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一種己烯雌酚快速檢測卡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種己烯雌酚快速檢測卡,屬于農(nóng)產(chǎn)品違禁物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的己烯雌酚快速檢測卡，包括外殼，測試條，檢測窗孔，加樣孔，支承背板，硝酸纖維素膜，熒光素顆粒膜，樣品墊，吸水膜，檢測帶和質(zhì)控帶,檢測帶含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；質(zhì)控帶含肌動蛋白。本發(fā)明的檢測己烯雌酚具有敏度高、精確定量、特異性強、簡單方便和檢測時間短的優(yōu)點。
【專利說明】一種己烯雌酚快速檢測卡
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種己烯雌酚快速檢測卡，是一種檢測己烯雌酚的檢測器具，屬于農(nóng)產(chǎn)品違禁物質(zhì)的檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]天然雌激素主要包括雌二醇、雌酮、雌三醇，而合成雌激素主要有己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚等，在農(nóng)業(yè)中主要用作口服避孕藥和家畜生長的同化激素，通過增強食欲、抑制發(fā)情、提高飼料轉(zhuǎn)化率和控制性別等作用，能達到大幅度地提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟效益的目的，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中雌激素污染殘留呈上升趨勢。農(nóng)產(chǎn)品中的雌激素可以通過擾亂內(nèi)分泌、免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)的正常功能而對動物和人產(chǎn)生多種疾病，最主要表現(xiàn)在對生殖系統(tǒng)的影響:女性多出現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤，卵巢癌、乳腺癌等疾病。男性多出現(xiàn)睪丸癌、前列腺癌、精子的數(shù)量與質(zhì)量下降等癥狀。
[0003]外源雌激素在環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中含量很少(動物肌肉組織中類固醇激素以ng *kg-l到μ g.kg-1數(shù)量級存在)，加上本身化學性質(zhì)差異較大以及內(nèi)源性雌激素的影響，因此對檢測方法的靈敏度要求較高。目前用于農(nóng)產(chǎn)品中性激素檢測的方法主要包括儀器分析法、生物活性法和免疫分析法。
[0004]儀器分析法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，已被廣泛用于雌激素類等的測定。儀器分析法靈敏度高，能較準確地定性定量，是實驗室進行確證的標準方法。但該方法儀器成本較高，分析時間較長、操作較復(fù)雜，因此只適合實驗室確證用，并不適合基層普查使用。免疫層析技術(shù)具有成本低、速度快，特異性高等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于傳染病診斷、生殖生育監(jiān)測、藥物濫用等領(lǐng)域。雖然免疫層析具有如此吸引人的優(yōu)點，但其應(yīng)用也受到了一定限制，主要是因為目前在免疫層析中應(yīng)用的主要標記物是膠體金，一般通過肉眼觀察進行判斷結(jié)果，因此靈敏度不夠高，也無法進行準確定量。因此對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中含量很低的雌激素己烯雌酚測定來說，普通的膠體金免疫層析很難達到靈敏度及定量的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能檢測己烯雌酚的檢測器具，直接應(yīng)用免疫學的方法檢測樣品中己烯雌酚的含量，克服現(xiàn)有色譜法檢測的操作繁瑣等缺點，建立基于免疫學特異性的高靈敏度的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種己烯雌酹快速檢測卡，其為在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼中設(shè)置測試條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；測試條是由支承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、熒光素顆粒膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