繼續(xù)放在37 1:的恒溫箱中孵育2h ；
d、用磁力攪拌器在PBS溶液中清洗電極，每次lOmin，共清洗3次。
[0038]以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為O到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號的變化，檢測目標(biāo)物。
[0039]檢測結(jié)果如圖5所示，a到i為待測目標(biāo)位濃度分別為10pM (IX 10_16 mol，括號中為待測目標(biāo)物的實(shí)際的量)，500pM(5Xl(T16 mol),lnM(lX10_15 mol), 5nM(5X 10_15 mol),1nM (I X 1(T14 mol), 50nM (5X 1(T14 mol), 10nM (I X 1(T13 mol), 500ηΜ (5X 1(Γ13 mol)，I μ M(1Χ10_12 mol)。圖中我們可以看到，在氨芐青霉素的濃度在10pM到I μΜ時，氨芐青霉素濃度的對數(shù)與電流大小成正比關(guān)系，擬合曲線:1=0.887+0.38IgC (I是電流，C是氨芐青霉素的濃度)，同時，我們在10pM的濃度基礎(chǔ)上繼續(xù)向更低的濃度檢測，經(jīng)檢測當(dāng)濃度低于10pM時，電流與濃度的關(guān)系恰好不再符合擬合曲線規(guī)律，即圖中的電流最低點(diǎn)因此可得到該方法的檢測下限為lX10_16mol。
[0040]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于核酸適配體檢測氨芐青霉素的生物傳感器，其特征在于在電極上依次修飾有 capture probe 層、HAP 和 MB probe 層；
capture probe 層中 capture probe:為 5，-GTTCGCCCGC-SH-3，； HAP和MB probe層中含有HAP、MB probe、聚合酶、核酸內(nèi)切酶和dNTP，
HAP 為 5， -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3，
MB probe 為 5， -Methylene blue-GCGGGCGAAC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于captureprobe層的厚度為10±2nm、HAP 和 MB probe 層的厚度為 15±2nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于HAP和MBprobe層中HAP、MBprobe、聚合酶、核酸內(nèi)切酶和dNTP的摩爾活性比為I:1:250:250:250。
4.一種權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的生物傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)對電極進(jìn)行預(yù)處理； (2)將captureprobe層修飾到電極表面； (3)將HAP和MBprobe層修飾到電極表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于將captureprobe層修飾到電極表面的操作步驟如下:將10 μ M的capture probe 10 μ L滴加到經(jīng)過預(yù)處理的電極表面,在25°C下孵育2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于將HAP和MBprobe層修飾到電極表面的操作步驟如下: (1)將滅菌水，1X的buffer緩沖液、HAP和待測目標(biāo)物加入離心管中，震蕩30s，放入37 °C的恒溫箱中孵育2h ； (2)向離心管中加入10μΜ的MBprobe、l μ L的聚合酶、I μ L的核酸內(nèi)切酶和IyL的dNTP，震蕩30s，放入37°C的恒溫箱中孵育2h ； (3)將孵育好的混合溶液滴加到修飾好captureprobe層的電極上，將電極繼續(xù)放在37 0C的恒溫箱中孵育2h，清洗。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述電極為金電極。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為O到-0.5 V，脈沖寬度0.05V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號的變化，檢測待測目標(biāo)物。
【文檔編號】G01N33/573GK104459130SQ201410504740
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】黃加棟, 王虹智, 王玉, 劉素, 崔敏, 李 杰, 徐偉, 郭玉娜, 許穎, 崔杰, 邱婷婷 申請人:濟(jì)南大學(xué)