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一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明原試劑盒含有Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，包被Inhibin-B特異性多克隆抗體的酶標(biāo)板，CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記的Inhibin-B單克隆抗體。本發(fā)明試劑盒所用的檢測抗體為單克隆抗體用CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記，能更好的去除背景信號；本發(fā)明檢測方法簡便，實(shí)用性強(qiáng)；直接通過熒光酶標(biāo)儀測定檢測結(jié)果，所發(fā)射的熒光譜峰狹窄，自發(fā)熒光弱，靈敏度高；熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定時(shí)間長，克服了傳統(tǒng)酶免疫檢測試劑盒靈敏度低，特異性差的現(xiàn)狀；可提高卵巢儲(chǔ)備功能檢測的分辨率、靈敏度及特異性。
【專利說明】—種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人I nh i b i n-B的試劑盒制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基于量子點(diǎn)的免疫熒光定量檢測，具體涉及一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前臨床上國內(nèi)各診療單位評估卵巢功能主要根據(jù)年齡、竇卵泡的數(shù)目(Antralfollicle count)、濾泡刺激激素(FSH)和雌激素(E2)水平等。但上述傳統(tǒng)方法檢查容易受到各種因素影響而產(chǎn)生誤差，同時(shí)容易受到檢測者主觀判斷而產(chǎn)生結(jié)果偏倚；此外，上述指標(biāo)的檢測受月經(jīng)周期的時(shí)限制約，且其檢測數(shù)值受到月經(jīng)周期的波動(dòng)較大，因而無法準(zhǔn)確給予判斷。能否尋找某一有效指標(biāo)，在月經(jīng)不同時(shí)期均能有效評估卵巢功能是目前婦科生殖內(nèi)分泌面臨的主要問題之一。近年來，臨床上開始采用抑制素B激素作為卵巢功能評估的一項(xiàng)指標(biāo)。抑制素B是一種由女性生長期卵泡顆粒細(xì)胞分泌的異二聚體蛋白質(zhì)激素。其通過選擇性抑制卵泡刺激素(FSH)的分泌從而調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。完整的抑制素B分子是一個(gè)分子量約為32KD的分子，由兩個(gè)不同的亞單位(α亞單位和β亞單位)經(jīng)二硫鍵連接而成。研究表明，抑制素B水平與卵巢儲(chǔ)備功能呈正相關(guān)。
[0003]目前在歐美，大部分臨床診療中心已將Inhibin-B作為評估卵巢儲(chǔ)備的常規(guī)指標(biāo)。主要所采用酶聯(lián)免疫顯色法測定(enzyme-linked immunoassay, Elisa)。但是,酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性結(jié)果。量子點(diǎn)(QDs)具有連續(xù)而寬的激發(fā)光光譜。其熒光可被波長小于其量子限域峰的任意光源所激發(fā)，且熒光譜峰位置可以通過改變量子點(diǎn)物理尺寸進(jìn)行調(diào)控。這樣僅用一種波長的激發(fā)光源便可激發(fā)多種不同顏色熒光的量子點(diǎn)進(jìn)行多元熒光檢測。有效提高了分辨率和靈敏度。因此，量子點(diǎn)免疫分析法遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于酶免疫測定。
[0004]目前國內(nèi)尚未見檢測Inhibin-B的注冊試劑盒供應(yīng)，該項(xiàng)檢測在臨床上的研究也還未廣泛展開。且目前國外的Inhibin-B檢測試劑盒多采用的是酶聯(lián)免疫方法，但是酶免疫分析法靈敏度低，影響因素多，易造成假陰性和假陽性。而根據(jù)大量的試驗(yàn)結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實(shí)用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及臨床應(yīng)用前景來看，量子點(diǎn)免疫分析法遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于酶免疫測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種量子點(diǎn)免疫熒光定量檢測人抑制素B的試劑盒。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒在檢測卵巢儲(chǔ)備功能中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0008]一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，該試劑盒包括Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,包被Inhibin-B特異性多克隆抗體的酶標(biāo)板，CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記的Inhibin-B單克隆抗體。[0009]進(jìn)一步的，上述Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為原核細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白，其氣基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]進(jìn)一步的，上述Inhibin-B特異性多克隆抗體是以原核表達(dá)的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體。
