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一種中藥活性成分篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于中藥領(lǐng)域，提供了一種中藥活性成分篩選方法，包括制備色譜柱、制備丹紅樣液及過色譜柱等步驟。本發(fā)明中藥活性成分篩選方法成功篩選出丹紅注中對于心腦血管疾病的活性成分，提高了篩選效率，同時大大提高了丹紅針劑的安全性。
【專利說明】一種中藥活性成分篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于新材料領(lǐng)域，尤其涉及一種中藥活性成分篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥注射劑是臨床常用心血管類疾病治療藥物。中藥注射劑是指在中醫(yī)理論指導下，采用先進的制備工藝，將中藥或天然藥物的單方或復方制成可供注入體內(nèi)的制劑，包括肌肉、穴位、皮內(nèi)、皮下、靜脈注射以及其他組織器官注射用的滅菌制劑以及供臨床前配制溶液的無菌粉末或濃縮液。與傳統(tǒng)劑型相比，中藥注射劑具有藥效迅速、無消化吸收過程等特點，適用于危重急癥的治療，尤以治療心血管疾病為宜。近20年心血管類中藥注射劑的研究取得了較大進展，并已廣泛應(yīng)用于臨床。
[0003]心血管類中藥注射劑治療主要涉及腦卒中、心肌梗死及合并休克、心律失常、冠心病、心絞痛等適應(yīng)癥。已批準生產(chǎn)的品種達30余種。按藥物組成分類，可分為單方和復方兩類。其中單方注射劑指由一味中藥或中藥提取物制備的注射劑，主要以活血化瘀藥物為主，如丹參、川芎等，也有補益類中藥，如人參、黃芪、刺五加等；復方注射劑是指以兩味及以上中藥制備，例如丹參系列(丹香冠心注射液、香丹注射液、丹紅注射液等)、人參/紅參系列(參麥注射液、參附注射液等)。
[0004]從市場角度上講，雖然目前心血管治療仍以西藥為主，但現(xiàn)實中中藥的市場份額正逐步擴大，在目前心血管類中藥制劑中，中藥注射劑占有比例最大。
[0005]但是，目前中藥注射液存在諸多問題。
[0006]中藥注射劑安全性問題顯著。
[0007]中藥注射劑形式具有療效準確、起效快、療程短等優(yōu)點。因而很適宜應(yīng)用到重癥、急癥以及一些疑難雜癥當中，并且其作用和療效是其他種類中藥制劑所不可比擬和相提并論的。然而，中藥注射制劑在醫(yī)學臨床上越來越多的得到應(yīng)用，但愈來愈多的中藥注射劑所引發(fā)的不良反應(yīng)以及醫(yī)療事故等現(xiàn)象頻發(fā)，從而使得患者和醫(yī)護人員對于中藥注射劑的應(yīng)用都存在著很大程度的隱憂。原因主要有:
[0008]注射劑由于直接進入人體，相對于口服制劑，對安全性有著更高的要求，明確的化學成分組成是最基本的技術(shù)要求，但中藥注射劑成分復雜，有效成分不明確，因而造成療效安全性不確定。例如部頒標準收載的70種注射劑中，有9種規(guī)定測定總黃酮成分，以蘆丁計算含量，這些品種的總黃酮成分中不一定都含有蘆丁，結(jié)構(gòu)不同，分子量不同，最大吸收波長也不盡相同，應(yīng)采用該品種本身含有的黃酮成分作對照品并計算含量。復方蒲公英注射液中蒲公英、魚腥草、野菊花三味藥均含黃酮類成分，但其結(jié)構(gòu)與分子量各異，均以蘆丁作對照并計算含量，科學性較差。
[0009]中藥注射劑在臨床缺乏信任的另一個重大原因是大多品種，尤其是早期研發(fā)品種沒有經(jīng)過嚴格的臨床前評價和臨床試驗，作用機制不明，更多的是依賴于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的解釋，而實際臨床應(yīng)用卻大多在西醫(yī)范疇，既沒有中醫(yī)的辯證論治，又沒有機理說明，不能滿足指導醫(yī)生臨床用藥的需要。2002年版《國家基本藥物目錄》中中藥注射劑及其同品種不同劑型藥品共72個進行調(diào)查分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)72個藥品中有5個藥品未檢索到文獻，17個藥品無臨床治療性文獻。
[0010]含有大量不溶性微粒，致敏原不明確是造成中藥注射劑不良反應(yīng)的第三大因素。臨床運用中常與輸液配伍，出現(xiàn)配伍后不同粒徑的微粒有倍增現(xiàn)象，輸液中的不溶性微粒侵人機體能引起肉芽腫和肺氣腫，造成供氧不足，引起靜脈炎、局部組織血栓和壞死，造成過敏反應(yīng)、熱原樣反應(yīng)及腫瘤樣反應(yīng)，具有很大的危害性。一些中藥注射劑的有效成分被認為有致敏作用，如雙黃連注射液中所含的綠原酸和異綠原酸就具有致敏原作用，可引起變態(tài)反應(yīng)，清開靈注射液含有水牛角提取物，內(nèi)含蛋白質(zhì)，也可能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，引起過敏反應(yīng)(如發(fā)熱、皮疹、紫癜)，又如復方丹參注射液致過敏機制，有報道說可能是由于丹參酮與酸性結(jié)晶體結(jié)合而非半抗原與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合，從而引起機體發(fā)生過敏反應(yīng)，另一種說法則認為可能是鞣質(zhì)所致。
