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專利名稱：：一種檢測ⅳ型登革病毒ns1抗原的免疫診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種醫(yī)用配制品，特別是用于診斷IV型登革病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
：登革熱是一種熱帶傳染病，通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，根據(jù)E蛋白的抗原性不同分為4個血清型，分別為I型、n型、m型和IV型(簡稱DV1、DV2、DV3和DV4)。任何型別的登革病毒感染均可引起一系列的臨床癥狀，表現(xiàn)為隱性感染、發(fā)熱、登革熱、或更為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合征。近年來，由于國際旅游業(yè)的發(fā)展和傳染性疾病的防治措施不當(dāng)，登革熱廣泛流行于熱帶和亞熱帶的100多個國家和地區(qū)，特別是東南亞一帶的流行甚為嚴(yán)重。目前，世界上約有25億人受到登革病毒感染的威脅，每年發(fā)生登革病毒感染患者超過1億人，并且有50萬人發(fā)展成為登革出血熱或登革休克綜合征，造成大約30000人死亡。初次感染登革病毒對于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生終身的免疫保護(hù)作用，但對于其它血清型的再次感染缺乏交叉免疫保護(hù)作用，同時由于存在抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)效應(yīng)(ADE)，異型登革病毒再次感染是導(dǎo)致登革熱患者發(fā)生登革出血熱的首要危險因素。而在登革疫區(qū)中，往往存在四型登革病毒的交替流行，增加了不同血清型別登革病毒反復(fù)感染的危險性，更增加了登革出血熱發(fā)生的可能性。由于ADE的存在，增加了登革疫苗研制的難度，目前，具有保護(hù)性的登革疫苗尚未研制成功，臨床上對登革病毒感染還缺乏特異性的治療藥物。實(shí)踐表明，早期確診能大大降低登革出血熱的發(fā)病率和死亡率，因此登革熱的治療很大程度上取決于早期感染的診斷。但是，多數(shù)登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流感樣癥狀，難以和其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，必須依賴于實(shí)驗(yàn)室的診斷。目前登革熱的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、抗體和核酸檢測。其中病毒分離是登革病毒感染診斷和血清型鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法費(fèi)時而且對于實(shí)驗(yàn)室的條件要求較高。盡管病毒核酸的檢測方法比傳統(tǒng)的病毒分離法更靈敏、更快速，但分子診斷操作相對繁瑣，對技術(shù)水平要求較高，并較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果，同時由于毒株的變異、潛在突變等序列改變也可能引起假陰性結(jié)果。而抗體檢測試劑不能用于早期診斷，而且由于4個血清型登革病毒之間以及與其它病毒屬間存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，特別是接種乙型腦炎病毒、黃熱病毒疫苗的人群易發(fā)生抗體假陽性反應(yīng)結(jié)果。因此，建立一種能夠特異性區(qū)分登革病毒四個血清型感染的早期診斷試劑盒勢在必行。登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructuralprotein1,NS1)是一種相對保守的糖蛋白，有膜型和分泌型兩種形式，在感染細(xì)胞中高度表達(dá)，具有很強(qiáng)的抗原性，且研究發(fā)現(xiàn)在登革熱患者的早期血中存在高濃度的NS1循環(huán)抗原，因此檢測急性期病人血清中的循環(huán)NS1抗原可用于早期診斷登革病毒感染或者預(yù)警登革出血熱(DHF)的發(fā)生。通過基于登革病毒NS1的抗原捕獲ELISA法來檢測登革病毒的方法可分為兩類，一類是在多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立的，這類方法在不同批次的抗血清中存在很大差異，難以重復(fù)和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化。另一類利用NS1的單克隆抗體來檢測登革病毒，如商品化的試劑盒Pan-EDengueEarlyELISAtestkit(Panbio，Queensland,Australia)禾卩PlateliaDengueNS1Agkits(Bio-Rad,France)。Pan-EDengueEarlyELISAtestkit含有抗IIV型登革病毒NS1的單克隆抗體，通過ELISA方法來實(shí)現(xiàn)登革病毒感染的早期診斷，其敏感度、特異性和穩(wěn)定性都有了較大的提高。