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魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種魚膠原蛋白提取過程中的快速定量檢測方法及其應(yīng)用。該方法利用乙酸溶液配制膠原蛋白溶液，用天狼猩紅染色后，離心，測定上清液的吸光度，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量膠原蛋白含量。本發(fā)明利用天狼猩紅與膠原蛋白的特異性結(jié)合，離心后在特定波長540nm條件下通過測定上清液的吸光度，確定膠原含量。本發(fā)明通過測定離心后的上清液，不僅節(jié)約溶劑，避免溶液及其他試劑對膠原蛋白與天狼猩紅形成的特異性物質(zhì)的影響，且樣品回收率在95.7～104.7%之間，滿足分析研究的需要；平行樣品的變異系數(shù)為0.35%，具有很好的穩(wěn)定性；應(yīng)用于操作過程中對膠原蛋白的定量，可實現(xiàn)現(xiàn)時現(xiàn)測。
【專利說明】魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種魚膠原蛋白提取過程中的快速定量檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]魚鱗(皮)中含有豐富的膠原蛋白，從魚鱗(皮)中提取膠原蛋白可以充分利用魚鱗皮廢棄物，變廢為寶。因此測定提取過程中膠原含量的變化對研究魚鱗(皮)的功能性及產(chǎn)品性能具有重要的意義。
[0003]膠原或膠原蛋白的定量分析有多種方法，對于已知是膠原或膠原蛋白的樣品，凱氏定氮法是最可靠的，其次可用雙縮脲法、紫外分光光度法、Folin-酚法和考馬斯亮藍(lán)G-250染色等。但對于未知是膠原或膠原蛋白的樣品，以上方法則不太適合。膠原蛋白含量常規(guī)的測定方法是氯胺T氧化法，此法特異、準(zhǔn)確，但繁瑣、耗時。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的定量膠原蛋白存在檢測時間長、繁瑣等缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種提取過程中魚膠原蛋白含量的快速定量檢測方法。該方法操作簡單、快速，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述提取過程中魚膠原蛋白含量的快速定量檢測方法在膠原提取過程中快速定量的應(yīng)用。特別適用于魚鱗或魚皮中膠原蛋白提取過程中的定量測定。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn):
[0007]—種魚膠原蛋白提取過程中的快速定量檢測方法，利用乙酸溶液配制膠原蛋白待測溶液，天狼猩紅染色后，離心，測定上清液的吸光度，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量膠原蛋白含量。
[0008]上述方法具體包括以下步驟:
[0009](I)以乙酸溶液為溶劑配置膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到待測溶液，用天狼猩紅染色，離心后收集上清液，沉淀用乙酸溶液復(fù)溶，離心再次得到上清液；合并兩次上清液，測定在540nm處的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0010](2)樣品的測定:取魚膠原蛋白樣品，以乙酸溶液為溶劑配置成飽和溶液，得到待測溶液，用天狼猩紅染色，離心后，測定上層清液在540nm處的吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量膠原蛋白含量。
[0011]所述乙酸溶液的濃度為0.3?0.8mol/L (0.3?0.8M)。
[0012]優(yōu)選地，所述乙酸溶液的濃度為0.5mol/L。
[0013]所述天狼猩紅的溶液濃度為65?75mg/L。優(yōu)選地，所述天狼猩紅溶液濃度為69mg/L。
[0014]所述用天狼猩紅染色具體操作為把天狼猩紅溶液加入待測溶液中，混勻，室溫靜置10?40min染色。[0015]優(yōu)選地，所用天狼猩紅的量為每0.1ml待測溶液添加ImL天狼猩紅溶液。
[0016]所述的離心指在10000?15000r/min離心30min。
[0017]優(yōu)選地，步驟(I)所述配置膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液采用大鼠皮膚I型膠原為膠原標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0018]上述提取過程中魚膠原蛋白含量的快速定量檢測方法在膠原提取過程中快速定量的應(yīng)用。特別適用于魚鱗或魚皮中膠原蛋白提取過程中的定量測定。
[0019]本發(fā)明利用天狼猩紅與膠原特異性結(jié)合，離心后獲得紅色復(fù)合物，在特定波長540nm條件下通過測定上清液的吸光度，確定膠原含量。由于魚皮魚鱗中膠原蛋白提取過程工藝的復(fù)雜性，及提取液組成的復(fù)雜性(提取溶劑、雜蛋白和脂類等)的影響，“天狼猩紅與膠原特異性結(jié)合”原理在膠原蛋白魚鱗(魚皮)提取過程中含量的定量檢測中的應(yīng)用需要通過實驗來研究。本發(fā)明通過測定離心后的上清液，不僅有利于節(jié)約溶劑，且能避免傳統(tǒng)方法中復(fù)溶沉淀的氫氧化鈉溶液對膠原蛋白與天狼猩紅形成的特異性物質(zhì)的影響；再者，本發(fā)明優(yōu)選的天狼猩紅染料的溶度為69mg/L，能夠提高膠原蛋白定量的準(zhǔn)確性；此外，本發(fā)明主要應(yīng)用于操作過程中對膠原蛋白的定量，能實現(xiàn)現(xiàn)時現(xiàn)測的目的。
[0020]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果:
