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專利名稱：三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定方法。
二背景技術(shù)：
已知三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物具有較強(qiáng)的還原性，能定向還原蛋 白質(zhì)中的雙硫鍵，對共存的其他官能團(tuán)沒有任何影響。同時(shí)，由于該化合物具 有良好的水溶性，因此，在蛋白質(zhì)的分離、轉(zhuǎn)移和重組過程中起著極為重要的 作用。此外，在生物化工和生物制藥領(lǐng)域也發(fā)現(xiàn)有潛在的應(yīng)用前景。然而，在 該化合物實(shí)際應(yīng)用的過程中，還缺乏一種靈敏度高、簡便和可操作性強(qiáng)的含量 分析技術(shù)。
Joan Christine Han等人曾提出了一種該化合物的分析方法(見Analytical Biochemistry ， 1994 , 220 : 5~10)，文中給出了有關(guān)測定原理并研究了影響測定的 因素。但由于該文著眼于理論研究而沒有給出比較詳細(xì)的操作細(xì)節(jié)，使得在實(shí) 際應(yīng)用過程中有諸多不便之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述現(xiàn)有問題，而提供一種關(guān)于三(2-羧乙基)膦鹽酸 鹽及其中性物含量的測定方法，該方法通過紫外-可見分光光度法的測定技術(shù)， 簡便、靈敏、易于操作和可以檢測至毫摩爾數(shù)量級的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及 其中性物的含量。
在一定pH值范圍內(nèi)，三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物(簡稱TCEP) 能定量地將芳香族雙硫鍵化合物還原，選用的雙硫鍵化合物具有對稱結(jié)構(gòu)，被 測物與還原產(chǎn)物具有嚴(yán)格的2: l的物質(zhì)的量的比例關(guān)系，以此作為定量計(jì)算的 依據(jù)。還原反應(yīng)速度很快，完全能滿足定量分析的需要。還原產(chǎn)物與原來的雙 硫鍵母體化合物及被測物三者間的紫外與可見光譜吸收特性顯著不同，而且雙硫鍵母體化合物及被測物在412 nm處或在343nm處的光譜均無明顯吸收;此外， 還原產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù)是已知的。據(jù)此可以很方便地計(jì)算出被測物的物質(zhì)量 及質(zhì)量百分含量。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性 物含量的測定方法，使用的雙硫鍵化合物有兩種 一種為5， 5'-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)，簡稱DTNB，；另一種為2， 2'-雙硫代雙吡啶，簡稱DTDP,測量 時(shí)選擇其中一種雙硫鍵化合物，其特征在于
1、 上述雙硫鍵化合物為5， 5'-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)時(shí)，適宜的pH 值范圍為6.5-8.0 ，推薦使用Tris-HC1緩沖體系，將pH值控制在7. 5左右； 雙硫鍵化合物為2， 2'-雙硫代雙吡啶時(shí)，pH在較寬范圍內(nèi)均可以實(shí)施本發(fā)明， 推薦的pH值為3-8。
2、 稱取一定質(zhì)量的DTNB或DTDP，加入少量Tris-HC1緩沖溶液使之溶解， 再定量轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，用Tris-HC1緩沖溶液稀釋至刻度并搖勻；配 制的此溶液濃度要高于待測樣品溶液的濃度。
3、 稱取一定質(zhì)量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物待測樣品，用蒸餾 水稀釋得到TCEP待測溶液。
4、 分別準(zhǔn)確吸取等量的TCEP待測溶液、DTNB溶液或DTDP溶液，于燒杯中 混勻，兩者經(jīng)一定反應(yīng)時(shí)間發(fā)生還原反應(yīng)，得到待測試液。
5、 將待測試液裝入比色皿中，調(diào)整好紫外-可見分光光度計(jì)，測定待測樣 品溶液的吸光度值，以測算出待測樣品TCEP的含量。
上述Tris-HC1緩沖溶液體系的pH值在7. 5左右。
上述三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物待測樣品的質(zhì)量濃度的計(jì)算公式為 C(g/L) 二歷/Z，式中歷為試樣TCEP的質(zhì)量，g; r為試樣溶液的體積，L 。 上述5， 5'-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)的還原產(chǎn)物為2-硝基-5-硫代苯甲
酸雙負(fù)離子，簡稱為NTB ,其在412nm處的摩爾吸收系數(shù)為14150
mol一1 *Lcm—、2,2'-雙硫代雙吡啶的還原產(chǎn)物為2-吡啶硫酮，簡稱2-DPD，在343 nm處2-DPD的摩爾吸收系數(shù)為7600 mo1—1L cnf1。
使用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行測定時(shí)，比色皿的厚度(光程)為lcm至5cm， 推薦使用lcm比色皿；當(dāng)使用DTNB為雙硫鍵化合物時(shí)，測定使用的最大波長為 412nm、當(dāng)使用DTDP為雙硫鍵化合物時(shí)最大波長為343nm。