[0011]進(jìn)一步的，上述Inhibin-B單克隆抗體是以原核表達(dá)的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體。
[0012]進(jìn)一步的，本發(fā)明試劑盒還包括:標(biāo)記抗體稀釋液、洗板液、封閉液和樣品稀釋液。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:
[0014]試劑盒中作為檢測抗體的單克隆抗體，由于采用的量子點(diǎn)標(biāo)記法具有激發(fā)光譜寬，自發(fā)熒光弱，熒光穩(wěn)定和半衰期長等特點(diǎn)，大大的提高了檢測的分辨率、靈敏度和特異性。
[0015]本發(fā)明的試劑盒以CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體作為檢測抗體，更好的去除背景信號，提高檢測的分辨率和靈敏度；且通過熒光酶標(biāo)儀測量熒光強(qiáng)度獲得檢測結(jié)果，所發(fā)射的熒光譜峰狹窄，自發(fā)熒光弱，靈敏度高；熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定時(shí)間長；克服了現(xiàn)有的抑制素B酶免疫檢測試劑盒靈敏度低，特異性差的現(xiàn)狀，提高檢測的分辨率、靈敏度及特異性，更為有效地對早期卵巢儲(chǔ)備功能進(jìn)行檢測及風(fēng)險(xiǎn)評估。
[0016]本發(fā)明用量子點(diǎn)免疫分析法檢測Inhibin-B是先進(jìn)而有效的方法，能夠有效的提供臨床檢測的分辨率、靈敏度及特異性，且檢測方法操作簡便，實(shí)用性強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為人Inhibin-B重組蛋白純化前后的western blotting圖片；
[0018]圖2為純化后的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0019]圖3為純化后的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0020]圖4為Inhibin-B量子點(diǎn)免疫分析檢測試劑盒的檢查區(qū)間曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 以下結(jié)合具實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不局限于此。
[0022]I) Inhibin-B原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0023]選擇Inhibin-B的免疫原區(qū)，其基因序列如SEQ ID N0.2所示，共330bp，所對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，為Inhibin-B完整氨酸酸序列的N端到C端的第298個(gè)至第407個(gè)氨基酸，共110個(gè)氨基酸。
[0024]設(shè)計(jì)擴(kuò)增Inhibin-B免疫原區(qū)序列的特異性引物如下:
[0025]EcoR I Up primer:CCGGAATTCGGCCGGACCAACCTCTGTTG (下劃線標(biāo)記部分為內(nèi)切酶EcoR I的識別序列)(如SEQ ID N0.3所示，)，
[0026]Xho I Down primer:CCGCTCGAGGGCGCAGCCGCACTCCTCCG (下劃線標(biāo)記部分為內(nèi)切酶Xho I的識別序列)(如SEQ ID N0.4所示，)。
[0027]利用氯仿抽提法從卵巢癌細(xì)胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄及PCR引物擴(kuò)增出Inhibin-B免疫原區(qū)序列，將擴(kuò)增后的Inhibin-B序列酶切后連接到PGEX-4T-1原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用涂布棒將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種到氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落并進(jìn)行小量擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，采用EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒后，瓊脂糖電泳驗(yàn)證，若能酶切出約300bp的帶，將初步鑒定為含目的基因的菌落，進(jìn)一步測序驗(yàn)證，測序正確，即成功獲Inhibin-B的原核重組融合蛋白表達(dá)載體，記為pGEX-4T-l-1nhibin-B。
[0028]2) Inhibin-B免疫原的表達(dá)及純化
[0029]Inhibin-B目的蛋白的表達(dá)
[0030]將pGEX-4T-l-1nhibin-B轉(zhuǎn)化大腸桿菌RG2，挑取克隆37°C，250rpm震蕩培養(yǎng)直到OD值達(dá)到0.4?0.6，在0.5mM IPTG誘導(dǎo)下10°C、150rpm培養(yǎng)過夜，然后5000g離心IOmin收集菌體備用。細(xì)菌干沉淀可以保存于_80°C。