[0021]本發(fā)明的定量測定方法的樣品回收率在95.7?104.7%之間，平均回收率為99.8%，足以滿足分析研究的需要；平行樣品的變異系數(shù)為0.35%，測定在給定條件下具有很好的穩(wěn)定性；因為天狼猩紅法只對膠原蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合，而對氨基酸沒有此特性，因此與羥脯氨酸比色法相比，天狼猩紅測定方法結(jié)果更為準(zhǔn)確；且在膠原提取過程中常使用的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、白蛋白、卵清蛋白等)及其它試劑(1M NaCl、3M NaClUMKC1、0.1M MgCl2UM KH2PO4UM K2HPO4UM(NH4)2S04,0.1M Tris、0.5M Tris 以及0.5MTris +4M NaCl)等，以及魚鱗(皮)提取過程中產(chǎn)生的雜蛋白及脂類物質(zhì)都不會對測定結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，可以用來分析膠原提取過程中含量的變化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0023]圖2為不同提取次數(shù)對胃蛋白酶提取膠原的影響研究。
[0024]圖3為不同提取次數(shù)對乙酸提取膠原的影響研究。
[0025]圖4為不同溫度下乙酸提取膠原含量的曲線。
[0026]圖5為不同乙酸濃度提取膠原含量的曲線。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0028]實施例1:經(jīng)胃蛋白酶提取的魚鱗膠原蛋白含量測定
[0029](I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:膠原標(biāo)準(zhǔn)品(大鼠皮膚I型膠原)用0.5M乙酸溶解，稀釋為每IOOul含I?300ug膠原的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取11份膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液,每份0.1mL,膠原含量分別為為 lug、3ug、5ug、10ug、20ug、30ug、50ug、lOOug、150ug、200ug 和 300ug。每份中各加入Iml69mg/L天狼猩紅溶液,混勻，室溫靜置30min,然后以11000r/min離心30min,收集上清液，沉淀用相同濃度的乙酸復(fù)溶，以相同條件進(jìn)行離心得到上清液。合并兩次離心上清液，測定上清液在540nm處的吸光度。最后以吸光度為縱坐標(biāo)，膠原濃度為橫坐標(biāo)，繪制上清液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖1和表1。
[0030](2)將在4°C下經(jīng)胃蛋白酶提取后的膠原蛋白配置成飽和的0.5M乙酸溶液，取一份樣品0.1ml，加入Iml69mg/L天狼猩紅溶液，攪勻，室溫下靜置30min進(jìn)行染色，離心后，讀取540nm處吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得對應(yīng)的膠原濃度。結(jié)果見圖2。
[0031]表1標(biāo)準(zhǔn)膠原樣品的濃度和相對應(yīng)的吸光度值
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于利用乙酸溶液配制膠原蛋白待測溶液，用天狼猩紅染色后，離心，測定上清液的吸光度，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量膠原蛋白含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于具體包括以下步驟: (1)以乙酸溶液為溶劑配置膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到待測溶液，用天狼猩紅染色，離心后收集上清液，沉淀用乙酸溶液復(fù)溶，離心再次得到上清液；合并兩次上清液，測定在540nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)樣品的測定:取魚膠原蛋白樣品，以乙酸溶液為溶劑配置成飽和溶液，得到待測溶液，用天狼猩紅染色，離心后，測定上層清液在540nm處的吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量膠原蛋白含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:所述乙酸溶液的濃度為0.3?0.8mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:所述乙酸溶液的濃度為0.5mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:所述天狼猩紅的溶液濃度為65?75mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:所述天狼猩紅溶液濃度為69mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:所述用天狼猩紅染色具體操作為把天狼猩紅溶液加入待測溶液中，混勻，室溫靜置10?40min染色。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:所用天狼猩紅的量為每0.1ml待測溶液添加ImL天狼猩紅溶液；所述的離心指在10000?15000r/min 離心 30min。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法，其特征在于:步驟(I)所述配置膠原標(biāo)準(zhǔn)溶液采用大鼠皮膚I型膠原為膠原標(biāo)準(zhǔn)樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項所述的魚膠原蛋白提取過程中的定量檢測方法在膠原提取過程中快速定量的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/31GK103776778SQ201410013117
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】朱志偉, 梁健華, 曾慶孝, 李汴生, 張穎潔 申請人:華南理工大學(xué)