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一種補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，包括菌懸液的制備及樣品處理、殺菌檢測(cè)和顯色判定，當(dāng)陽性血清對(duì)照組為陽性結(jié)果，陰性血清對(duì)照組、補(bǔ)體空白對(duì)照組和細(xì)菌活性對(duì)照組均為陰性結(jié)果時(shí)，待檢血清顯色或出現(xiàn)針尖狀沉淀為陰性結(jié)果，即不具有殺菌活性；待檢血清不顯色或出現(xiàn)片狀沉淀為陽性結(jié)果，即具有殺菌活性。本發(fā)明方法無需采用肉眼逐一進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，僅通過顯色或不顯色就可直觀、快速地判定待檢血清是否具有殺菌活性，每塊微孔板同時(shí)設(shè)立各照為檢測(cè)結(jié)果成立的條件，其檢測(cè)步驟簡(jiǎn)便、快速、可靠準(zhǔn)確。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)菌性疫苗免疫動(dòng)物或者健康人群后，產(chǎn)生的血清抗體具有功能性殺 菌或抑菌活性評(píng)價(jià)【技術(shù)領(lǐng)域】。 一種補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法 技術(shù)背景
[0002] 血清抗體殺菌力檢測(cè)，可以衡量一個(gè)特定物種的免疫球蛋白的功能特性。血清抗 體殺菌力檢測(cè)依賴抗體識(shí)別條件，通過經(jīng)典途徑激活，使表面暴露的抗原與補(bǔ)體、抗體結(jié) 合，導(dǎo)致抑菌或溶菌?，F(xiàn)有的血清抗體殺菌力檢測(cè)，其步驟及結(jié)果判定方法復(fù)雜，特別是需 要人的肉眼直接進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，誤差較大，試驗(yàn)耗時(shí)長，且適用范圍有限。以下以流腦血清 抗體殺菌力試驗(yàn)為例說明其現(xiàn)有血清抗體殺菌力檢測(cè)方法具體操作：
[0003] 1、菌懸液制備
[0004] 啟開菌種，于固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇培養(yǎng)后，接種于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。菌液稀釋 制成均勻的菌懸液。取菌懸液于波長為540nm的分光光度計(jì)上測(cè)其光密度值，再稀釋至所 需的最終濃度（例如：4000個(gè)菌落形成單位/毫升）。
[0005] 2、殺菌抗體檢測(cè) [0006] 2. 1待檢血清稀釋
[0007] 先在微孔板每孔內(nèi)加25 μ 1稀釋液。用移液器從每排第一孔內(nèi)加25 μ 1經(jīng)56°C、 30min滅活的待檢血清，吹吸5?10次后吸出25 μ 1至下一孔，如此作連續(xù)倍比稀釋至最后 一孔。
[0008] 2. 2殺菌反應(yīng)
[0009] 每孔中加入12. 5μ 1補(bǔ)體，再加入稀釋好的菌懸液12. 5μ 1，振蕩器上中速振蕩5 分鐘后，于37 °C培養(yǎng)25分鐘，再振蕩5分鐘。
[0010] 2. 3殺菌后顯色培養(yǎng)
[0011] 每孔加 50μ 1已熔化冷至45°C左右的TTC瓊脂后，微孔板置37°C條件培養(yǎng)15? 20小時(shí)后觀察結(jié)果。
[0012] 3、結(jié)果判定
[0013] 3.1對(duì)照設(shè)置
[0014] 陽性參考血清對(duì)照；4孔補(bǔ)體對(duì)照（稀釋液、補(bǔ)體、菌液各一滴，檢查補(bǔ)體自然殺菌 活性）；4孔細(xì)菌生長對(duì)照（稀釋液、滅活補(bǔ)體和靶菌菌液各12. 5 μ 1)。每次檢測(cè)時(shí)至少每 5塊微孔板中應(yīng)有一組上述三種對(duì)照試驗(yàn)。
[0015] 3. 2活菌計(jì)數(shù)判定結(jié)果
[0016] 3· 2· 1菌懸液空白對(duì)照檢驗(yàn)
[0017] 各孔滴完菌懸液之后，將該菌懸液兩滴分別滴加到一個(gè)瓊脂平皿的一端，沿著劃 好的兩條線傾斜下流，于37°C與微孔板同時(shí)培養(yǎng)，次日檢查每滴菌懸液的菌落數(shù)及其純度。
[0018] 3. 2. 2檢查三種對(duì)照設(shè)置的結(jié)果：
[0019] 補(bǔ)體的和細(xì)菌生長對(duì)照的各孔應(yīng)出現(xiàn)眾多的紅色點(diǎn)狀小菌落；陽性參考血清應(yīng)達(dá) 到原來確定的殺菌滴度。若所試各孔中紅色點(diǎn)狀菌落數(shù)目明顯地少于補(bǔ)體對(duì)照孔或不出現(xiàn) 紅色點(diǎn)狀菌落時(shí)，則判斷為殺菌陽性；如果所試孔中的菌落數(shù)目接近補(bǔ)體對(duì)照孔的一半或 更多時(shí)，則判斷為殺菌陰性。
[0020] 3. 2. 3殺菌結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
[0021] 通過人的肉眼觀察并一個(gè)一個(gè)逐一地計(jì)算菌落個(gè)數(shù)（活菌計(jì)數(shù)），根據(jù)紅色點(diǎn)狀 菌落數(shù)目的多少，以符號(hào)" + "記錄試驗(yàn)結(jié)果。若補(bǔ)體及靶菌生長對(duì)照各孔的細(xì)菌正常生長 時(shí)，應(yīng)出現(xiàn)眾多紅色點(diǎn)狀菌落，可記為"++++"。當(dāng)所試各孔與其比較，菌落數(shù)減少30%以 下，記為"+++";減少50%左右記為減少70%左右記為" + " ;每孔少于10個(gè)菌落則記 為"土"。以細(xì)菌生長成呈" + "及以下者判斷為殺菌陽性；以"++"及以上者判為殺菌陰性。 以出現(xiàn)殺菌陽性的血清最高稀釋度為殺菌抗體的最高滴度。
