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一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用高效離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，包括樣品預(yù)處理、樣品測(cè)定和含量分析三個(gè)步驟，其特征在于：所述樣品測(cè)定步驟中流動(dòng)相的選擇為A泵：0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl；B泵：0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl+0.5mol/LNaCl。本發(fā)明采用高效液相離子交換色譜法對(duì)乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分分析測(cè)定，方法重現(xiàn)性良好，且可以很好的反映出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。
【專利說(shuō)明】一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α -乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛乳制品是現(xiàn)代日常飲食中不可或缺的組成部分，也是攝取蛋白質(zhì)的重要來(lái)源。牛奶中的乳清蛋白被稱為蛋白之王，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點(diǎn)，是公認(rèn)的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一，其主要成分包括β -乳球蛋白、α -乳白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等。
[0003]然而,對(duì)嬰幼兒而言,牛乳蛋白過(guò)敏癥(cow' milk allergy,CMA)是一種常見(jiàn)的蛋白過(guò)敏癥狀，發(fā)生率高達(dá)2%_6%，嚴(yán)重地影響嬰幼兒的身體健康。研究表明，牛乳制品中導(dǎo)致嬰幼兒過(guò)敏的蛋白成分主要是天然未變性的β_乳球蛋白和α-乳白蛋白。因此，建立牛乳β_乳球蛋白和α-乳白蛋白高特異性、高靈敏度、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，將對(duì)維護(hù)CMA患兒的健康起到積極的作用。目前，針對(duì)β_乳球蛋白和α-乳白蛋白檢測(cè)方法的研究多有報(bào)道，如常用的反相高效液相色譜法，但是，由于檢測(cè)過(guò)程使用有機(jī)溶劑如乙腈、甲醇等，會(huì)對(duì)導(dǎo)致天然蛋白成分發(fā)生變性，不能很好地反映出未變性的α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為解決上述問(wèn)題，提供了一種新的技術(shù)方案來(lái)滿足需求。
[0005]本發(fā)明的目的是提供了一種利用高效離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，包括樣品預(yù)處理、樣品測(cè)定和含量分析三個(gè)步驟，其特征在于:所述樣品測(cè)定步驟采用高效液相離子交換色譜法；所述采用高效液相離子交換色譜法中流動(dòng)相的選擇為A泵:0.02mol/L pH8.2的Tris- HCl ；B泵:0.02mol/LρΗ8.2 的 Tris- HC1+0.5 mol/L NaCl。
[0006]所述的樣品預(yù)處理分為液態(tài)樣品預(yù)處理和固體或粉末狀樣品預(yù)處理；所述液態(tài)樣品預(yù)處理為將樣品于4°C下采用轉(zhuǎn)速4000rpm離心IOmin ;所述固體或粉末狀樣品預(yù)處理為將樣品溶于適量去離子水后離心，離心后將液態(tài)部分調(diào)節(jié)PH至4.6，靜置lOmin，于4°C下采用轉(zhuǎn)速IOOOOrpm離心15min,棄去沉淀,上清液調(diào)節(jié)pH至6-7,用3倍體積0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl進(jìn)行稀釋。
[0007]所述的高效液相離子交換色譜法的色譜條件為色譜柱:4.6 mmX 3.5 cm的TSKgel DEAE-NPR ;柱溫:25°C ;進(jìn)樣體積:10μ L ;流速:lmL/min ;洗脫方式:0_5min等度洗脫100%A ；5-15min梯度洗脫0-100% B ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
[0008]所述的含量分析為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算α -乳白蛋白和β -乳球蛋白含量。
[0009]所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為分別準(zhǔn)確稱取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于0.02mol/L pH8.2的TriS- HCl配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾，分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0010]有益效果:本發(fā)明采用高效液相離子交換色譜法對(duì)牛乳制品中未變性α -乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)，在檢測(cè)過(guò)程中使用的流動(dòng)相為緩沖溶液，不會(huì)使乳品中的天然蛋白成分發(fā)生變性；而且本發(fā)明的方法重現(xiàn)性良好，所以可以很好的反映出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0012]圖1a-乳白蛋白和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜。