但本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該試劑盒對IIV型的登革病毒的敏感度不同，分別為195PFU/mL、195PFU/mL、1563PFU/mL、25000PFU/mL，而早期感染登革病毒的患者血液樣本中的病毒含量相對較低，用該試劑盒檢測m型和iv型登革病毒的感染有可能會出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。再者，這兩種試劑盒不能區(qū)分四種血清型的登革病毒，由于不同血清型的登革病毒感染所引起的臨床癥狀和治療方案是不同的，臨床醫(yī)師必須盡早確定哪種血清型的登革病毒感染，以便于快速采取有效的治療措施。因此，及時確定登革病毒感染的類型，是降低登革病毒感染死亡率的前提，也是控制登革病毒擴(kuò)散的有效措施，而目前市面上的商品化試劑盒均無法達(dá)到此目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有高靈敏度和特異性的IV型登革病毒NS1抗原免疫診斷試劑盒，它可直接檢測到血液標(biāo)本中的DV4NS1抗原，實(shí)現(xiàn)登革病毒感染的早期分型診斷。為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測IV型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒是基于雙抗體夾心ELISA方法的檢測試劑盒，由包被捕獲抗體的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、與標(biāo)記物結(jié)合的檢測抗體、陽性對照物、陰性對照物、濃縮洗液、顯色液和終止液組成，其特征在于所述的捕獲抗體為單抗2E8A5，由保藏號為CCTCC一C200855的雜交瘤細(xì)胞株2E8A5分泌得到；所述的檢測抗體為單抗7A6A1，由保藏號為CCTCC—C200854的雜交瘤細(xì)胞株7A6A1分泌得到。本發(fā)明試劑盒中，所述的單抗2E8A5和單抗7A6Al均是IgGl亞類的免疫球蛋白，其中單抗2E8A5能同時與IV和ni型登革病毒的NS1蛋白結(jié)合，由保藏號為CCTCC一C200855的雜交瘤細(xì)胞株2E8A5分泌；單抗7A6A1能特異性結(jié)合IV型登革病毒，由保藏號為CCTCC一C200854的雜交瘤細(xì)胞株7A6A1分泌。所述的雜交瘤細(xì)胞株2E8A5和7A6A1是用重組的DV4NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾細(xì)胞和商品化的小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1融合，最后用HAT培養(yǎng)基篩選得到。本發(fā)明試劑盒中，所述的標(biāo)記物是指能標(biāo)記在抗體的非活性部位且可定量分析的物質(zhì)，例如酶；而相應(yīng)的顯色液則含有能與所述標(biāo)記物反應(yīng)并產(chǎn)生顏色變化的物質(zhì)，例如酶的底物。這些都是本領(lǐng)域的常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)這些常識輕易地選定標(biāo)記物與相應(yīng)的顯色液，如辣根過氧化物酶及其底物過氧化氫尿素和四甲基聯(lián)苯胺(簡稱TMB)就是ELISA試驗(yàn)中常用的標(biāo)記物及顯色液組合，也同樣適用于本發(fā)明。所述的樣品處理液、濃縮洗液和終止液均是雙抗體夾心ELISA方法中的常用試劑，所述的陽性對照物是指IV型登革病毒NS1蛋白，所述的陰性對照物是不含IV型登革病毒NS1蛋白的空白對照物。本發(fā)明試劑盒是一種基于雙抗體夾心ELISA方法的檢測試劑盒，其中所述的捕獲抗體2E8A5是一種具有交叉反應(yīng)性的單抗，間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示該單抗能同時結(jié)合m型和IV型登革病毒，但檢測抗體7A6A1是從一組抗IV型登革病毒NS1蛋白的單克隆抗體中篩選出來的，能特異性結(jié)合IV型登革病毒，因此，該試劑盒能準(zhǔn)確、快速地檢測出IV型登革病毒，而與其它i型、n型和m型登革病毒以及乙型腦炎病毒、黃熱病毒均無交叉反應(yīng)，且對iv型登革病毒具有很高的敏感度，檢測IV型登革病毒的敏感度是商品化試劑盒Pan-EDengueEarlyELISAtestkit的64倍，大大降低了漏檢的幾率，有利于登革病毒的早期診斷和治療；此外，本發(fā)明試劑盒能特異地檢測W型登革病毒，有利于對登革病毒感染作出早期分型診斷。同時，該試劑盒成本低，操作簡便，能同時快速檢測大批樣品；主要試劑均以工作液形式提供，操作簡便；具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)；也是目前國際上首個能特異性檢測到IV型登革病毒抗原的試劑盒。