[0022] 因此，現(xiàn)有血清抗體殺菌力檢測(cè)結(jié)果判定需通過肉眼觀察計(jì)數(shù)菌落的活菌計(jì)數(shù)的 方式，獲得待檢血清組及生長對(duì)照組的活菌數(shù)并進(jìn)行比較，若待檢血清組活菌數(shù)相對(duì)于生 長對(duì)照組減少70%則判為陽性。由于微孔板上視野差，肉眼觀察計(jì)數(shù)菌落錯(cuò)誤率高，經(jīng)常出 現(xiàn)漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)的情況，結(jié)果誤差較大，工作量大、繁瑣復(fù)雜。若菌懸液濃度過高，菌落在 微小的孔內(nèi)密集生長呈片狀菌苔，觀察不到單一的菌落，導(dǎo)致無法對(duì)殺菌檢測(cè)結(jié)果予以判 定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有血清抗體殺菌力檢測(cè)方法存在需通過肉眼 觀察計(jì)數(shù)菌落，經(jīng)常出現(xiàn)漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)的情況，計(jì)數(shù)錯(cuò)誤率高，結(jié)果誤差較大，工作量大、 繁瑣復(fù)雜的缺陷。其目的是開發(fā)一種步驟簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀易于分辨，判定方法可靠的補(bǔ)體 介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法（Complement-Mediated Antibody-Dependent Bactericidal Activity Test, CMAB)〇
[0024] 本發(fā)明的方法是用抗原（疫苗或菌體）免疫試驗(yàn)動(dòng)物（包括品系小鼠、家兔、恒河 猴）或健康人群，獲得免疫后的特異性血清，再將特異性血清抗體、補(bǔ)體（與免疫動(dòng)物非同 源）和檢測(cè)菌按順序混合后反應(yīng)，選擇合適的活菌顯色劑區(qū)分具有活性的菌體和死菌，使 得實(shí)驗(yàn)者可快速直觀的對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。
[0025] 本發(fā)明所提供的技術(shù)方案如下：
[0026] 1. 一種補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0027] (1)菌懸液的制備及樣品處理
[0028] ①菌懸液制備
[0029] 在瓊脂固體培養(yǎng)基斜面上復(fù)蘇菌種，接種至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)得到菌液，按 照比濁法確定菌液的濃度，用生理鹽水將菌液稀釋成工作濃度即得菌懸液；
[0030] ②試劑準(zhǔn)備
[0031] 顯色劑配制成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為〇. 1 %?3 %的顯色劑溶液，將顯色劑溶液過濾除 菌，于2?8°C避光保存；
[0032] ③樣品處理
[0033] 補(bǔ)體為與免疫動(dòng)物非同源的動(dòng)物血清、陰性血清為免疫動(dòng)物注射生理鹽水的血 清，陽性血清為市售的目標(biāo)菌的診斷血清，補(bǔ)體稀釋至5?10倍，陽性血清和陰性血清分別 稀釋至原倍?10倍，將稀釋5?10倍的補(bǔ)體與菌懸液按體積比為1:1?1:2的比例混合 后冰浴靜置2?30分鐘得到活化菌懸液；
[0034] (2)殺菌檢測(cè)
[0035] ①加樣稀釋
[0036] 取待檢血清加至無菌微孔板的樣品孔中，用生理鹽水進(jìn)行倍倍稀釋；陽性對(duì)照樣 品孔、陰性對(duì)照樣品孔中分別加入稀釋至原倍?10倍的陽性血清和稀釋至原倍?10倍的 陰性血清；補(bǔ)體空白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入液體培養(yǎng)基，每個(gè)對(duì)照重復(fù)三孔；
[0037] ②殺菌反應(yīng)
[0038] 除細(xì)菌活性對(duì)照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步驟（1)③所述的活化菌懸 液，細(xì)菌活性對(duì)照孔中加入步驟（1)①所述的菌懸液，然后將微孔板于37°C條件孵育1?8 小時(shí)，再在微孔板的每個(gè)孔中加入37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基，再孵育1?12小時(shí)；
[0039] (3)顯色判定
[0040] ①顯色，在微孔板的每個(gè)孔中均加入步驟（1)②所配制的顯色劑溶液后，于37°C 孵育0. 5?6小時(shí)顯色；或?qū)⑽⒖装逵??8°C靜置過夜，在微孔板的每個(gè)孔中均加入步驟 (1)②所配制的顯色劑溶液，于37°C孵育0. 5?6小時(shí)顯色；
[0041] ②判定
[0042] 顯色或出現(xiàn)針尖狀沉淀為陰性結(jié)果，即不具有殺菌活性，不顯色或出現(xiàn)片狀沉淀 的為陽性結(jié)果，即具有殺菌活性；當(dāng)陽性血清對(duì)照組為陽性結(jié)果，陰性血清對(duì)照組、補(bǔ)體空 白對(duì)照組和細(xì)菌活性對(duì)照組均為陰性結(jié)果時(shí)，待檢血清顯色或出現(xiàn)針尖狀沉淀為陰性結(jié) 果，即不具有殺菌活性；待檢血清不顯色或出現(xiàn)片狀沉淀為陽性結(jié)果，即具有殺菌活性。
[0043] 2.根據(jù)技術(shù)方案1所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特 征在于：步驟（1)①菌懸液制備所復(fù)蘇的菌種為傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌屬、大腸埃希菌 屬、溶血性弧菌屬或痢疾志賀氏菌。
[0044] 3.根據(jù)技術(shù)方案2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特 征在于：
[0045] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為傷寒沙門菌時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體 培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，所述的工作濃度為 10X105 ?10X108/ml ;
[0046] 步驟⑴②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0047] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟⑵② 殺菌反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔 加入的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空 白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中 的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基；
