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包合物包合率測定儀的測定方法
【專利摘要】一種包合物包合率測定儀的測定方法，所采用的測定儀包括檢測部分(1)、控制部分(2)和顯示部分(3)，檢測部分(1)包括樣品管(11)、第一透鏡(12)、短波通濾光片(13)、第二透鏡(14)、激發(fā)光源(15)、第三透鏡(16)、長波通濾光片(17)、第四透鏡(18)和光電倍增管(19)；控制部分(2)主要為芯片；顯示部分(3)為液晶顯示屏.采用本裝置測定包合物包合率的方法按五個步驟進(jìn)行：一是備料，二是溶液的制備，三是儀器校正，四是熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，五是樣品包合率的測定.本發(fā)明獨創(chuàng)了無光譜特征的包合物采用熒光法測定的新途徑，且所改進(jìn)的儀器靈敏度高，樣品量低，操作簡單，應(yīng)用范圍廣。
【專利說明】包合物包合率測定儀的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種化學(xué)實驗儀器的使用方法，具體是用于藥物包合物包合率即β-環(huán)糊精-藥物包合物包合率的測定方法.【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)糊精是一類由6~8個葡萄糖單元通過1，4糖苷鍵相互連接形成的一類環(huán)狀低聚糖，具有“外親水、內(nèi)疏水、特殊空腔”的性質(zhì)，可以通過超分子相互作用與許多有機或無機分子形成主客體包合物，在超分子化學(xué)領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用.環(huán)糊精在環(huán)糊精種類中應(yīng)用最廣，是一類由7個葡萄糖單元通過1，4糖苷鍵相互連接形成的一類環(huán)狀低聚糖，能夠包合各種形狀大小與環(huán)糊精內(nèi)腔相匹配的疏水性客體藥物分子，以此提高客體藥物分子的溶解性.[0003]目前，對于藥物包合物包合率的測定多采用光譜法直接進(jìn)行測定，即根據(jù)包合前后藥物分子光譜特性的變化來計算，此法不能測定無光譜特征的藥物包合物分子，且操作復(fù)雜，樣品用量高，存在一定缺陷.[0004]藥物進(jìn)入人體后通過體液輸送到達(dá)體內(nèi)能使具有內(nèi)源熒光的蛋白質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率降低(熒光猝滅)，而藥物包合物通過體液輸送到達(dá)靶位緩慢釋放出藥物，對蛋白也有一定的熒光猝滅作用，因此可根據(jù)蛋白質(zhì)的熒光猝滅差異來計算藥物包合物的包合率，此法尚未見報道.所涉及的熒光計是一種重要的儀器，大多數(shù)傳統(tǒng)的熒光計需要用大光束激發(fā)樣品，并需要大孔徑光匯聚器件提高儀器的靈敏度，因此儀器龐大，樣品用量大.CN203299124U公告了一種便攜式熒光計，利用透鏡將激發(fā)光進(jìn)行匯聚，并通過空間濾光片或擋板去除背景及雜光，大大提高了儀器的靈敏度，本申請在此基礎(chǔ)上，結(jié)合藥物包合物對蛋白質(zhì)的猝滅機理設(shè)計了一種新穎簡便的包合物包合率測定儀及其測定方法.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種改進(jìn)型的包合物包合率測定儀的測定方法.[0006]為便于了解本方法，首先介紹一下本改進(jìn)型的包合物包合率測定儀，它包括檢測部分(I)、控制部分(2)和顯示部分(3)，檢測部分(I)包括樣品管(11)的水平方向右側(cè)設(shè)置有第一透鏡(12)和第二透鏡(14)，第一透鏡(12)和第二透鏡(14)之間設(shè)置有短波通濾光片(13)，第二透鏡(14)右`側(cè)設(shè)置有激發(fā)光源(15)，樣品管(11)的正上方設(shè)置有第三透鏡(16)和第四透鏡(18)，第三透鏡(16)和第四透鏡(18)之間設(shè)置有長波通濾光片(17)，第四透鏡(18)的上端設(shè)置有光電倍增管(19);控制部分(2)是根據(jù)操作規(guī)程自行編程制成的芯片，顯示部分(3)是與芯片相連的液晶顯示屏.[0007]用上述裝置檢測β -環(huán)糊精-藥物包合物包合率的方法按如下步驟進(jìn)行:
[0008](I)備料:市購或網(wǎng)購足量的三羥甲基氨基甲烷粉劑、質(zhì)量濃度為37%的濃鹽酸、蛋白粉、無水乙醇；按實驗設(shè)計要求向有關(guān)企業(yè)訂購梯度系列齊全的不同包合率的固態(tài)β-環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)品；[0009](2)溶液的制備:
[0010]①取6.59g三羥甲基氨基甲烷和7.83mL濃鹽酸，用蒸餾水配制成1000mL濃度為
0.1mol.L-1PH=?.43的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液；