具體實(shí)施例方式下面通過具體的例子和實(shí)驗(yàn)報(bào)告進(jìn)一步闡明本發(fā)明的試劑盒1、所述的單抗2E8A5和7A6A1的制備方法和鑒定結(jié)果(1)免疫抗原的制備本發(fā)明用于制備單克隆抗體的免疫原為基因重組DV4NS1蛋白和己滅活天然的病毒抗原?；蛑亟MDV4NS1蛋白是用一種攜帶DV4NS1基因的工程菌株制備的，其制備按常規(guī)方法進(jìn)行，經(jīng)用鎳一次氮基三醋酸金屬親和層析的方法進(jìn)行純化獲得NS1抗原，詳細(xì)的制備方法可參照使用手冊。將NS1蛋白純化后，以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE，Cat,No.ED62976)定量。Westernblot對純化的重組蛋白鑒定結(jié)果顯示，小鼠抗hisMAb在分子量約45KDa處出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶，與預(yù)測的DV4NS1分子.量大小一致。己滅活天然的病毒抗原，是從DV4感染的病毒宿主細(xì)胞(C6/36,—種白蚊伊蚊細(xì)胞)獲得。(2)免疫小鼠取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積DV4NS1抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射30ng，以后每10天以弗氏不完全佐劑與天然的DV4抗原或重組的DV4NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV4NS1抗原1OO嗎進(jìn)行加強(qiáng)免疫。(3)雜交瘤細(xì)胞的制備和鑒定加強(qiáng)免疫3天后，無菌操作取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS-1按10:1的比例混合，在45%聚乙二醇(PEG,MW4000，Sigma)作用下進(jìn)行融合。具體方法如下在37"C水浴中，在lmin內(nèi)緩慢加入1.0mlPEG，邊加邊輕輕搖勻，分別于lmin、2min、3min、4min和5min內(nèi)加lml、2ml、3ml、4ml和5ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合，最后加入10ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫800rpm離心5min，棄上清，用60ml含15°/。胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕懸起細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液加入6塊96孔培養(yǎng)板上，在37X:、5%<:02的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日于融合細(xì)胞中加入12(^12XHAT培養(yǎng)基。以后每3天用1XHAT培養(yǎng)基換液一次，當(dāng)克隆長至占孔底面積的1/10時，取培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA法用NS1蛋白和DV4病毒進(jìn)行雙篩選。陽性克隆轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)ELISA和免疫熒光(DV4感染細(xì)胞抗原片)復(fù)測仍為強(qiáng)陽性的克隆用有限稀釋法進(jìn)行克隆化?？寺』?3次至陽性率達(dá)100%，選擇分泌抗體效價高的兩個細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)后置液氮保存，記為雜交瘤細(xì)胞株2E8A5和雜交瘤細(xì)胞株7A6A1,并于于2008年11月24號在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏登記號分別為CCTCC一C200855和CCTCC一C200854。(4)抗DV4NS1蛋白單克隆抗體亞類檢測采用間接ELISA方法檢測，方法如下用DV4抗原包被微孔板，封閉后與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育，再分別與1:IOOO倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球蛋白反應(yīng)，其中包括兔抗小鼠IgGl(美國ZYMEDLABORATORIES,INC,目錄號61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目錄號61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目錄號61-0320)，兔抗小鼠lgG3(同上，目錄號61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目錄號61-6820)。檢測結(jié)果顯示，上述兩株雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清均為IgGl陽性，即說明這兩株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體均為IgGl陽性。