推薦的待測樣品濃度范圍為5X10—6-40X10—6 mol !/、相應(yīng)的雙硫鍵化合 物濃度范圍為IOOXI(T mol L—i左右。
上述測定方法的實(shí)施過程可以在室溫下，即從20°C-3(TC進(jìn)行。
當(dāng)使用DTNB時(shí)，反應(yīng)時(shí)間從1分鐘至24小時(shí)，但推薦的反應(yīng)時(shí)間為10分 鐘以內(nèi)；使用2， 2' -DTDP時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可以在1 60分鐘內(nèi)進(jìn)行，推薦的時(shí) 間為IO分鐘以內(nèi)。
采用本發(fā)明涉及的測定方法，具有以下有益效果
a. 測定TCEP的靈敏度高，最低檢測濃度可以測到微摩爾數(shù)量級。
b. 測定速度快，幾分鐘至幾十分鐘即可完成一次測定全過程。
c. 本方法可以在較寬的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。
d. 使用的儀器為通'用型，因此一般實(shí)施者均有條件實(shí)施。具體實(shí)施例方式
實(shí)施方法的一般過程
在本發(fā)明中，進(jìn)行測定時(shí)需要控制一定的pH范圍。采用DTNB時(shí)，適宜的 pH值范圍為6.5-8.0 ，推薦值為7.5。控制的方法為采用各種緩沖體系溶液， 但磷酸及其鹽的緩沖體系是不適宜的。推薦使用Tris-HC1緩沖體系，將pH值 控制在7.5左右。
如果采用的雙硫鍵化合物為2， 2' -DTDP， pH在較寬范圍內(nèi)均可以實(shí)施本 發(fā)明，推薦的pH值為3-8。
在實(shí)施本發(fā)明的過程中，要求的反應(yīng)時(shí)間因使用不同的雙硫鍵化合物而不 同。當(dāng)使用DTNB時(shí)，反應(yīng)時(shí)間從1分鐘至24小時(shí)均不會對測定結(jié)果造成很大 影響，但推薦的反應(yīng)時(shí)間為IO分鐘以內(nèi)。若使用2， 2' -DTDP時(shí)，反應(yīng)時(shí)間控 制在10分鐘內(nèi)進(jìn)行為好。本發(fā)明的實(shí)施過程可以在室溫下進(jìn)行。使用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行測定
時(shí)，比色皿的厚度(光程)為lcm至5cm，為計(jì)算簡便起見，推薦使用lcm比色 皿。測定時(shí)使用的最大波長分別為412nm (當(dāng)使用DTNB為雙硫鍵化合物時(shí))和 343nm (當(dāng)使用2， 2' -DTDP為雙硫鍵化合物時(shí))。各有關(guān)試劑的濃度范圍可以 根據(jù)實(shí)施者的實(shí)際情況選擇，推薦的被測物濃度范圍為5 X 10—6-40 X 10—6 mol L—、相應(yīng)的雙硫鍵化合物濃度范圍為100X10—6 mol L—'左右，而且每一 次測定時(shí)，雙硫鍵化合物的濃度均應(yīng)高于被測物的濃度。 以下以使用DTNB為雙硫鍵化合物為例說明
本實(shí)例在pH 7.0 - 7. 5的Tris-HC1緩沖溶液體系中進(jìn)行，蒸餾水為重 蒸去離子水。
1. 稱取三羥甲基氨基甲烷6. lg左右，準(zhǔn)確至0.01g ，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移 至500ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻備用，得到濃度為0. 1 mol L—1的三羥甲 基氨基甲烷溶液。
2. 量取4. 2 ml 37%的濃鹽酸，倒入500ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度 后搖勻，得到濃度為0. 1 mol L—'的鹽酸溶液。
3. 將上述兩種溶液混合后，加水至1000ml，搖勻，得到pH7.5的Tris-HC1 緩沖溶液。
4. 稱取0. 01-0. 05g DTNB，準(zhǔn)確至0. OOOlg，置于50ml燒杯中，加入少量 Tris-HCl緩沖溶液使之溶解，再定量轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，用Tris-HCl緩 沖溶液稀釋至刻度并搖勻。應(yīng)當(dāng)注意的是，這里配制的溶液濃度要高于待測樣 品溶液的濃度。
5. 準(zhǔn)確稱取待測樣品0.005-O.Olg，準(zhǔn)確至O.OOOlg，用蒸餾水于1000ml 的容量瓶內(nèi)定容、搖勻，得到濃度相當(dāng)于5X10—6 -40X10—6 mol*L—i的TCEP 待測溶液。其質(zhì)量濃度的計(jì)算公式為C(g/L) =/z /y 。式中瓜為試樣TCEP的 質(zhì)量，g; Z為試樣溶液的體積，L 。
6. 分別準(zhǔn)確吸取等量的待測溶液(步驟5)和DTNB溶液(步驟4)，例如各 吸取10. Oml，于燒杯中混勻，兩者很快發(fā)生還原反應(yīng)并進(jìn)行完全(約需1-10分 鐘即可)，得到待測試液。
7. 將步驟6中的待測試液裝入lcm比色皿中，調(diào)整好紫外-可見分光光度計(jì)，于412nm處，以DTNB溶液(步驟4)為參比，測定待測樣品溶液的吸光度值( 以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示的待測樣品TCEP含量按下式計(jì)算
I(%)=0.5"x"xMxl00
式中
^ :試樣TCEP將DTNB (或DTDP)定量還原后的產(chǎn)物NTB (或2-DPD)在波長412 nm (或343 nm，但參比溶液要相應(yīng)改變)處的吸光度值；
/7 :在測試過程中，對待測試樣溶液進(jìn)行稀釋等操作過程的換算倍數(shù)，為正整
數(shù)(沒有進(jìn)行此過程時(shí)取l);