[0011]②以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10^5mol.L_1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0012]③以無水乙醇為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X 10_3mol.L_1的梯度系列不同包合率的β-環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0013](3)儀器校正:取25 μ L已知包合率的包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，打開激發(fā)光源并將光引入樣品管中，激發(fā)樣品管中被測分子中的電子并導(dǎo)致發(fā)出熒光，此熒光經(jīng)光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)芯片計算出樣品的包合率，通過比較當(dāng)前的包合率與計算出的包合率，進(jìn)行儀器校正；
[0014](4)熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將25 μ L不同包合率的環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液逐一注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，分別檢測其熒光發(fā)射強度，此熒光強度經(jīng)芯片擬合后得到以熒光強度為縱坐標(biāo)，包合物的包合率為橫坐標(biāo)的熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0015](5)樣品包合率的測定:將25 μ L待測樣品注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，檢測其熒光發(fā)射強度 ，此熒光強度經(jīng)過芯片代入已擬合的熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到對應(yīng)的包合率即為該樣品的包合率.[0016]本發(fā)明的有益效果是能夠獨辟蹊徑地提供一種實現(xiàn)無光譜特征的包合物包合率的測定方法，而且所提供的儀器靈敏度較高，樣品量低，操作簡單.【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本包合物包合率測定儀的組成部件框示圖.[0018]圖2為本包合物包合率測定儀檢測部分的結(jié)構(gòu)示意圖.[0019]圖3為白藜蘆醇對牛乳鐵蛋白的熒光猝滅圖.[0020]圖4為β -環(huán)糊精對牛乳鐵蛋白的熒光猝滅圖.【具體實施方式】
[0021]下面本發(fā)明將結(jié)合實施例并參照附圖作進(jìn)一步詳述，參見圖1與圖2，本包合物包合率測定儀，從功能上分，包括檢測部分(I)、控制部分(2)和顯示部分(3)，檢測部分(I)包括有居中的樣品管(11)，其水平方向的右側(cè)設(shè)置有第一透鏡(12)和第二透鏡(14)，第一透鏡(12)和第二透鏡(14)之間設(shè)置有短波通濾光片(13)，第二透鏡(14)右側(cè)設(shè)置有激發(fā)光源(15)，樣品管(11)的正上方設(shè)置有第三透鏡(16)和第四透鏡(18)，第三透鏡(16)和第四透鏡(18)之間設(shè)置有長波通濾光片(17)，第四透鏡(18)的上端設(shè)置有光電倍增管
(19);控制部分(2)是根據(jù)操作規(guī)程自行編程制成的芯片，顯示部分(3)是與芯片相連的液晶顯示屏.[0022]本包合物包合率測定儀的樣品管(11)為石英管；激發(fā)光源(15)為激發(fā)光二級管；四個透鏡(12、14、16、18)均用于聚光；長波通濾光片(17)和短波通濾光片(13)均為玻璃濾光片，用來篩選出希望的激發(fā)光或熒光并濾除不需要的雜光干擾；控制部分(2)主要為自行編程制成的芯片，由于不屬專利法保護(hù)范疇，準(zhǔn)備申請計算機軟件保護(hù)，因此不贅述；光電倍增管(19)將光信號轉(zhuǎn)化為點信號并放大；顯示器部分(3)是液晶觸摸顯示屏，用于數(shù)據(jù)的顯示及與熒光計交互作用如鍵入變量、設(shè)定參數(shù)等的輸入。
[0023]本包合物包合率測定儀使用時，將樣品注入樣品管(11)中，打開激發(fā)光源(15)，激發(fā)光經(jīng)第二透鏡(14)匯聚后通過短波通濾光片(13)過濾去除雜光，再經(jīng)第一透鏡(12)匯聚通入樣品管中，激發(fā)樣品管中被測分子中的電子并導(dǎo)致發(fā)出熒光，此熒光經(jīng)第三透鏡