(5)單克隆抗體腹水制備和純化腹水制備采用體內(nèi)誘生法制備本發(fā)明中單克隆抗體，即在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水。具體方法如下每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml弗氏不完全佐劑(Sigma公司)，使瘤細(xì)胞能以腹水瘤形式在腹腔內(nèi)生長。大約12周后，將2><106個對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞懸浮于無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔。約12周后，用7號針頭放腹水，離心后收集腹水上清，立即加入疊氮鈉至終濃度為0.1%，存放于4'C備用。單抗純化采用辛酸一硫酸銨沉淀法純化腹水中的抗體，操作方法如下腹水用60mM、pH5.0醋酸緩沖液稀釋2倍，室溫下于30分鐘內(nèi)邊攪拌邊逐滴緩慢加入辛酸，為每毫升稀釋前腹水加33pl辛酸，出現(xiàn)大量沉淀，4'C靜置2小時，10000g，4。C離心30分鐘，取上清，加入1/10體積的pH7.4100mM磷酸鹽緩沖液，并用1N氫氧化鈉調(diào)pH值至7.4，冰浴攪拌下緩慢加入硫酸銨，為每毫升液體加入0.277硫酸銨即為45%飽和度，4'C靜置過夜，10000g、4'C離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于適量IOmM磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4'C透析過夜，換液三次。以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE,Cat,No.ED62976)定量。測定濃度后的抗體加入終濃度50W的甘油于-8(TC保存。(6)單克隆抗體的特異性鑒定a.間接ELISA法鑒定單克隆抗體的特異性分別用四個血清型重組DVNS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常規(guī)的間接ELISA法進(jìn)行檢測。即在包被的微孔板中加入本專利發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37'C孵育lh，加入l:1000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100—孔37。C孵育30min，加TMB顯色液室溫避光顯色10min，力口1MH2S04終止反應(yīng)，測450nm吸光值U45Q)。表l結(jié)果顯示本專利發(fā)明的單克隆抗體2E8A5和7A6A1均為DV4的特異性單抗；與其它三型登革病毒均無交叉反應(yīng)。表1DV4NS1單克隆抗體與重組DV4NS1抗原和天然DV4抗原反應(yīng)的間接ELISA結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>b.間接免疫熒光法鑒定單克隆抗體的特異性分別用DV1、DV2、DV3和DV4感染C6/36細(xì)胞，當(dāng)有2/3細(xì)胞出現(xiàn)病變時，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的lxPBS洗細(xì)胞二遍，然后將細(xì)胞滴于無菌干燥的玻片上，千燥后，制備成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分鐘后吹千，分別與陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG孵育，并設(shè)立未感染病毒的C6/36細(xì)胞抗原片作為陰性對照，最后用0.25%的伊文氏藍(lán)染色后，熒光顯微鏡下觀察熒光圖像，以熒光的強(qiáng)度和染色形態(tài)進(jìn)行結(jié)果判定，檢測抗體強(qiáng)度以(+++++)計(jì)為陽性，抗體強(qiáng)度(±)和(一)計(jì)為陰性。如表2結(jié)果顯示，本專利發(fā)明的單克隆抗體2E8A5與III型和IV型登革病毒同時結(jié)合的交叉性單抗；而7A6A1與DV4抗原特異性結(jié)合，而與其它三個血清型DV均無交叉反應(yīng)。表2DV4NS1單克隆抗體的免疫熒光檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>c.免疫印跡鑒定單克隆抗體的特異性將滅活DV4培養(yǎng)液或重組的DV4NS1蛋白，用2XSDS加樣緩沖液稀釋一倍，將樣品加到10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離蛋白質(zhì)，通過電洗脫使在凝膠上分離出來的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)印膜用含7%脫脂奶和3%BSA的lOraMPBS于4'C封閉24小時，將轉(zhuǎn)印膜裝在專門的反應(yīng)板中，分別加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中，室溫反應(yīng)l小時，用含有0.5XTVeen20的10mMPBS洗滌膜后，加入1:500倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)1小時，用同樣的洗滌液洗滌膜后，DAB顯色后，用去離子水終止顯色。