成；支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣品墊，吸水膜內(nèi)端與樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段熒光素顆粒膜；熒光素顆粒膜為含抗己烯雌酚抗體熒光素顆粒和熒光素顆粒標記的抗肌動蛋白抗體包被的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是:含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶，含肌動蛋白質(zhì)控帶，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0007]采用上述己烯雌酚快速檢測卡，檢測樣品為環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品等，處理方法如下: 產(chǎn)品樣品粉碎后加入適量的甲基叔丁基醚，垂直振蕩15 m i η，于4 °C、1 O O O r P m離心
15min，取上清，氮氣吹干，使用含10%甲醇的PBS緩沖液溶解，混勻即得待測樣品。
[0008]熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素顆粒、四甲基異硫氰酸羅丹明顆粒、四乙基羅丹明顆?；蛟寮t蛋白顆粒。
[0009]在樣品吸收墊上滴加樣品，如果樣品中有己烯雌酚，則己烯雌酚經(jīng)層析作用移動到熒光素顆粒膜的時候就會和熒光素顆粒標記的抗己烯雌酚抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并帶動熒光素顆粒標記的質(zhì)控抗體一起在層析作用下上行。當移動到檢測帶時，未被樣品中己烯雌酚結(jié)合的游離的熒光素顆粒標記的抗己烯雌酚抗體就會和檢測帶上的偶聯(lián)在載體蛋白上的己烯雌酚結(jié)合，而有熒光信號。熒光素標記的質(zhì)控抗體則被質(zhì)控帶上的質(zhì)控抗原捕獲，而有熒光信號。而樣品中己烯雌酚和熒光素標記的抗雌激素抗體形成的復(fù)合物則被層析到吸水紙上。樣品中的己烯雌酚越多，則熒光素顆粒膜中剩余游離的熒光素標記的抗雌激素抗體越少，結(jié)合到檢測帶上的熒光素標記的抗雌激素抗體越少，熒光信號也就越弱，依此來檢測樣品中的己烯雌酚的含量。
[0010]本發(fā)明的檢測雌激素的試紙具有靈敏度高、精確定量、特異性強、簡單方便和檢測時間短的優(yōu)點。由于以熒光素代替了膠體金作為標記物，很少的熒光信號既可以通過儀器檢測出來，因此大大提高了檢測的靈敏度，檢測雌激素靈敏度可達0.lng/ml。通過設(shè)置質(zhì)控帶(點)作為數(shù)據(jù)歸一化方法，降低了不同紙條間不同操作人員乃至不同儀器掃描的實驗誤差，將不同紙條測得的樣品值代入標準曲線，即可以達到精確定量的效果。
[0011]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1己烯雌酚快速檢測卡的測試條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013]圖中:5、支承背板，6、硝酸纖維素膜，7、熒光素顆粒膜，8、樣品墊，9、吸水膜，10、檢測帶，11、質(zhì)控帶。
[0014]圖2己烯雌酚快速檢測卡外殼及測試條在外殼內(nèi)的安置圖。
[0015]圖中:1、外殼，2、測試條，3、檢測窗孔，4、加樣孔。
[0016]
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明結(jié)合具體實施例參見附圖進一步說明如下:
實施例1
一種己烯雌酚快速檢測卡，它是在檢測卡外殼I中設(shè)置測試條2，檢測卡外殼I的結(jié)構(gòu)及測試條2的設(shè)置參見附圖2，檢測卡外殼I為長條扁平薄殼狀外殼，長70_，寬20_，厚5mm,薄殼壁厚Imm,由工程塑料制成。檢測卡外殼I由殼蓋與殼座兩半聯(lián)接構(gòu)成，在檢測卡外殼I殼蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。測試條2放置在檢測卡外殼I的殼座內(nèi)。測試條2是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，片長約60mm，片寬約4mm，厚度約2. 5mm。測試條2是多層結(jié)構(gòu)：底層是支承背板5,為聚氯乙烯塑料薄片,厚約O. 5mm,長60mm,寬4_ ;支承背板5中部疊置粘貼硝酸纖維素膜6，硝酸纖維素膜厚O. 5mm,長20_25mm，寬4mm。硝酸纖維素膜6上有二條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖1，二條顯示印跡帶中，一條是檢測帶10，含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物；另一條是質(zhì)控帶11，含肌動蛋白。支承背板5 —端部上疊置粘貼吸水膜9，支承背板5另一端部上疊置粘貼樣品墊8，吸水膜9內(nèi)端與樣品墊8內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜6 —端搭接，在樣品墊8與硝酸纖維素膜6的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段熒光素顆粒膜7，熒光素顆粒膜是含抗己烯雌酚抗體熒光素顆粒和熒光素顆粒標記的抗肌動蛋白抗體包被的玻璃纖維膜。突光素顆粒膜7厚O. 5-0. 8mm,長5mm,寬4mm。樣品墊8厚