(16)匯聚后通過長波通濾光片(17)過濾去除雜光，再經(jīng)第四透鏡(18)匯聚通入光電倍增管中將光信號轉(zhuǎn)化為電信號并放大，最后經(jīng)過芯片計算出樣品的包合率，并由液晶顯示屏向用戶顯示正確的包合率.[0024]本包合物包合率測定儀用于檢測β -環(huán)糊精-藥物包合物包合率的方法按如下步驟進(jìn)行:
[0025](1)備料:市購或網(wǎng)購足量的三羥甲基氨基甲烷粉劑、質(zhì)量濃度為37%的濃鹽酸、蛋白粉、無水乙醇；按實驗設(shè)計要求向有關(guān)企業(yè)訂購梯度系列齊全的不同包合率的固態(tài)β-環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)品；
[0026](2)溶液的制備:
[0027]①取6.59g三羥甲基氨基甲烷和7.83mL濃鹽酸，用蒸餾水配制成1000mL濃度為
0.1mol.L-1PH=?.43的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液；
[0028]②以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10^5mol.L-的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0029]③以無水乙醇為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X 10_3mol.L-1的梯度系列不同包合率的β-環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0030](3)儀器校正:取25 μ L已知包合率的包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，打開激發(fā)光源并將光引入樣品管中，激發(fā)樣品管中被測分子中的電子并導(dǎo)致發(fā)出熒光，此熒光經(jīng)光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)芯片計算出樣品的包合率，通過比較當(dāng)前的包合率與計算出的包合率，進(jìn)行儀器校正；
[0031](4)熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將25 μ L不同包合率的環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液逐一注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，分別檢測其熒光發(fā)射強度，此熒光強度經(jīng)芯片擬合后得到以熒光強度為縱坐標(biāo)，包合物的包合率為橫坐標(biāo)的熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0032](5)樣品包合率的測定:將25 μ L待測樣品注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，檢測其熒光發(fā)射強度，此熒光強度經(jīng)過芯片代入已擬合的熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到對應(yīng)的包合率即為該樣品的包合率.[0033]熒光儀測定包合物包合率的原理:
[0034]蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基，可產(chǎn)生較強的內(nèi)源熒光.藥物通過體液輸送到達(dá)體內(nèi)能使具有內(nèi)源熒光的蛋白質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率降低(熒光猝滅)，且存在一定的量-效關(guān)系，因此可以利用藥物對蛋白質(zhì)的熒光猝滅作用檢知藥物的
含量.[0035]凡能使蛋白發(fā)生熒光猝滅的藥物均可用上述方法可檢知其含量，藥物如結(jié)晶紫、水飛薊賓、芥子堿、氧氟沙星、大黃酚、槲皮素、黃芩苷、白藜蘆醇、阿魏酸等，蛋白如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛乳鐵蛋白等，下面我們以白藜蘆醇對牛乳鐵蛋白的猝滅為例進(jìn)行實驗，結(jié)果如圖3所示，其中縱坐標(biāo)表示熒光強度，橫坐標(biāo)表示掃描波長，牛乳鐵蛋白濃度為1.0X10_5mol.ΙΛ曲線從上至下I~7表示白藜蘆醇濃度分別為O、1.0X 10_5、