結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗體2E8A5與重組DV4NS1蛋白和滅活DV4培養(yǎng)液在分子量為45千道爾頓可見一條很強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合帶，與預(yù)測分子量相一致；而特異性單抗7A6A1與重組DV4NS1蛋白和滅活DV4培養(yǎng)液均不產(chǎn)生反應(yīng)，可能跟單抗識別構(gòu)象表位有關(guān)。2、本發(fā)明試劑盒的組成和制備(l)所用試劑的配制a.樣品處理液由樣品處理液A和樣品處理液B組成,其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5MTris-Hcl溶液(PH9.7);b.濃縮洗液含有2%Tween-20的20XPBS，即1L溶液中含有4.56gNaH2P04,58.02gNa2HP04.12H20,175.3gNaCl,15磅20min高壓滅菌后，加入20mlTween-20攪勻，使用時20倍稀釋；c.陽性對照DV4天然NS1抗原1:1000稀釋液；d.陰性對照含0.腦een-20的10mMPH7.4PBS，制備方法如下將4.56gNaH2P04、58.02gNa2HP04.12H20和175.3gNaCl用水溶解并定量至1升，15磅20min高壓滅菌，稀釋20倍后加入0.1%Tween-20;e.顯色液由顯色液A和B組成，使用時取二者等量混勻使用。其中顯色液A、B的制備方法如下將0.89g檸檬酸和0.16gEDTA二鈉溶于1000ml水中，115。C高壓30min，降至90。C后加TMB0.25g，搖勻后得顯示液A，于4'C閉光保存；將9.33g檸檬酸和14.6gEDTA二鈉溶于1000ml水中，115。C高壓30min后，降至9(TC后加0.75%過氧化氫尿素12.8ml，搖勻后得顯示液B,于4'C閉光保存；f.終止液1M跳。(2)所述包被單抗2E8A5的微孔反應(yīng)板的制備方法如下將本發(fā)明單抗2E8A5用10mMpH7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋至lOlig/ml，用150n1/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4t^過夜。拍干后，每孔加入300^1/孔的0.25%酪蛋白(Sigma)的封閉液，于4'C過夜以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。甩干板條，真空干燥1224h，用鋁膜袋真空包裝4'C保存?zhèn)溆谩?3)所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗7A6A1的制備方法如下采用改良過碘酸鈉法，操作方法如下將5mgHRP攪拌溶解于lmL雙蒸水中，加入0.2mL新配0.1M過碘酸鈉避光室溫?cái)嚢?0min，置lmMpH4.4醋酸鈉緩沖液中，4'C透析過夜；次日加入0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液使PH值達(dá)9.0~9.5后，與預(yù)先調(diào)節(jié)pH至9.5的抗體10mg混合，在室溫避光輕輕攪拌23小時，然后加入100n1新配4mg/mL硼氫化鈉，4'C避光輕攪過夜；次日將過夜的抗體溶液用1XPBS稀釋510倍，冰浴攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨(硫酸銨用前先用氨水調(diào)pH至7.4),置4'C避光過夜；12OOOrpm4'C離心30rain，棄上清，沉淀溶于適量1XPBS緩沖液，并置1XPBS中4匸透析過夜，換液三次。收集結(jié)合物加入終濃度50%的2%BSA甘油-PBS保護(hù)劑，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，即為工作液。3、應(yīng)用本發(fā)明試劑盒檢測血清樣品中的W型登革病毒NS1抗原(1)檢測方法取待測的樣品50ul，加入樣品處理液A50U1,混勻后37。C作用lh，再加樣品處理液B1混勻，取100n1加入2E8A5包被的聚苯乙烯96孔微量測試板中，同時設(shè)陰性對照和陽性對照，37'C溫育lh，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板6次后，加入1:1000稀釋的HRP標(biāo)記的單抗7A6A1，100ul/孔，37。C溫育30min，同上洗板8次后，加顯色液(顯色液A和B等量混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，100yl/孔，室溫避光顯色10niin后，加入終止液，100u1/孔，終止反應(yīng)。