[0011]由于活性成分不明確，是中藥針劑的安全性較低，這也是中藥針劑所面臨的一個問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]有鑒于此，本發(fā)明提供一種中藥活性成分篩選方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中藥制劑活性成分不明確的問題。
[0013]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的， [0014]一種一種中藥活性成分篩選方法，包括如下步驟:
[0015]提供a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱；
[0016]提供含丹紅樣液；
[0017]將所述丹紅樣液經(jīng)過所述a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理，將a ^腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理后的丹紅樣液經(jīng)過反相色譜柱處理，收集保留成分，得到丹紅活性成分；
[0018]所述含丹紅樣液是指丹參提取液和紅花提取液的混合物。
[0019]本發(fā)明中藥活性成分篩選方法，根據(jù)“鎖與鑰匙”理論，針對a A-AR開展丹紅注射液中心血管類活性成分快速篩選，具備以下優(yōu)勢:
[0020]第一:作為二次開發(fā)，丹紅注射液為中醫(yī)臨床常用治療心腦血管疾病治療藥物，大量文獻考證及臨床證明其有效性，活性成分篩選難度??；
[0021]第二:已有文獻研究表明丹參可通過阻斷a 1-AR，減輕去甲腎上腺素對心肌細胞的損害，從而達到抗去甲腎上腺素損傷的作用；
[0022]第三:根據(jù)“鎖與鑰匙”理論，由于受體色譜能夠較真實的反映體內(nèi)藥物和受體的作用規(guī)律，所以用這個體系篩選出的活性成分一般不會因為體內(nèi)的影響因素而被淘汰，這就大大提高了篩選的成功率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實施例中藥活性成分篩選方法過程中六通閥原理圖；
【具體實施方式】[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清除明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明實施例提供一種中藥活性成分篩選方法，包括如下步驟:
[0026]步驟SOl制備色譜柱:
[0027]提供a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱；
[0028]步驟S02制備丹紅樣液:
[0029]提供含丹紅樣液；
[0030]步驟S03過色譜柱:
[0031]將所述丹紅樣液經(jīng)過所述a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理，將a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理后的丹紅樣液經(jīng)過反相色譜柱處理，收集保留成分(在254、280nm波長下，收集此時間之后的所有保留峰，以單個峰為收集單位，分開保存)，得到丹紅活性成分；
[0032]所述含丹紅樣液是指丹參提取液和紅花提取液的混合物。
[0033]具體地，步驟SOl中，該a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱及其制備方法，請參見申請?zhí)枮?01210423978.X的中國發(fā)明專利申請公開文本。本發(fā)明包含申請?zhí)枮?01210423978.X的中國發(fā)明專利申請的全部內(nèi)容。
[0034]本發(fā)明在申請?zhí)枮?01210423978.X的中國發(fā)明專利申請的基礎(chǔ)上進行改進研究，該申請?zhí)枮?01210423978.X的中國發(fā)明專利申請?zhí)岢隽艘环N藥物篩選模型，但是對于具體的藥物的篩選，沒有做進一步的闡述。
[0035]本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，將該藥物篩選模型創(chuàng)造性的用于丹紅類藥物活性成分的篩選之中，準確的確定了丹紅類藥物的活性成分，取得了積極的、意想不到的技術(shù)效果。