1.6Χ10'3.2Χ10_5、4.0Χ10_5、4.8Χ10_5、6.4Χ10-5(單位:mol.171).從圖 3 可以看出，白藜蘆醇對牛乳鐵蛋白的猝滅作用很大，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，牛乳鐵蛋白的熒光強度會逐漸降低，白藜蘆醇濃度與牛乳鐵蛋白的熒光強度呈一定線性關(guān)系，經(jīng)線性擬合獲得方程為:y=_63.1281x+2060.4481，相關(guān)系數(shù)為0.9925。一般而言，相關(guān)系數(shù)大于0.8時，認(rèn)為兩個變量有很強的相關(guān)性，越接近I相關(guān)性越好，本實驗相關(guān)系數(shù)為0.9925，說明白藜蘆醇濃度與牛乳鐵蛋白的熒光強度的線性好，可用于白藜蘆醇含量的測定.[0036]圖4為環(huán)糊精對牛乳鐵蛋白的熒光猝滅圖，其中縱坐標(biāo)表示熒光強度，橫坐標(biāo)表示掃描波長，牛乳鐵蛋白濃度為1.0X IO-5Hiol.L—1，曲線從上至下I~7表示β -環(huán)糊精濃度分別為 0、1.0Χ10_5、1.6Χ10_5、3.2X 10_5、4.0X 10_5、4.8X 10_5、6.4Χ10-5(單位:mol.η.從圖4可以看出，β-環(huán)糊精對牛乳鐵蛋白幾乎無猝滅作用.[0037]β -環(huán)糊精-藥物包合物進(jìn)入人體后通過體液輸送到達(dá)靶位會緩慢釋放出藥物，對蛋白也有一定的熒光猝滅作用，而β -環(huán)糊精對牛乳鐵蛋白幾乎無猝滅作用，說明藥物包合物對牛乳鐵蛋白起猝滅作用的是包合物中釋放的藥物，而藥物包合物中釋放藥物的含量與其包合率大小呈正相關(guān)性，據(jù)此可根據(jù)藥物包合物中釋放出的藥物對牛乳鐵蛋白的猝滅作用，計算出釋放的藥物含量，進(jìn)一步推測藥物包合物的包合率.本申請是利用梯度系列不同包合率的藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)品對蛋白質(zhì)的猝滅差異繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用此來計算未知包合物的包合率。`
【權(quán)利要求】
1.一種包合物包合率測定儀的測定方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行: (1)備料:市購或網(wǎng)購足量的三羥甲基氨基甲烷粉劑、質(zhì)量濃度為37%的濃鹽酸、蛋白粉、無水乙醇；按實驗設(shè)計要求向有關(guān)企業(yè)訂購梯度系列齊全的不同包合率的固態(tài)環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)品； (2)溶液的制備: ①取6.59g三羥甲基氨基甲烷和7.83mL濃鹽酸，用蒸餾水配制成1000mL濃度為0.1mol.L-1PH=?.43的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液； ②以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10^5mol.L-1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液； ③以無水乙醇為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10_3mol.L-1的梯度系列不同包合率的β-環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液； (3)儀器校正:取25μ L已知包合率的包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，打開激發(fā)光源并將光引入樣品管中，激發(fā)樣品管中被測分子中的電子并導(dǎo)致發(fā)出熒光，此熒光經(jīng)光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)芯片計算出樣品的包合率，通過比較當(dāng)前的包合率與計算出的包合率，進(jìn)行儀器校正； (4)熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:將25μ L不同包合率的β-環(huán)糊精-藥物包合物標(biāo)準(zhǔn)溶液逐一注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，分別檢測其熒光發(fā)射強度，此熒光強度經(jīng)芯片擬合后得到以熒光強度為縱坐標(biāo)，包合物的包合率為橫坐標(biāo)的熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線； (5)樣品包合率的測定:將25μ L待測樣品注入含2.5mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品管中，檢測其熒光發(fā)射強度，此熒光強度經(jīng)過芯片代入已擬合的熒光強度-包合率標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到對應(yīng)的包合率即為該樣品的包合率。
【文檔編號】G01N21/64GK103776806SQ201410006134
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】郭明, 伍周玲, 詹敏忠 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)