[0048] 步驟（2)②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，，細(xì)菌活性對(duì)照孔 中加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的 用量為樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中 國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基；
[0049] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0050] 4.根據(jù)技術(shù)方案2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特 征在于：
[0051] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為副傷寒沙門菌屬時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液 體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，所述的工作濃度 為 10X105 ?10X108/ml ;
[0052] 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0053] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)② 殺菌反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔 加入的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空 白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中 的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基；
[0054] 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基 為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基；
[0055] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟⑴②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0056] 5.根據(jù)技術(shù)方案2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特 征在于：
[0057] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為大腸埃希菌屬時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液 體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養(yǎng)基，所述的工作濃度為 8X105/ml ?8X108/ml ;
[0058] 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0059] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)② 殺菌反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔 加入的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空 白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 38-2012 中的EC肉湯培養(yǎng)基；
[0060] 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基 為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養(yǎng)基；
[0061] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟⑴②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0062] 6.根據(jù)技術(shù)方案2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特 征在于：
[0063] 步驟⑴①菌懸液制備中菌種為溶血性弧菌屬時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體 培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 7- 2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基，所述的 工作濃度為 18X105/ml ?18X108/ml ;
[0064] 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為三苯基氯化四氮唑或四氮唑紫；
[0065] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)② 殺菌反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔 加入的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空 白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 7- 2013 中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基；