[0036]例如，:
[0037]該a 腎上腺素受體亞型生物色譜柱制備過程如下:
[0038]K Q1A-腎上腺素受體的獲得
[0039]分別貼壁培養(yǎng)膜上高表達a ,-AR的HEK293細胞系，收集細胞保存在磷酸鹽緩沖液中。4 °C高速離心30.0min,轉(zhuǎn)速20000.0g.min-1,加入裂解液冰水浴超聲波提取 20min，(裂解液:10.0X 10-3mol.L-1Tris.HCl, pH7.4 ；50.0X10-3mol.L-1NaCl ；5X10-3mol.L-1EDTA ；1% Trit1nX-100 (V/V) ；0.05% SDS (ff/V) ；50.0X 10-3mol.L-1NaF ；100.0X 10_6mol.L-1Na3VO4 ；10.0X 10_3mol.L-1Na4P2O7 ；20.0yg.ml-1抑肽酶；20.0yg.ml-1亮抑酶肽；100.0yg.ml-1苯甲基磺酰氟)對細胞進行處理，獲得受體粗膜溶液。
[0040]制備2-哌嗪基-4-氨基-6，7- 二甲氧基喹唑啉-S印harose6B親和層析柱，采用親和層析法純化受體粗膜溶液。洗脫液A(100mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 2.0mM EDTA，0.1%的脫氧膽酸鈉，PH = 7.2)平衡層析柱30min后，將受體粗膜溶液上樣，用200mLA液洗脫，流速 1.0mL.min-1 ο 待基線平穩(wěn)后，換 200mLB 液(500mM NaCl, 50.0mM EDTA, 1.0% 的脫氧膽酸鈉，PH = 7.2)洗脫。B液中加入鹽酸特拉唑嗪梯度洗脫，鹽酸特拉唑嗪梯度范圍為0-80.0 μ M。收集120-150min的洗脫液。用S印hadex G50尺寸排阻柱除去收集液中游離的鹽，_70°C冷藏備用。[0041]2、a 腎上腺素受體亞型生物色譜柱制備
[0042]3、固定相的合成
[0043]準確稱取2g硅膠，加入60.0mL HC1，加熱回流4h (微沸)，停止反應(yīng)后，冷卻至室溫，抽濾(0.45μπι水系膜)，用水洗至pH為中性，110°C烘箱干燥過夜。將活化好硅膠放入250ml三頸瓶,加入Na干燥的甲苯10mL,通氮氣加熱回流,至甲苯沸騰,加入3mL Y -氨丙基三乙氧基硅烷，反應(yīng)過夜，停止反應(yīng)，抽濾，待有機試劑揮干，放入干燥器備用。
[0044]取2g干燥氨丙基硅膠，溶于50.0mLl.0g羰基二咪唑的乙腈溶液，置于圓底燒瓶中，室溫下攪拌，反應(yīng)2.0h ;停止反應(yīng)后，抽濾，水洗除去乙腈；硅膠中加入磷酸鹽緩沖液(pH7.2)及純化后的受體溶液5.0mL，4°C攪拌反應(yīng)2.0h ;抽濾，磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗去未鍵和蛋白質(zhì)；加入1.0%甘氨酸乙酯溶液50.0mL，4°C攪拌反應(yīng)30.0min ;抽濾，PBS洗去殘留的甘氨酸乙酯，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045]4、裝柱
[0046]采用濕法裝柱，以5.0mM Tris-HCl溶液(pH7.2)為勻漿液和頂替劑，在400bar的壓力下裝填色譜柱(150X4.6mm, 7.0 μ M)。
[0047]具體地，步驟S02中，所述含丹紅樣液是指丹參提取液和紅花提取液的混合物。丹紅樣液的制備方法如下:
[0048]其一，市售中藥注射劑適量，超純水稀釋10-50倍，0.45 μ m水系濾膜過濾，備用。
[0049]或者；
[0050]其二，選取市售中藥注射劑中對應(yīng)原藥材適量，超純水8-15倍回流提取3次，每次30min,趁熱過濾,收集續(xù)濾液，合并，冷卻至室溫后，0.45 μ m水系濾膜過濾,備用。
[0051]具體地，步驟S03中，該反相色譜柱處理和a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理在六通閥的作用下進行，具體如下:
[0052]請參閱圖1所示，將a ,-AR色譜柱及反相色譜柱通過六通閥并聯(lián)。a A-AR色譜柱Α，柱溫20°C，流動相A為5.0mM Tris-HCl溶液(pH7.2)，流動相B為65 %乙腈-5.0mMTris-HCl 溶液(ρΗ7.2)檢測波長 254、280nm。
[0053]樣品經(jīng)進樣器被流動相A輸送至六通閥d 口，經(jīng)c 口流經(jīng)a ^-AR色譜柱，然后經(jīng)f 口和e 口流入廢液接受瓶中，測過程中活性成分在Ci1A-AR色譜柱中富集，不保留成分則隨廢液排除；富集完成后轉(zhuǎn)換六通閥檔位，用泵B以0.8ml/min的流速輸送流動相B，從六通閥a 口進入，f 口留出流經(jīng)Ci1A-AR色譜柱，將富集在該色譜柱上的活性成分洗脫下來，再經(jīng)c 口進入，b 口留出，流經(jīng)反相色譜柱分離后，檢測器在指定波長處記錄色譜峰(254、280nm波長下，收集此時間之后的所有保留峰，以單個峰為收集單位，分開保存)，并收集流分備用。