# :試樣TCEP的相對分子質(zhì)量，g mol—1;
《試樣TCEP將DTNB (或DTDP)定量還原后的產(chǎn)物NTB (或2-DPD)在波長 412 nm (或343 nm)處的摩爾吸收系數(shù)，14150 mol-1Lcnf1 (或7600 mo1—1L ciif); 力比色皿的厚度(光程)，cm ; C:試樣TCEP的原始濃度，g'L—1 ;
0.5 :試樣TCEP與DTNB (或DTDP)還原產(chǎn)物NTB (或2-DPD)之間物質(zhì)的量的 比例系數(shù)。
根據(jù)上述計(jì)算公式，得到品TCEP的含量。
權(quán)利要求
1、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定方法，使用的雙硫鍵化合物有兩種即5，5′-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)，簡稱DTNB；2，2′-雙硫代雙吡啶，簡稱DTDP，測量時(shí)選擇其中一種雙硫鍵化合物，其特征在于1)上述雙硫鍵化合物為5，5′-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)時(shí)，適宜的pH值范圍為6.5-8.0，推薦使用Tri s-HCl緩沖體系，將pH值控制在7.5左右；雙硫鍵化合物為2，2′-雙硫代雙吡啶時(shí)，pH在較寬范圍內(nèi)均可以實(shí)施本發(fā)明，推薦的pH值為3-8；2)稱取一定質(zhì)量的5，5′-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)或2，2′-雙硫代雙吡啶，加入少量Tris-HCl緩沖溶液使之溶解，再定量轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至刻度并搖勻；配制的此溶液濃度要高于待測樣品溶液的濃度；3)稱取一定質(zhì)量的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物待測樣品，用蒸餾水稀釋得到TCEP待測溶液；4)分別準(zhǔn)確吸取等量的TCEP待測溶液、DTNB溶液或DTDP溶液，于燒杯中混勻，兩者經(jīng)一定反應(yīng)時(shí)間發(fā)生還原反應(yīng)，得到待測試液；5)將待測試液裝入比色皿中，調(diào)整好紫外-可見分光光度計(jì)，測定待測樣品試液的吸光度值，以測算出待測樣品TCEP的含量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定 方法，其特征在于所述的5， 5'-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)的還原產(chǎn)物為 2-硝基-5-硫代苯甲酸雙負(fù)離子；2, 2'-雙硫代雙吡啶的還原產(chǎn)物為2-吡啶硫 酮。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定 方法，其特征在于所述的比色皿的厚度(光程)為lcm至5cm;當(dāng)使用DTNB 為雙硫鍵化合物時(shí)，測定使用的最大波長為412nm、當(dāng)使用DTDP為雙硫鍵化合 物時(shí)最大波長為343nm。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定 方法，其特征在于所述的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物待測樣品濃度范圍為5X10—6-40X10-6 mol L—、雙硫鍵化合物濃度范圍為100X10—6 mol 左右。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定 方法，其特征在于所述的測定方法的實(shí)施過程在室溫下，從2(TC-3(TC進(jìn)行。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定 方法，其特征在于所述的雙硫鍵化合物為5， 5'-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸) 時(shí)，反應(yīng)時(shí)間從1分鐘至24小時(shí)，推薦的反應(yīng)時(shí)間為10分鐘以內(nèi)；雙硫鍵化 合物為2， 2'-雙硫代雙吡啶時(shí)，反應(yīng)時(shí)間可以在l 60分鐘內(nèi)進(jìn)行，推薦的 時(shí)間為10分鐘以內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及其中性物含量的測定方法。使用雙硫鍵化合物5，5′-雙硫代雙(2-硝基苯甲酸)或2，2′-雙硫代雙吡啶，測量時(shí)選擇一種雙硫鍵化合物。步驟1)配制Tris-HCl緩沖溶液體系；2)取定量雙硫鍵化合物，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋；3)取定量待測樣品，配制TCEP待測溶液；4)吸取等量的TCEP待測溶液、DTNB溶液或DTDP溶液，混勻，兩者發(fā)生還原反應(yīng)，得到待測試液；5)選用比色皿，測定待測樣品試液在指定波長下的吸光度值，以測算出TCEP的含量。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)測定TCEP的靈敏度高，最低檢測濃度可以測到微摩爾數(shù)量級；可以在較寬的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。
文檔編號G01N21/31GK101655451SQ20091007040
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月10日
發(fā)明者姚小麗, 曹麗雯, 楊憶平, 翔 陳, 魯金芝 申請人:天津市朝日科貿(mào)有限公司