[0066] 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基 為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 7-2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基；
[0067] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟⑴②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0068] 7.根據(jù)技術(shù)方案2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特 征在于：
[0069] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為痢疾志賀氏菌時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體 培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基，所述的工作濃 度為 8 X 105/ml ?8 X 108/ml ;
[0070] 步驟⑴②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0071] 步驟⑵①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟⑵② 殺菌反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔 加入的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空 白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 5- 2012中 的志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基；
[0072] 步驟（2)②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基 為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基；
[0073] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0074] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果是：
[0075] 1、本發(fā)明方法提出了一種新的技術(shù)方案，無需現(xiàn)有技術(shù)采用肉眼逐一進(jìn)行活菌計(jì) 數(shù)的方法，僅通過顯色或不顯色就可直觀、快速地判定待檢血清是否具有殺菌活性，其檢測(cè) 步驟簡(jiǎn)便、快速、可靠準(zhǔn)確，克服了現(xiàn)有技術(shù)用肉眼活菌計(jì)數(shù)經(jīng)常易出現(xiàn)漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)、 計(jì)數(shù)錯(cuò)誤率高，結(jié)果誤差較大，工作量大、繁瑣復(fù)雜的缺陷。
[0076] 2、本發(fā)明方法在每塊微孔板同時(shí)設(shè)立了陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、補(bǔ)體空白對(duì)照孔、細(xì) 菌活性對(duì)照，并以各對(duì)照為應(yīng)有的結(jié)果為檢測(cè)結(jié)果成立的條件，檢測(cè)結(jié)果以各對(duì)照為驗(yàn)證， 使本發(fā)明方法的檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0077] 圖1是本發(fā)明補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法檢測(cè)顯色后結(jié)果 示例。

【具體實(shí)施方式】
[0078] 通過以下實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本發(fā)明并不局限于實(shí)施例，實(shí)例僅為本發(fā)明解 決案例之一。
[0079] 以下各實(shí)施例無特殊說明為常用方法。所用疫苗均由云南沃森生物技術(shù)股份有限 公司提供，也可向該公司購買，該公司地址：云南省昆明高新技術(shù)開發(fā)區(qū)北區(qū)科發(fā)路云南省 大學(xué)科技園，郵政編碼650106。
[0080] 實(shí)施例1甲型副傷寒結(jié)合疫苗免疫小鼠血清殺菌抗體檢測(cè)
[0081] 1菌懸液的制備及樣品處理
[0082] 1. 1菌懸液制備
[0083] 在瓊脂培養(yǎng)基斜面上復(fù)蘇甲型副傷寒菌株，37°C培養(yǎng)22小時(shí)，用接種環(huán)挑取適量 菌苔接種于液體培養(yǎng)基中，37°C搖育18小時(shí)，將菌液用生理鹽水比濁稀釋至10X10 7/ml即 得菌懸液，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基。
[0084] 1. 2試劑準(zhǔn)備
[0085] 顯色劑用生理鹽水配制成0. 1% (W/V)的顯色劑溶液，除菌過濾，2?8°C避光保 存，所述的顯色劑為四氮唑紫。96孔板的滅菌：96孔板放入75%乙醇中浸泡15分鐘，紫外 燈下照射30分鐘（或使用商品化的已滅菌96孔板）。
[0086] 1.3樣品處理
[0087] 補(bǔ)體為健康的實(shí)驗(yàn)用豚鼠血清，用生理鹽水將補(bǔ)體做5倍稀釋；陰性血清為健康 小鼠注射生理鹽水后獲得的血清，陽性血清為市售的沙門氏菌屬0:2因子診斷血清，陰性 血清和陽性血清分別用生理鹽水做10倍稀釋。將稀釋5倍的補(bǔ)體與10X 107/ml的菌懸液 等體積混合，冰浴中靜置20分鐘得到活化菌懸液。
[0088] 2殺菌檢測(cè)
[0089] 2. 1加樣稀釋
[0090] ①取各待檢血清樣品20μ 1分別加至1#?14#組樣品孔的第1孔中，用60μ 1生 理鹽水做4倍稀釋，然后從1#?14#組樣品孔的第1孔中取40 μ 1稀釋后待檢血清至第2 孔中，用40 μ 1生理鹽水做倍倍稀釋，如此做倍倍稀釋至第6孔（稀釋倍數(shù)見表1)，樣品孔 每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積均為40 μ 1，樣品孔每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積 與步驟2. 2殺菌反應(yīng)中①所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1。
