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一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法，包括以下步驟：樣品經(jīng)過(guò)稀釋后加活性炭粉末，離心后取上清液，用濾膜過(guò)濾后得待測(cè)樣品；然后加入流動(dòng)相稀釋?zhuān)ㄈ?，過(guò)濾；樣品分析，將所述溶液進(jìn)行高效液相色譜測(cè)試，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。根據(jù)發(fā)明提供的方法，克服了傳統(tǒng)化學(xué)法測(cè)味精中焦谷氨酸靈敏度低、誤差大的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了精確、快速、同時(shí)檢測(cè)味精生產(chǎn)過(guò)程中谷氨酸和焦谷氨酸含量的目標(biāo)，檢出限低，靈敏度高，誤差小。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)分析測(cè)試領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]焦谷氨酸廣泛的存在于動(dòng)植物界，從人體的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、組織到咖啡豆、奶酪、啤酒等，都檢測(cè)到了焦谷氨酸的存在。有研究認(rèn)為它是一種毒性物質(zhì)，雖然還沒(méi)有人類(lèi)因此致癌的報(bào)道，但有實(shí)驗(yàn)證明它能使小白鼠致癌。歐盟對(duì)于食品添加劑味精報(bào)以謹(jǐn)慎的態(tài)度，從可能對(duì)人體健康安全性構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)的角度出發(fā)，規(guī)定味精中焦谷氨酸鈉的含量應(yīng)< 0.2%。在谷氨酸提取過(guò)程中，由于谷氨酸受熱而發(fā)生分子內(nèi)脫水，會(huì)產(chǎn)生一定量的焦谷氨酸，不僅降低了谷氨酸的提取率，同時(shí)也是影響味精母液中谷氨酸回收率的主要因素。因此，在生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)焦谷氨酸的含量進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行控制是非常必要的。
[0003]目前味精企業(yè)對(duì)焦谷氨酸的檢測(cè)普遍采用化學(xué)法，其原理:在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的環(huán)境下，焦谷氨酸被加熱可水解轉(zhuǎn)化為谷氨酸，通過(guò)測(cè)定谷氨酸在水解前后的含量之差，換算成焦谷氨酸的含量。由于取樣以及體積標(biāo)定均存在誤差，導(dǎo)致這種方法的誤差較大，不能滿(mǎn)足微量焦谷氨酸的測(cè)定。同時(shí)，在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，如果控制不當(dāng)，發(fā)酵液中會(huì)有谷氨酰胺生成，谷氨酰胺也會(huì)被加熱水解為谷氨酸。所以，若認(rèn)為水解后產(chǎn)生的谷氨酸都是由焦谷氨酸水解生成的，而忽略了谷氨酰胺的影響，就會(huì)使測(cè)得的焦谷氨酸的含量偏高。天津味精廠(chǎng)曾采用化學(xué)法對(duì)谷氨酸、谷氨酰胺、焦谷氨酸共存時(shí)的樣品進(jìn)行分別測(cè)定，這種檢測(cè)方法雖然更為準(zhǔn)確，但是檢測(cè)過(guò)程更為繁瑣。用化學(xué)法對(duì)焦谷氨酸的含量進(jìn)行測(cè)定，容易產(chǎn)生誤差，靈敏度不高，檢測(cè)過(guò)程也較為繁瑣，適用性不強(qiáng)。如要長(zhǎng)期定時(shí)檢測(cè)焦谷氨酸的含量，用化學(xué)法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，這也是大部分味精廠(chǎng)不愿檢測(cè)此項(xiàng)目的原因。
[0004]國(guó)際上很多學(xué)者在許多植物、動(dòng)物體內(nèi)及食品、飲料中采用高效液相色譜法檢測(cè)了焦谷氨酸的含量狀況。我們通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)了味精產(chǎn)品中焦谷氨酸的含量(味精中焦谷氨酸檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013，4 (4):372-378)。但為了對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行必要的控制，還需對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的焦谷氨酸含量進(jìn)行測(cè)定。味精生產(chǎn)主要包括發(fā)酵、發(fā)酵液濃縮、等電結(jié)晶、轉(zhuǎn)晶、谷氨酸中和、脫色、蒸發(fā)結(jié)晶等過(guò)程，需檢測(cè)發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮液、各結(jié)晶環(huán)節(jié)母液中的焦谷氨酸含量。由于這些樣品中還含有濕菌體、糖類(lèi)、色素及其他多種氨基酸，導(dǎo)致測(cè)試樣品的粘度和色度大，不能直接進(jìn)行液相色譜測(cè)定，必須進(jìn)行預(yù)處理。目前，液相色譜檢測(cè)樣品的預(yù)處理手段主要是膜過(guò)濾，防止顆粒物沉積在色譜柱內(nèi)。但味精生產(chǎn)過(guò)程中的樣品由于雜質(zhì)多、粘度大而無(wú)法直接進(jìn)行膜過(guò)濾處理，必須采用其他手段對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有測(cè)試技術(shù)及樣品預(yù)處理技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法，通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋、活性炭吸附、離心、過(guò)濾等手段，對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。采用高效液相色譜法，選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(ODS)氨基酸柱(4.6X250mm，5ym)，可以有效測(cè)定味精生產(chǎn)不同階段液體樣品(發(fā)酵液、發(fā)酵濃縮液、css中和液、一次母液、二次母液、二次母液濃縮液、水解液、三次母液、中和液、四次母液等)的谷氨酸和焦谷氨酸，這種方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高。
[0006]一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法，包括以下步驟:
[0007]樣品稀釋后加活性炭粉末，離心取上清液，濾膜過(guò)濾后即得待測(cè)樣品；然后加入流動(dòng)相稀釋?zhuān)ㄈ?，過(guò)濾；
[0008]樣品分析，將所述溶液進(jìn)行高效液相色譜測(cè)試，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
[0009]上述方法中，所述稀釋為樣品用去離子水稀釋10-20倍。味精生產(chǎn)過(guò)程中的發(fā)酵液等的粘度較大，對(duì)其進(jìn)行稀釋可以降低粘度并有效預(yù)防谷氨酸晶體析出，有利于通過(guò)過(guò)濾分離菌體和殘留物。當(dāng)稀釋體積超過(guò)原體積10倍時(shí)，濾液的過(guò)濾通量較高，原母液焦谷氨酸損失較少。
[0010]上述方法中，所述加活性炭為每100ml樣品加活性炭粉末2--4g。活性炭對(duì)母液脫色及截慮雜蛋白有一定的作用，當(dāng)活性炭用量大于20g / L時(shí)，濾液中的菌體及雜蛋白含量均處于較低的水平。
[0011]上述方法中，所述離心方法為轉(zhuǎn)速8000—1000Or / min,離心時(shí)間20min。
[0012]上述方法中，所述濾膜為0.45 μ m的微孔濾膜。
[0013]上述方法中，所述高效液相色譜測(cè)試時(shí)的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。
[0014]上述方法中，所 述樣品分析步驟中，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠填料氨基酸柱(4.6 X 250mm, 5 μ m);檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng):212nm ;進(jìn)樣量:20 μ L ;流速:0.5mL / min ;流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ2.5):甲醇=90: 10。
[0015]上述方法還包括標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，通過(guò)數(shù)據(jù)處理，得到味精中焦谷氨酸的濃度。
[0016]所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制包括谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。將處理好的溶液采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，所檢測(cè)的成份可分為谷氨酸和焦谷氨酸兩種。
[0017]標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制包括:谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制和焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。配置分別含谷氨酸和焦谷氨酸的系列標(biāo)準(zhǔn)混合液，然后用高效液相色譜儀測(cè)定，以濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)注曲線(xiàn)。所述谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制包括:配置谷氨酸濃度分別為0.5、1.0,2.0、3.0,3.5,4.0mg / mL的標(biāo)準(zhǔn)系列混合液，然后按照儀器操作條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列，以濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所述焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制包括:配置谷氨酸濃度分別為50、100、150、200、250、300、350μ g / mL的標(biāo)準(zhǔn)系列混合液，然后按照儀器操作條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列，以濃度對(duì)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0018]表1為谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)結(jié)果。谷氨酸和焦谷氨酸的標(biāo)準(zhǔn)混合液的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。
[0019]表1谷氨酸和焦谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液線(xiàn)性方程及檢測(cè)限
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)味精生產(chǎn)中焦谷氨酸的樣品預(yù)處理及測(cè)定方法，包括以下步驟: 樣品稀釋10?20倍，粉末活性炭吸附，離心后取上清液，濾膜過(guò)濾后即得待測(cè)樣品；然后加入流動(dòng)相稀釋?zhuān)ㄈ?，過(guò)濾；樣品分析，將所述溶液進(jìn)行高效液相色譜測(cè)試，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，樣品用去離子水稀釋10?20倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，稀釋后的樣品，每IOOml樣品加活性炭粉末2?4g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述離心方法為8000?10000r/min，20mino
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述濾膜為0.45 μ m的微孔濾膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色譜測(cè)試時(shí)的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品分析步驟中，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(ODS)氨基酸柱(4.6Χ250_，5μπι)；檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng):212nm ;進(jìn)樣量:20μ L ;流速:0.5mL / min ;流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖溶液(PH2.5):甲醇=90: 10。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103837625SQ201410104135
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】馮旭東, 潘馨, 劉明明, 展俠, 汪蘋(píng) 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)