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專利名稱：蒼耳子藥材uplc指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計中藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，尤其是蒼耳子藥材超高效液相色譜(UPLC)指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
指紋圖譜技術(shù)可通過不同的特性共有峰來標(biāo)示，可基本上反映中藥的化學(xué)成分以及含量分布情況。美國、英國、印度、德國、加拿大等國家均已接受色譜指紋圖譜的質(zhì)控方法，他們對指紋圖譜中的各峰，并不要求每個組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)都清楚，也不需要對呈現(xiàn)在圖譜中的每個組分都清楚地定量，僅需不同批號的同一種藥品的指紋圖譜保持基本一致。如德、法對聯(lián)合開發(fā)的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)制劑EGb761制定的標(biāo)準(zhǔn)，不僅控制了總黃酮和總內(nèi)酯的含量、指標(biāo)成分間的比例，而且設(shè)置了內(nèi)控的色譜指紋圖鑒別；美國食品藥品監(jiān)督管理局在1996年制定的《FDA關(guān)于植物物制品的指南》中，要求對植物原料、植物藥中間體和植物藥產(chǎn)品提供相應(yīng)的指紋圖譜；中國國家食品藥品監(jiān)督管理局于2000年發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)術(shù)要求(暫行)》，明確要求對新申報的中藥注射劑和已上市的中藥注射劑實行指紋圖譜控制其標(biāo)準(zhǔn)；《中國藥典》2010版項下也有多個藥材和制劑要求用指紋圖譜控制其質(zhì)量。中藥是通過多成分、多途徑、多層次、多靶點在人體內(nèi)發(fā)揮整合作用，這些都給中藥的深入研究和質(zhì)量控制帶來很大困難。長期以來，中藥存在質(zhì)量控制水平低、不能進行定性和定量分析，質(zhì)量不穩(wěn)定，等問題。中藥指紋圖譜特指中藥樣本經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分析技術(shù)得到的中藥各組分群體的特征圖譜和圖像，目前已成為國內(nèi)外公認(rèn)的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的最有效手段之一。中藥指紋圖譜主要包括色譜法(如薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)及超臨界流體色譜(SFC)等)、光譜法(如紫外、紅外光譜等)、核磁共振譜(NMR)和聯(lián)用技術(shù)(如GC-MS (質(zhì)譜)、LC -MS,LC-NMR和LC-DAD ( 二極管陣列檢測)-MSn)等[8，9]得 到的譜圖，其中色譜指紋圖譜是主流方法_。HPLC給出的是高分辨率的輪廓圖譜，操作相對容易，由于是封閉系統(tǒng)，外界影響因素少，穩(wěn)定性好，很適合作指紋圖譜的實驗研究和應(yīng)用；而UPLC在HPLC基礎(chǔ)上又有所提高，相比HPLC，UPLC具有分辨率高、分離度高、重現(xiàn)性好、出峰迅速節(jié)省溶劑等優(yōu)點。蒼耳子來源為菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Part.的成熟帶總荀的果實。蒼耳子味辛苦、性溫、有毒，具有散風(fēng)熱、通鼻竅之功效，是中醫(yī)臨床上散熱、解瘡毒、通鼻竅、痹癥的要藥；其含有大量的酚酸類化合物，包括綠原酸、新綠原酸、咖啡酸和多種咖啡?？鼘幩犷惖?，這類化學(xué)成分被證實是蒼耳子發(fā)揮臨床療效的重要藥效組分，具有良好的抗菌、抗病毒、消炎、鎮(zhèn)痛作用、止咳和抗腫瘤等生物活性?！吨袊幍洹?010版項下關(guān)于蒼耳子的質(zhì)量控制是以性狀鑒別和對照藥材薄層色譜為指標(biāo)進行的。由于我國幅源遼闊，不同的氣候條件、生態(tài)環(huán)境對其地域內(nèi)所產(chǎn)的藥材質(zhì)量有很大的影響，僅靠性狀鑒別和含量測定不能全面控制蒼耳子的質(zhì)量，需要有全面反映蒼耳子藥材質(zhì)量控制的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蒼耳子的UPLC指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的蒼耳子藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。為達到此目的，本發(fā)明通過對蒼耳子的超高液相色譜指紋圖譜的研究，提出了一種蒼耳子藥材的質(zhì)量控制方法，彌補了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，使蒼耳子藥材的質(zhì)量控制更加全面和科學(xué)。
本發(fā)明的蒼耳子UPLC指紋圖譜建立方法，包括如下步驟:
(I)供試品溶液制備:精密稱取過40目篩蒼耳子藥材粉末0.3 3 g，置于棕色容量瓶中，加入10 IOOmL甲醇稱定重量，超聲提取30min (150ff,40Hz)，放冷，稱定重量，加甲醇補足損失質(zhì)量，搖勻，再次靜置，臨用前用0.22 μ m濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(2)超高液相色譜分析:采用超高液相色譜系統(tǒng)，色譜分離柱為UPLC色譜柱，填料為BEHC18柱(2.1 mmX 100 mm, 1.7 μ m);流動相為乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度洗脫方式:0 2min ；3%:97% ；2 2.5min ；5%:95% ；2.5 8min ； 10%:90% ；8 8.5min ；15%:85% ；
8.5 14min ； 20%: 80% ； 14 17min ；24%:76% ；17 20 min ；35%:65% ；20 22 min ；50%:50%; 22 23; 50% 3% ；，檢測波長 220nm,流速 0.20 0.45mL.mirT1，柱溫 25。。 40 °C ；在此條件下分析供試品溶液，得到蒼耳子藥材的超高液相指紋圖譜。

標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜確定:按照本發(fā)明方法，對26批不同產(chǎn)地蒼耳子藥材建立了 UPLC指紋圖譜，通過分析比較確定了 19個共有特征峰,其保留時間分別為:4.6 mi n、5.2 mi η、