[0091] ②陽性對(duì)照樣品孔加入10倍稀釋陽性血清40μ 1，重復(fù)三孔；陰性對(duì)照樣品孔加 入10倍稀釋陰性血清40 μ 1，重復(fù)三孔；補(bǔ)體空白對(duì)照孔加入液體培養(yǎng)基40 μ 1，重復(fù)三孔； 細(xì)菌活性對(duì)照孔加入40 μ 1液體培養(yǎng)基，重復(fù)三孔。補(bǔ)體空白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔加 入的液體培養(yǎng)基均為國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基。
[0092] 2. 2殺囷反應(yīng)
[0093] ①除細(xì)菌活性對(duì)照孔外，96孔板的其余各孔分別加入步驟1. 3所述的活化菌懸液 各20 μ 1 (與倍倍稀釋后的待檢血清體積比為1:2)。細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔加入5 X 107/ ml的菌懸液（不含補(bǔ)體）20 μ 1。加樣及稀釋倍數(shù)見表1。
[0094] ②96孔板于37°C條件孵育2小時(shí)，再在96孔板的每個(gè)孔中加入37°C預(yù)熱的培養(yǎng) 基100 μ 1 (即樣品孔每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積40 μ 1的2. 5倍），再孵育3小時(shí)。 所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基。
[0095] 表1.血清樣品稀釋表
[0096]

【權(quán)利要求】
1. 一種補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，包括以下步驟： (1) 菌懸液的制備及樣品處理 ① 菌懸液制備 在瓊脂固體培養(yǎng)基斜面上復(fù)蘇菌種，接種至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)得到菌液，按照比 濁法確定菌液的工作濃度，用生理鹽水將菌液稀釋成工作濃度即得菌懸液； ② 試劑準(zhǔn)備 顯色劑配制成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為〇. 1 %?3 %的顯色劑溶液，將顯色劑溶液過濾除菌，于 2?8°C避光保存； ③ 樣品處理 補(bǔ)體為與免疫動(dòng)物非同源的動(dòng)物血清、陰性血清為免疫動(dòng)物注射生理鹽水的血清，陽 性血清為市售的目標(biāo)菌的診斷血清，補(bǔ)體稀釋至5?10倍，陽性血清和陰性血清分別稀釋 至原倍?10倍，將稀釋5?10倍的補(bǔ)體與菌懸液按體積比為1:1?1:2的比例混合后冰 浴靜置2?30分鐘得到活化菌懸液； (2) 殺菌檢測(cè) ① 加樣稀釋 取待檢血清加至無菌微孔板的樣品孔中，用生理鹽水進(jìn)行倍倍稀釋；陽性對(duì)照樣品孔、 陰性對(duì)照樣品孔中分別加入稀釋至原倍?10倍的陽性血清和稀釋至原倍?10倍的陰性血 清；補(bǔ)體空白對(duì)照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入液體培養(yǎng)基，每個(gè)對(duì)照重復(fù)三孔； ② 殺菌反應(yīng) 除細(xì)菌活性對(duì)照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步驟（1)③所述的活化菌懸液，細(xì) 菌活性對(duì)照孔中加入步驟（1)①所述的菌懸液，然后將微孔板于37°C條件孵育1?8小時(shí)， 再在微孔板的每個(gè)孔中加入37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基，再孵育1?12小時(shí)； (3) 顯色判定 ① 顯色，在微孔板的每個(gè)孔中均加入步驟（1)②所配制的顯色劑溶液后，于37°C孵育 0. 5?6小時(shí)顯色；或?qū)⑽⒖装逵??8°C靜置過夜，在微孔板的每個(gè)孔中均加入步驟（1)② 所配制的顯色劑溶液，于37°C孵育0. 5?6小時(shí)顯色； ② 判定 顯色或出現(xiàn)針尖狀沉淀為陰性結(jié)果，即不具有殺菌活性，不顯色或出現(xiàn)片狀沉淀的為 陽性結(jié)果，即具有殺菌活性；當(dāng)陽性血清對(duì)照組為陽性結(jié)果，陰性血清對(duì)照組、補(bǔ)體空白對(duì) 照組和細(xì)菌活性對(duì)照組均為陰性結(jié)果時(shí)，待檢血清顯色或出現(xiàn)針尖狀沉淀為陰性結(jié)果，即 不具有殺菌活性；待檢血清不顯色或出現(xiàn)片狀沉淀為陽性結(jié)果，即具有殺菌活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特征在 于：步驟（1)①菌懸液制備所復(fù)蘇的菌種為傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌屬、大腸埃希菌屬、 溶血性弧菌屬或痢疾志賀氏菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為傷寒沙門菌時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體培 養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，所述的工作濃度為 10X105 ?10X108/ml ; 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔加入 的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空白對(duì) 照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩 沖蛋白胨水培養(yǎng)基； 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用量為 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中國國家 標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為副傷寒沙門菌屬時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體 