[0031]Inhibin-B目的蛋白的表達(dá)檢測
[0032]細(xì)菌干沉淀中加入適量裂解液，冰浴下超聲裂解菌體超聲過程中保證蛋白始終處于冰浴中，防止超聲過熱影響蛋白穩(wěn)定。12000rpm,4°C離心,收集上清蛋白，Western Blot鑒定蛋白及檢測蛋白表達(dá)量。
[0033]Inhibin-B目的蛋白的分離純化
[0034]細(xì)菌干沉淀中加入適量裂解液，冰浴下超聲裂解菌體超聲過程中保證蛋白
[0035]終處于冰浴中，防止超聲過熱影響蛋白穩(wěn)定。12000rpm，4°C離心，收集上清蛋白，0.44um過濾。將離心收集的蛋白裂解液和預(yù)清洗GSH - agarose充分混勻,4°C震蕩共孵育4h。細(xì)胞裂解液清洗3次，TBS清洗3次，加入IOmM谷胱甘肽洗脫液洗脫蛋白。洗脫后的蛋白可以通過IOKD的蛋白濃縮柱濃縮蛋白并去除液體中的谷胱甘肽，并用PBS洗滌。純化后的蛋白用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度并通過western blot鑒定其純度(見圖1)。
[0036]二、兔抗人Inhibin-B多克隆抗體制備與鑒定
[0037]I)兔抗人Inhibin-B多克隆抗體制備
[0038]動(dòng)物免疫
[0039]準(zhǔn)備兩只成年兔，將100 μ g抗原/兔溶入Iml磷酸緩沖溶液中待用。在Iml福氏不完全佐劑中加入分枝桿菌制成完全佐劑，并加入Iml抗原溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個(gè)不同的部位進(jìn)行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對皮膚15度的角度進(jìn)針，進(jìn)針深度為Icm?2cm，小心不要刺入肌肉中，在4個(gè)不同部位分別注射約500 μ I抗原溶液。注射結(jié)束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個(gè)部位重復(fù)上述操作。每4?6周注射抗原，并在注射后的7天?10天按照收集血液。將收集的血液與注射前收集的血液進(jìn)行比較，檢查是否有抗體產(chǎn)生。待確定產(chǎn)生抗體后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
[0040]收集血清
[0041]將家兔輕輕放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片傾斜45°在該處切出0.23cm?0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結(jié)束之前出現(xiàn)凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續(xù)收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒?20秒確定血流停止后方可。將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，再在4°C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，4°C，10，OOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，可在-20°c保存數(shù)年。
[0042]抗體純化
[0043]將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚集。在蛋白質(zhì)解凍過程中出現(xiàn)的聚集可通過37°C預(yù)熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0.05%,4°C, 15, OOOg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經(jīng)過濾器過濾除去多余的脂。
[0044]將抗體用TBS緩沖溶液以1:5的比例進(jìn)行稀釋，再用過濾器進(jìn)行過濾。以每分鐘0.5ml的速度將抗血清上到柱上，為保證抗血清與填料的結(jié)合,需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至A λ 280nm<0.008后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經(jīng)加入IOOul中和緩沖溶液的1.5ml EP管分管收集洗脫液，混勻后用PH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約PH7.4以防止抗體的變性。在柱中加入IOml，ρΗ1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至 A λ 280nm〈0.008。
[0045]利用分光光度計(jì)測定各管中蛋白質(zhì)的含量，抗體濃度為2.9mg/ml，將純化的抗體分裝后在2~8°C保存。
[0046]2)抗Inhibin-B多克隆抗體的鑒定
[0047]兔抗人Inhibin-B多克隆抗體靈敏度的初步檢測
[0048]采用間接Elisa 法，將重組蛋白 Inhibin-Β 分別按 lug、lOOng、10ng、lng、lOOpg、IOpgUpg的量進(jìn)行包被，分別加入按1:500,1:1000,1:2000、1:5000,1:10000稀釋的兔免疫血清作為一抗，加入按1:80000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，TMB顯色，450nm測OD值。以蛋白稀釋度`為橫坐標(biāo)，以450nm處的OD值為縱坐標(biāo)，繪出曲線圖，結(jié)果顯示1:10000稀釋的血清存在良好的線性關(guān)系的檢測區(qū)間IOOpg~100ng。