[0054]活性成分檢測:
[0055]采用HPLC-MSn方法對2.4項下樣品進行分析。色譜條件為:色譜柱C18, 4.6 X 250mm ;柱溫30°C ;流動相:甲醇水體系；檢測波長254、280nm ;進樣量50 μ L。質(zhì)譜條件為=ESI源，正負 離子模式，掃描范圍50-2000m/z ;霧化氣壓力:40.0psi，載氣流量8L/min ;干燥氣溫度:325°C，毛細管電壓:_4200V。分別對樣品總離子流、多級裂解情況進行分析。
[0056]本發(fā)明實施例中藥活性成分篩選方法，以丹紅注射液等為具體研究對象，已經(jīng)從中藥注射液中初篩出2種活性成分，并經(jīng)過定性分析確定其可能的分子結(jié)構(gòu)。經(jīng)過與注射液相同的前處理和分析方法，平行制備的原藥材丹參及紅花樣品中也篩選出了上述成分，證明其確來源于藥材，方法真實可靠。
[0057]以下通過具體實施例對上述中藥活性成分篩選方法進行詳細闡述。
[0058]實施例
[0059]以丹紅注射液為例，篩選心血管類活性成分。
[0060]本發(fā)明實施例中藥活性成分篩選方法，包括如下步驟:
[0061]首先:提供a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱
[0062]步驟二:樣品前處理
[0063]市售丹紅注射劑適量，超純水稀釋50-100倍，0.45 μ m水系濾膜過濾，備用。中藥丹參、紅花飲片適量，超純水8-15倍回流提取3次，每次30min，趁熱過濾，收集續(xù)濾液，合并，冷卻至室溫后，0.45 μ m水系濾膜過濾,備用。
[0064]步驟三:丹紅注射液心血管類活性成分二維色譜初篩
[0065]將步驟二項下制備各樣品依次通過a A-AR色譜柱-反相色譜中藥注射劑心血管類活性成分二維色譜初篩系統(tǒng)(進樣樣量為50 μ L)，根據(jù)色譜圖，在廢液端收集保留成分，備用。
[0066]步驟三、中藥注射劑心血管類活性成分分析
[0067]采用HPLC-MSn方法對4.2項下樣品進行分析。色譜條件為:色譜柱C18, 4.6 X 250mm ;柱溫30°C ;流動相:甲醇水體系；檢測波長254、280nm ;進樣量50 μ L。質(zhì)譜條件為=ESI源，正負離子模式，掃描范圍50-2000m/z ;霧化氣壓力:40.0psi，載氣流量8L/min ;干燥氣溫度:325°C，毛細管電壓:_4200V。分別對樣品總離子流、多級裂解情況進行分析。在丹紅注射液中發(fā)現(xiàn)兩種活性物質(zhì)丹參素和羥基紅花黃色素。
[0068]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種中藥活性成分篩選方法，包括如下步驟: 提供a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱； 提供含丹紅樣液； 將所述丹紅樣液經(jīng)過所述a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理，收集保留成分； 將a r腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理后的丹紅樣液經(jīng)過反相色譜柱處理，收集保留成分，得到丹紅活性成分； 所述含丹紅樣液是指丹參提取液和紅花提取液的混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥活性成分篩選方法，其特征在于，所述丹紅樣液為經(jīng)過膜過濾處理后的丹紅注射液。
3.如權(quán)利要求1所述的中藥活性成分篩選方法，其特征在于，所述丹紅樣液的制備方法包括如下步驟: 提供丹參、紅花； 將丹參、紅花回流提??； 將提取液進行水系膜過濾，得到丹紅樣液。
4.如權(quán)利要求1所述的中藥活性成分篩選方法，其特征在于，所述反相色譜柱處理過程中，流動相為5.0mM的Tris-HCl溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的中藥活性成分篩選方法，其特征在于，所述Ci1-腎上腺素受體亞型生物色譜柱處理過程中，流動相為65%乙腈溶液與5.0mM的Tris-HCl溶液的混合液。
【文檔編號】G01N30/89GK104034819SQ201410284388
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月23日
【發(fā)明者】王雪艷, 鄭曉暉, 裴渭靜, 唐旭東 申請人:深圳清華大學研究院