培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，所述的工作濃度為 10X105 ?10X108/ml ; 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔加入 的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空白對(duì) 照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩 沖蛋白胨水培養(yǎng)基； 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中 國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為大腸埃希菌屬時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng) 基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養(yǎng)基，所述的工作濃度為8 X105/ ml ?8 X 108/ml ; 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔加入 的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空白對(duì) 照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 38-2012中的 EC肉湯培養(yǎng)基； 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中 國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養(yǎng)基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為溶血性弧菌屬時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng) 基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 7- 2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基，所述的工作 濃度為 18X 105/ml ?18X 108/ml ; 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為三苯基氯化四氮唑或四氮唑紫； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔加入 的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空白對(duì) 照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 7- 2013中的 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基； 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中 國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789. 7-2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的補(bǔ)體介導(dǎo)的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測(cè)方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為痢疾志賀氏菌時(shí)，所述的瓊脂固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng) 基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基，所述的工作濃度為 8X105/ml ?8X108/ml ; 步驟（1)②試劑準(zhǔn)備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應(yīng)中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對(duì)照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對(duì)照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補(bǔ)體空白對(duì)照孔的每孔加入的液體培養(yǎng)基的量和細(xì)菌活性對(duì)照孔的每孔加入 的液體培養(yǎng)基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補(bǔ)體空白對(duì) 照孔和細(xì)菌活性對(duì)照孔分別加入的液體培養(yǎng)基均為中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 5- 2012中的志 賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基； 步驟⑵②殺菌反應(yīng)中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細(xì)菌活性對(duì)照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個(gè)孔中加入的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預(yù)熱的培養(yǎng)基為中 國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個(gè)孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104101596SQ201410362470
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】李生迪, 吳俊波, 趙志宏, 白梅, 馬波, 張夢(mèng)菲 申請(qǐng)人:云南沃森生物技術(shù)股份有限公司