[0049]兔抗人Inhibin-B多克隆抗體的Western blotting鑒定
[0050]將重組蛋白Inhibin-B分別按lng、100pg、10pg、Ipg的量進(jìn)行SDS-PAGE膠點(diǎn)樣、電泳，孵抗體時(shí)，分別加入1:500、1:1000,1:2000倍稀釋的多克隆抗體血清作為一抗，加入I:10000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗,通過Western鑒定抗體效價(jià),結(jié)果顯示1:2000稀釋的多克隆抗體血清可以很好的識別lng Inhibin-B重組蛋白。
[0051]純化后抗Inhibin-B多克隆抗體的效價(jià)測定
[0052]采用間接Elisa法,用重組蛋白Inhibin-B抗原I μ g/100 μ I包被,4?過夜；洗漆后5%脫脂奶粉封閉過夜；將純化的多克隆抗體進(jìn)行系列稀釋作為一抗，37°C溫育2h ;洗滌后加入1: 50，000稀釋的HRP-標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗，37°C溫育Ih ;洗滌后加底
物顯色并及時(shí)終止，測OD45tol值。
[0053]檢測結(jié)果如圖2所示，多克隆抗體的效價(jià)為1:25600，其中橫坐標(biāo)為稀釋度的Log值，縱坐標(biāo)為OD值。
[0054]三、鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體制備與鑒定
[0055]I)鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的制備
[0056]i動(dòng)物免疫
[0057]將純化的重組人Inhibin-B抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，制成油包水抗原乳劑，SPF級純系BALB/c雌性小鼠6~8周齡，背部皮下多點(diǎn)注射，100 μ g/只，兩星期后用等量抗原加體積相同的弗氏不完全佐劑，進(jìn)行乳化，免疫。分別于首次免疫后的第2、4、6周末進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每次用相同劑量的目的蛋白。用間接Elisa法檢測血清抗體的效價(jià)。細(xì)胞融合前3天小鼠尾靜脈注射或腹腔注射100 μ g Inhibin-B蛋白以加強(qiáng)免疫。
[0058]ii小鼠脾細(xì)胞的分離
[0059]取加強(qiáng)免疫的BALB/c小鼠，摘眼球采血處死，75%酒精浸泡5?10分鐘，固定于蠟盤；用75%酒精消毒皮膚后，剪開腹部皮膚，暴露腹膜并用75%酒精擦拭消毒；用玻璃注射器吸取無血清DMEM培養(yǎng)液5ml注入小鼠腹腔，用注射器在腹腔內(nèi)反復(fù)抽吸(注意不可刺破小鼠的消化器官)；用該注射器抽出腹腔內(nèi)液體，注入50ml離心管內(nèi)；換鑷子，提起腹膜，換剪刀，暴露腹腔，無菌摘取脾臟，小心快速剪去周邊脂肪和筋膜，用無血清DMEM培養(yǎng)液洗I?2次，再將脾放入盛200目銅篩的平皿中，剪破包膜，用注射器芯研磨、擠壓脾細(xì)胞過網(wǎng)，吸取無血清DMEM培養(yǎng)液5ml吹打銅篩，收集過網(wǎng)后的脾細(xì)胞放入50ml無菌離心管中；將兩離心管lOOOrpm，離心5min ;棄上清，加入5ml無血清DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，待用；用完全培養(yǎng)液重懸沉淀的腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板，100 μ I/孔，然后置于37 °C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，備用。
[0060]iii SP2/0細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
[0061]從液氮罐中取出含有SP2/0細(xì)胞凍存管，立即投入37 °C水浴鍋中，融化后于IOOOrpm離心5?lOmin，棄上清；配制含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)復(fù)蘇細(xì)胞。將細(xì)胞接種于正常BALB/c小鼠背部兩側(cè)皮下，待瘤生長至3?5cm左右，即進(jìn)行無菌摘瘤，用無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌3次后，用小剪刀剪成直徑約2mm左右小塊，加入預(yù)先加了 2?3ml無血清DMEM培養(yǎng)液的200目銅篩中，用注射器芯研磨、擠壓出單個(gè)腫瘤細(xì)胞，置含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，使細(xì)胞維持對數(shù)生長期。融合前I天給SP2/0細(xì)胞換一次液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為I?5X 105/ml，融合當(dāng)天取約I?5X107個(gè)SP2/0細(xì)胞收集至50ml無菌離心管中，離心棄上清，加入5ml無血清DMEM培養(yǎng)液，混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用。
[0062]IV細(xì)胞融合及選擇培養(yǎng)