5.5 mi η、5.8 mi η、6.4 mi η、6.9 mi η、7.2 mi η、7.7 mi η、8.I mi η、11.3 mi η、11.5mi n> 12.2 mi n> 12.5 mi n> 13.5 mi n> 14.3 mi n> 14.8 mi n> 19.7 mi n、20.0 mi n、20.8mi n，這些共有UPLC特征峰構(gòu)成了蒼耳子藥材的指紋特征，作為蒼耳子藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖
-1'TfeP曰。本發(fā)明有以下優(yōu)點和用途:
(I)將蒼耳子藥材作為整體 對待，通過比較其共有峰，可以找出不同產(chǎn)地、批次藥材之間的細(xì)微差異。(2)供試品溶液制備方法簡單，色譜條件容易實現(xiàn)。(3)方法的穩(wěn)定性，重現(xiàn)性較好，采樣時間短。(4)適用于蒼耳子藥材真?zhèn)?，質(zhì)量、產(chǎn)地等鑒別和控制。


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圖1是本發(fā)明提供的蒼耳子藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，從左到右分別標(biāo)示出其19個共有色譜峰。
具體實施方式
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本發(fā)明的具體實施方式
如下:
(I)儀器和藥品:采用Waters超高液相色譜儀；蒼耳子藥材共26批，采于全國不同產(chǎn)地，其他試劑均為色譜純或分析純。(2)供試品制備:精密稱取蒼耳子藥材粉末0.3g左右，置于IOmL棕色容量瓶中，加入甲醇定容，超聲提取30min (150W, 40Hz)，放冷，稱定重量，加甲醇補足損失質(zhì)量，搖勻，再次靜置，臨用前用0.22 μ m濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(3)超高液相色譜分析:色譜分離柱填料為BEHC18柱(2.1 mmX 100 mm, 1.7 μ m)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度沈脫方式:0 2min ；3%:97% ；2 2.5min ；5%:95% ；2.5 8min ； 10%:90% ；8 8.5min ； 15%:85% ；8.5 14min ； 20%: 80% ； 14 17min ；24%:76% ；17 20 min ；35%:65% ；20 22 min ；50%:50%;22 23; 50% 3% ;檢測波長 220nm，流速0.25 mL.mirT1，柱溫30°C ;在此條件下分析供試品溶液，得到蒼耳子藥材的超高液相指紋圖譜。(4)按照本發(fā)明方法，對26批不同產(chǎn)地蒼耳子藥材建立了 UPLC指紋圖譜，通過分析比較確定了 19個共有特征峙，其保留時間分別為:4.6 mi n、5.2 mi n、5.5 mi n、5.8 min、6.4 mi n、6.9 mi n、7.2 mi n、7.7 mi n、8.1 mi n、11.3 mi n、11.5 mi n> 12.2 mi n、12.5 mi n> 13.5 mi n> 14.3 mi n> 14.8 mi n> 19.7 mi n、20.0 mi n、20.8 mi n,這些共有峰構(gòu)成了蒼耳子藥材的色譜·指紋特征，可以作為蒼耳子藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
權(quán)利要求
1.供試品溶液的制備:精密稱取過40目的蒼耳子藥材粉末0.3 3g，置于IOmL棕色容量瓶中，加入甲醇10 IOOmL稱定重量，超聲提取30min (150ff,40Hz)，放冷，稱定重量，加甲醇補足損失質(zhì)量，搖勻，再次靜置，臨用前用0.22 μ m濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.指紋圖譜的制備:采用超高液相色譜系統(tǒng)，色譜分離柱為UPLC色譜柱，填料為BEHC18柱(2.1 mmX 100 mm, 1.7 μ m);流動相為乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度洗脫方式:O 2min ；3%:97% ；2 2.5min ；5%:95% ；2.5 8min ； 10%:90% ；8 8.5min ； 15%:85% ；8.5 14min; 20%:80% ;14 17min ;24%:76% ;17 20 min ;35%:65% ;20 22 min ；50%:50%; 22 23; 50% 3% ;檢測波長220nm，流速0.25 mL.mirT1，柱溫30°C ;在此條件下分析供試品溶液，得到蒼耳子藥材的超高液相指紋圖譜。
3.標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定:確定了19個共有特征峰，其保留時間分別為:4.6 mi n、5.2mi η、5.5 mi η、5.8 mi η、6.4 mi η、6.9 mi η、7.2 mi η、7.7 mi η、8.I mi η、11.3 mi n、·11.5 mi Πλ 12.2 mi n、12.5 mi n、13.5 mi n、14.3 mi n、14.8 mi n、19.7 mi n、20.0 min、20.8 mi n，這些共有UPLC特征峰構(gòu)成了蒼耳子藥材的指紋特征，作為蒼耳子藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明提供蒼耳子藥材超高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域其特征在于(1)供試品溶液的制備蒼耳子藥材粉末過40目篩，甲醇超聲提取30min(150W，40Hz)，放冷，稱定重量，加甲醇補足損失質(zhì)量，搖勻，再次靜置，臨用前用0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(2)指紋圖譜的制備采用超高液相色譜系統(tǒng)，色譜分離柱為UPLC色譜柱，填料為BEHC18柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水；采用梯度洗脫方式；檢測波長220nm；在此條件下分析供試品溶液，得到蒼耳子藥材的超高液相指紋圖譜。(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定通過比較，確定了19個共有特征峰，這些共有UPLC色譜峰構(gòu)成了蒼耳子藥材的指紋特征，作為蒼耳子藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
文檔編號G01N30/06GK103235064SQ201310179579
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月16日
發(fā)明者韓燕全, 夏倫祝, 高家榮 申請人:韓燕全