O.5-0. 8mm,長20_，寬4_。吸水膜9厚O. 5-0. 8mm,長16-20_，寬4_。熒光素顆粒膜7、樣品墊8及吸水膜9與硝酸纖維素膜搭接長度為1-2_。吸水膜9材料是吸水紙，樣品墊8材料是吸水玻璃纖維膜。
[0018]熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素顆粒、四甲基異硫氰酸羅丹明顆粒、四乙基羅丹明顆?；蛟寮t蛋白顆粒。
[0019]實施例2
本發(fā)明己烯雌酚檢測卡用于牛奶樣品中的己烯雌酚的檢測。
[0020]在牛奶中加入適量的甲基叔丁基醚，垂直振蕩15min,于4 °C、IOOOOrpm離心15min，取上清，氮氣吹干，使用含10%甲醇的PBS緩沖液溶解，混勻即得待測樣品。
[0021]取150ul待測樣品加入注樣孔，在毛細管作用下待測樣品沿吸水墊方向移動，樣品溶解熒光素顆粒膜上的包被物質(zhì)，并帶動包被物質(zhì)一起向吸水墊方向移動。在樣品吸收墊上滴加樣品，如果樣品中有己烯雌酚，則己烯雌酚經(jīng)層析作用移動到熒光素顆粒膜的時候就會和熒光素顆粒標記的抗己烯雌酚抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并帶動熒光素顆粒標記的質(zhì)控抗體一起在層析作用下上行。當移動到檢測帶時，未被樣品中己烯雌酚結(jié)合的游離的熒光素顆粒標記的抗己烯雌酚抗體就會和檢測帶上的偶聯(lián)在載體蛋白上的己烯雌酚結(jié)合，而有熒光信號。熒光素標記的質(zhì)控抗體則被質(zhì)控帶上的質(zhì)控抗原捕獲，而有熒光信號。而樣品中己烯雌酚和熒光素標記的抗雌激素抗體形成的復(fù)合物則被層析到吸水紙上。樣品中的己烯雌酚越多，則熒光素顆粒膜中剩余游離的熒光素標記的抗雌激素抗體越少，結(jié)合到檢測帶上的熒光素標記的抗雌激素抗體越少，熒光信號也就越弱，依此來檢測樣品中的己烯雌酚的含量。通過測定標準不同濃度的標準品和對質(zhì)控帶上的熒光濃度進行歸一化比較（T/C)，可以構(gòu)建標準曲線，進而可以定量樣品中己烯雌酚的濃度。很少的熒光信號既可以通過儀器檢測出來，因此大大提高了檢測的靈敏度。
【權(quán)利要求】
1.一種己烯雌酚快速檢測卡，其特征在于長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼中設(shè)置測試條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔；測試條是由支承背板上通過不干膠在其上依次粘貼樣品墊、熒光素顆粒膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成；支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣品墊，吸水膜內(nèi)端與樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段熒光素顆粒膜；熒光素顆粒膜為含抗己烯雌酚抗體熒光素顆粒和熒光素顆粒標記的抗肌動蛋白抗體包被的玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜上有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，依次是:含己烯雌酚蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測帶，含肌動蛋白質(zhì)控帶，測試條置入檢測卡外殼內(nèi)，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
2.如權(quán)利要求1所述己烯雌酚快速檢測卡，其特征在于，檢測時檢測樣品的前處理方法為產(chǎn)品樣品粉碎后加入適量的甲基叔丁基醚，垂直振蕩15min，于4°C、1000rpm離心15min，取上清，氮氣吹干，使用含10%甲醇的PBS緩沖液溶解，混勻即得待測樣品。
3.如權(quán)利要求1所述己烯雌酚快速檢測卡，其特征在于，所述熒光素顆粒選自異硫氰酸熒光素顆粒、四甲基異硫氰酸羅丹明顆粒、四乙基羅丹明顆?；蛟寮t蛋白顆粒。
【文檔編號】G01N33/74GK104034905SQ201410284470
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】李永鋒, 陳國勇, 傅汝毅, 陶玲云, 藍文苑 申請人:廣西博士海意信息科技有限公司