[0063]將SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:5比例混合50ml無菌離心管中，IOOOrpm,離心5min ；棄上清，輕彈管底，使沉淀松動(dòng)，沿離心管壁緩慢滴加37°C預(yù)溫的45%PEG溶液1ml，同時(shí)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)離心管以混勻細(xì)胞，Imin內(nèi)將PEG4000加完；置37°C水浴中Imin后，再于5min內(nèi)緩慢加入37°C預(yù)溫的無血清DMEM培養(yǎng)液8ml，同時(shí)輕輕攪動(dòng)使細(xì)胞成均一的懸液；置37°C水浴中5min后，lOOOrpm，離心5min，棄上清；加入37°C預(yù)溫的HAT培養(yǎng)液，輕懸細(xì)胞，按IXlO5個(gè)脾細(xì)胞/孔滴加到含飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后5?10天可根據(jù)克隆生長情況用HAT培養(yǎng)液半量換液；2周后可換HT培養(yǎng)液，3周后可換完全培養(yǎng)液；培養(yǎng)3?5天即可見小克隆出現(xiàn)，雜交細(xì)胞較大，呈圓形且透明，其他細(xì)胞透光性差并逐漸死亡；培養(yǎng)8?2天，克隆生長至孔底面積的1/3?1/2，此時(shí)可取培養(yǎng)上清液，進(jìn)行抗體檢測；一旦檢測到分泌預(yù)定抗體的克隆細(xì)胞，及時(shí)將陽性克隆轉(zhuǎn)種到24孔培養(yǎng)板，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存部分克隆細(xì)胞，同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。
[0064]V雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0065]細(xì)胞融合后，一旦長出大小適宜的克隆時(shí)，應(yīng)及時(shí)選擇靈敏、快速、可靠的免疫學(xué)方法篩選分泌預(yù)定抗體的雜交細(xì)胞克隆。本實(shí)驗(yàn)采用重組人ES抗原的間接Elisa法檢測，其中一抗為雜交瘤細(xì)胞的上清液，二抗為HRP-山羊抗鼠IgG (1:80，000)。具體操作步驟同鼠血清效價(jià)檢測。
[0066]Vl亞克隆化培養(yǎng)
[0067]克隆化培養(yǎng)對于獲得分泌單一抗體的雜交瘤細(xì)胞株至關(guān)重要，一般需要進(jìn)行3?4次亞克隆化培養(yǎng)，以保證分泌性克隆生長的穩(wěn)定性。采用有限稀釋法，詳細(xì)步驟如下:制備飼養(yǎng)層，取正常小鼠腹腔細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種96孔培養(yǎng)板，每孔50 μ 1，約含2 X IO4細(xì)胞，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；次日用微量移液器吹打雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)板中孔內(nèi)的克隆，懸浮于完全培養(yǎng)液中；取樣，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度分別為20個(gè)/ml、5個(gè)/ml ;分別將二種密度的雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔50μ 1，使每孔分別含2、1、0.5個(gè)細(xì)胞；置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一周后加100 μ I培養(yǎng)基。培養(yǎng)12?15天，對有克隆的培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測；對陽性單克隆細(xì)胞再克隆化培養(yǎng)，直到100%的克隆分泌特異性抗體為止；同時(shí)將陽性克隆進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。
[0068]vii鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的大量制備及純化
[0069]在細(xì)胞培養(yǎng)過程中雜交瘤能產(chǎn)生和分泌單克隆抗體約10?100 μ g/ml。為了獲得大量高效價(jià)抗體，通常將雜交瘤細(xì)胞植入BALB/c小鼠體內(nèi)，制備并收集含特異性單克隆抗體的腹水，方法如下:選用8?10周BALB/c雌性小鼠，在接種雜交瘤細(xì)胞前I?2周，先給小鼠腹腔注射0.5ml福氏不完全佐劑，預(yù)處理過的小鼠在2?3個(gè)月均可使用；收集生長良好的雜交瘤細(xì)胞，離心洗滌I次，重懸于無血清培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度為I?2 X 106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml細(xì)胞懸液；密切觀察小鼠的健康狀況與腹水征象，接種細(xì)胞7?12天，可見小鼠腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，即可消毒腹部皮膚，用5ml注射器接8號針頭，刺入腹腔，卸下注射器，抬高小鼠頭部，使腹水滴入離心管中；間隔2?3天，待腹水再生積聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2?3次。3000rpm離心15min，棄去上層油脂、細(xì)胞成分和其他沉淀物，吸取淡黃色腹水；采用飽和硫酸銨沉淀法粗純化，ProteinG S印harose4FF親和層析柱法純化雜交瘤細(xì)胞腹水，純化后的抗體濃度為1.2mg/ml。