[0013]圖2原料乳色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面的實(shí)施列可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
[0015]實(shí)施例1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別準(zhǔn)確稱取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于0.02mol/L Tris- HCl(ρΗ8.2)配制成濃度為2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成濃度分別為0.05,0.1,0.2,0.4、
0.8、1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。α-乳白蛋白、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y = 625741.3Χ -68252.8 (相關(guān)系數(shù) R2=0.9923)和 Y = 510211.7Χ - 378208.3 相關(guān)系數(shù) R2=0.9869)，線性范圍均在50-1000 μ g/mL。以信噪比S/N=3測(cè)定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白最小檢出限分別為4 μ g/mL和12 μ g/mL。6次重復(fù)測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)也中的α -乳白蛋白和β -乳球蛋白的含量，RSD分別為4.3 %和3.6%，表明本方法重現(xiàn)性良好。
[0016]實(shí)施例2
原料乳中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分測(cè)定
原料乳于4°C下以4000rpm離心10分鐘,棄去脂肪,調(diào)節(jié)pH至4.6,靜置lOmin, 4°C下以IOOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心15min,0.45 μ m濾膜過(guò)濾。選用陰離子交換色譜柱TSKgel DEAE-NPR(4.6mmX3.5 cm),設(shè)置柱溫:25°C ;進(jìn)樣體積:10 μ L ;流速:lmL/min ；流動(dòng)相:A 泵:0.02mol/LTris- HCl (ρΗ8.2);Β 泵:0.02mol/L Tris- HCl (ρΗ8.2)+0.5 mol/L NaCl ;洗脫方式:0-5min等度洗脫100%A ;5-15min梯度洗脫0-100% B ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出原料乳中Ct-乳白蛋白和β -乳球蛋白含量分別為0.9mg/g和4.7mg/g。
【權(quán)利要求】
1.一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，包括樣品預(yù)處理、樣品測(cè)定和含量分析三個(gè)步驟，其特征在于:所述樣品測(cè)定步驟中采用高效液相離子交換色譜法；所述高效液相離子交換色譜法中流動(dòng)相的選擇為A泵:0.02mol/L ρΗ8.2 的Tris- HC1，B泵:0.02mol/L ρΗ8.2 的Tris- HC1+0.5 mol/L NaCl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的樣品預(yù)處理分為液態(tài)樣品預(yù)處理和固體或粉末狀樣品預(yù)處理；所述液態(tài)樣品預(yù)處理為將樣品于4°C下采用轉(zhuǎn)速4000rpm離心IOmin ;所述固體或粉末狀樣品預(yù)處理為將樣品溶于適量去離子水后離心，離心后將液態(tài)部分調(diào)節(jié)pH至4.6,靜置IOmin,于4°C下采用轉(zhuǎn)速IOOOOrpm離心15min,棄去沉淀,上清液調(diào)節(jié)pH至6-7，用3倍體積0.02mol/L ρΗ8.2的Tris-HCl進(jìn)行稀釋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的高效液相離子交換色譜法的色譜條件為色譜柱:4.6 mmX 3.5 cm的TSKgel DEAE-NPR ;柱溫:25°C ;進(jìn)樣體積:10 μ L ;流速:lmL/min ;洗脫方式:0_5min等度洗脫100%A ；5-15min梯度洗脫0-100% B ;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的含量分析為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算α-乳白蛋白和β_乳球蛋白含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項(xiàng)所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為分別準(zhǔn)確稱取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于0.02mol/L pH8.2的Tris- HCl配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾，分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103792316SQ201410032986
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】邵彪, 陳剛, 許蓓蓓, 施炎炎 申請(qǐng)人:南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所