[0070]2)抗Inhibin-B單克隆抗體的鑒定
[0071]i間接Elisa初步檢測抗Inhibin-B單克隆抗體靈敏度
[0072]將重組蛋白Inhibin-B 分別按 lug、lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、Ipg 的量進(jìn)行包被，分別加入按1:500、1:1000,1:2000,1:4000稀釋的含雜交瘤細(xì)胞的腹水作為一抗，力口入1:80000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，TMB顯色，450nm測OD值。以蛋白稀釋度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D45tol值為縱坐標(biāo)，繪出曲線圖，結(jié)果顯示1:4000稀釋的腹水存在良好的線性關(guān)系的檢測區(qū)間IOOpg?lOOng。
[0073]ii鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的Western blotting鑒定
[0074]將重組蛋白Inhibin-B分別按lng、lOOpg、10pg、Ipg的量進(jìn)行SDS-PAGE膠點(diǎn)樣、電泳，分別加入按1:500、1:1000倍稀釋的單克隆抗體腹水作為一抗，加入1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，Western檢測抗體效價(jià)。檢測結(jié)果顯示1:1000稀釋的單克隆抗體腹水可以很好的識別IOOpg Inhibin-B重組蛋白。
[0075]iii純化后抗Inhibin-B單克隆抗體的效價(jià)測定
[0076]采用間接Elisa法，用重組人ES抗原I μ g/100 μ I包被，4°C過夜；洗滌后5%脫脂奶粉封閉過夜；純化后將單克隆抗體進(jìn)行系列稀釋作為一抗，37°C溫育2h ;洗滌后將1:80, 000稀釋的HRP-標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，37°C溫育Ih ;洗滌后加底物顯色并及時(shí)終止，測OD45tlnm值。檢測結(jié)果如圖3所示，單克隆抗體的效價(jià)為1:512。
[0077]iv鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的免疫球蛋白類別及亞型鑒定
[0078]參照Sigma公司抗體亞型檢測試劑盒說明書,采用Antigen-Mediated Elisa法測定單克隆抗體的Ig類別和亞型。
[0079]四、量子點(diǎn)標(biāo)記
[0080]I) CdTe量子點(diǎn)的合成
[0081]CdCl2.2.5H20 (2.5X ΙΟΛιοΙ)溶于25ml的超純水中，加入谷胱甘肽GSH(3Xl(T4mol)，二水合檸檬酸三鈉(0.lg),Na2TeO3 (0.5X ΙΟΛιοΙ)和 NaBH4 (2.4Χ ΙΟΛιοΙ)，在磁力攪拌的條件下用NaOH調(diào)節(jié)pH到10.5，所有反應(yīng)都是在室溫環(huán)境下，Cd2+、TeO32 一和GSH的摩爾比為5:1:6，放入帶回流的微波裝置中(功率設(shè)為600W)，當(dāng)溶液顏色變成淡綠色時(shí)開始回流，隨著回流時(shí)間的不同形成一系列不同粒徑的以谷胱甘肽為穩(wěn)定劑的量子點(diǎn)。選擇合適的量子點(diǎn)將反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫后用無水乙醇進(jìn)行沉淀，在4000rpm的條件下離心5min。去除上清中過量的Cd2+、Te032 —等雜質(zhì)，重復(fù)3遍，待乙醇完全揮發(fā)后，將沉淀重懸于ρΗ7.4的PBS中。
[0082]2) CdTe量子點(diǎn)與鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的偶聯(lián)及純化(量子點(diǎn)標(biāo)記的二抗)
[0083]取上述濃度的量子 點(diǎn)(008)0(^60(^1，加入18ul的EDC (lmg/ml)和800 μ I的甲醇混合后避光震蕩30min，再加入8ul的β —巰基乙醇進(jìn)行終止，取0.75mg的二抗用PBS稀釋至適當(dāng)體積加入活化的QDs中與之混合，避光震蕩2h，反應(yīng)結(jié)束后再加入巰基乙醇穩(wěn)定量子點(diǎn)，進(jìn)行透析。透析后在16300g條件下離心3min，去除上清，沉淀(即為純化的偶聯(lián)有量子點(diǎn)的Inhibin-B重組蛋白抗體)重懸于PBS中，4°C保存。
[0084]經(jīng)過間接ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)標(biāo)記二抗在1:10000的稀釋條件下檢測效果最好。
[0085]所有所述的間接Elisa法的具體步驟為:
[0086]a包板:pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至最適濃度I μ g/孔，且100 μ I/孔，放入濕盒，4°C過夜；
[0087]b封閉:次日棄去包被液，PBST洗滌酶標(biāo)反應(yīng)孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300 μ I/孔封閉，放入濕盒，4°C過夜；
[0088]c棄去封閉液，同上洗滌，PBS倍比稀釋兔血清樣品100μ I/孔，同時(shí)設(shè)立空白，陽性和陰性對照，37°C濕盒溫育1.5h ;
[0089]d棄去血清樣品，同上洗滌，PBS稀釋成1:80，000的HRP-山羊抗兔IgGlOO μ I/孔，37°C溫育 Ih ；
[0090]e棄去酶標(biāo)二抗，同上洗滌，TMB顯色，底物A和B各50 μ I/孔，37 °C避光顯色I(xiàn)Omin,每孔加入50 μ L2mol/L H2SO4終止液，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定OD45tlnm值。
[0091]五、基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B試劑盒及其檢測方法
[0092]I)試劑盒檢測方法
[0093]利用純化的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體作為捕獲抗體，偶聯(lián)有量子點(diǎn)的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體作為檢測抗體，建立Inhibin-B的單抗和多抗雙夾心量子點(diǎn)檢測法。
[0094]i酶標(biāo)板的包被及封閉
[0095]pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋多克隆抗體至最適濃度I μ g/孔，且100 μ I/孔，放入濕盒，4°C過夜；次日棄去包被液，PBST洗滌酶標(biāo)反應(yīng)孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300 yl/孔封閉，放入濕盒或干燥的金屬薄袋內(nèi)，4°C過夜。
[0096]ii標(biāo)準(zhǔn)品或被檢血清的處理
[0097]Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(陽性標(biāo)準(zhǔn)品)或被檢血清用樣品稀釋液(含1%BSA和0.05%的吐溫-20的PBS)做適當(dāng)比例的稀釋，不加血清的樣品稀釋液作為陰性標(biāo)準(zhǔn)品，IOOiU/孔，37°C反應(yīng)I小時(shí)后用洗板液洗板3次，將酶標(biāo)板拍干。
[0098]iii單克隆抗體檢測
[0099]Inhibin-B單克隆抗體1:5000稀釋后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。100 iil/孔，37°C反應(yīng)I小時(shí)后用洗板液洗板3次，拍干后加入IOOiU PBS0將處理好的酶標(biāo)板經(jīng)由熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到檢測限。
[0100]2)試劑盒性能指標(biāo)檢測
[0101]i試劑盒的檢測區(qū)間
[0102]取包被好兔抗人Inhibin-B多克隆抗體并進(jìn)行封閉的酶標(biāo)板,將Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品做適當(dāng)比例的稀釋，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)孔。IOOiU/孔，37°C反應(yīng)I小時(shí)后用洗板液洗板3次，將酶標(biāo)板拍干。用PBS稀釋鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體1:10000稀釋后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用，IOOiU/孔，37°C反應(yīng)I小時(shí)后用洗板液洗板3次，拍干后加入IOOiU PBS,將處理好的酶標(biāo)板經(jīng)由熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度值。檢測數(shù)據(jù)如下表1所示，以不同濃度的Inhibin-B的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的突光強(qiáng)值為縱坐標(biāo),繪制曲線如圖4所示，本試劑盒具有良好的線性關(guān)系的檢測區(qū)間為0.14pg/ml~213.28ng/ml，在該區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=2.9179x+271.51 (R2=0.9931)。
[0103]表1Inhibin-B量子點(diǎn)免疫分析檢測試劑盒可檢測的蛋白濃度區(qū)間
[0104]
【權(quán)利要求】
1.一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,包被Inhibin_B特異性多克隆抗體的酶標(biāo)板，CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記的Inhibin-B單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:所述的Inhibin-B蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為原核細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:所述的Inhibin-B特異性多克隆抗體是以原核表達(dá)的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:所述的Inhibin-B單克隆抗體是以原核表達(dá)的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:該試劑盒還包括:標(biāo)記抗體稀釋液、洗板液、封閉液和樣品稀釋液。
【文檔編號】G01N33/68GK103728457SQ201310740120
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】夏曦, 胡向明, 郭忠振, 黎俊青 申請人:李志榮