(2)結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于450nm波長測定吸光度(A值)。陽性對照平均值》0.50，陰性對照平均值《0.10，實(shí)驗(yàn)成立。樣品A值》陰性對照A值平均值X2.1,則判為陽性，反之為陰性。(3)本發(fā)明試劑盒檢測相關(guān)病毒的特異性和靈敏度分析通過對DV1、DV2、DV3、DV4進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)確定病毒滴度分別為2.6X105PFU/mL、6.88X104PRJ/mL、2.37X105PFU/mL、7.84X105PFU/mL。采用上述建立的方法檢測滅活的DV1、DV2、DV3、DV4，從1乂105開始倍比稀釋多個梯度進(jìn)行檢測，同時以檢測四個血清型DVNS1抗原的商品化試劑盒"pan-EDENGUEEARLYELISA"(Panbio,Australia)進(jìn)行同步檢測比較，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果顯示對DV4培養(yǎng)上清的檢測靈敏度高達(dá)391PFU/ml，與其余3種血清型登革病毒培養(yǎng)液無交叉反應(yīng)，并且與其它黃病毒屬的病毒如乙腦病毒及黃熱病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)。說明建立的雙抗體夾心抗原捕獲ELISA檢測具有登革病毒血清型特異性。如表3所示。商品化的pan-EDENGUEEARLYELISA檢測結(jié)果顯示，對四個血清型的DV培養(yǎng)上清的檢測敏感性不同，詳見表4結(jié)果。商品化試劑盒對DV4培養(yǎng)上清的檢測靈敏度為25000PFU/ml，遠(yuǎn)低于本發(fā)明的試劑盒檢測DV4培養(yǎng)上清的靈敏度。雖然本發(fā)明試劑盒的結(jié)果判讀方式和商品試劑盒pan-EDENGUEEARLYELISA的不一樣，具體體現(xiàn)在認(rèn)定陽性的標(biāo)準(zhǔn)不同，但是在以下特異性實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明試劑盒按上述判讀方式檢測都沒有出現(xiàn)假陽性，說明本發(fā)明試劑盒的陽性標(biāo)準(zhǔn)是可靠的，同時也進(jìn)一步證明本發(fā)明試劑盒具有比現(xiàn)有技術(shù)更好的靈敏度和特異性。表3本發(fā)明試劑盒檢測四個血清型DV培養(yǎng)上清結(jié)果DV病毒病毒滴度(PFU/ml)500002500012500625031251563782391195DV10.078/-0.081/-0.08/-0.08/-0.086/-0.083/-0.083/-0.081/-0.082/-DV20.08/-0.078/-0.083/-0.08/-0.092/-0.1/-0.11/-O.脂-0.088/-DV30.116/-0.1/-0.119/-0.117/-0.118/-O.薩-0.12/-0.124/-O.讀-DV44.03/+3.987/+3.49/+2.362/+1.218/+0.693/+0.376/+0.222/+0.169/-Control0.1/-0.089/-0.094/-0.081/-0.097/-0.091/-0.098/-0.107/-0.1/-表注a:此試劑盒的結(jié)果判定如下樣品檢測值》陰性對照平均值的2.1倍(計(jì)算為0.095X2.1=0.2〉為陽性，反之為陰性。表4進(jìn)口試劑盒pan-EDENGUEEARLYELISA檢測四個血清型DV培養(yǎng)上清結(jié)果DV病毒病毒滴度(PFU/ml)50000250001250062503125156378239119597DV1104.8/+103.3/+103.0/+97.9/+92.5/+73.4/+53.2/+31.4/+16.7/+8.7ADV2103.7/+102.9/+99.4/-93.4/+83.3/+63.3/+41.1/+23.9/+11.6/+6.8/-DV395.7/+87.1/+76.3/+53.3/+32.0/十17.9/+9.7/-5.7/-3.3/-2.1/-DV431.7/+17.6/+9.7/隱5.6/-3.2/陽2.4/-1.7/-1.6/-1.4/-1.3/-Control2.2/國1.8/-1.6/-1.5/-1.4/-1.4/-1.4/-1.4/-1.4/-1.4/-表注此試劑盒的結(jié)果判定如下顯示值<9.0為陰性，顯示值9.0-11.0為可疑陽性，顯示>11.0為陽性。4、臨床試驗(yàn)首先將臨床血清標(biāo)本用1.5M甘氨酸(PH2.8)進(jìn)行預(yù)處理使NS1與血清中的抗體形成的復(fù)合物解離，從而釋放游離的NS1抗原，再用1.5MTris-Hcl(PH9.7)中和后用上述建立的10方法進(jìn)行檢測。本發(fā)明試劑盒檢測正常人血清標(biāo)本的特異性本發(fā)明的試劑盒檢測了500例正常人血清，用此檢測結(jié)果確定本方法的臨界值。對檢測值進(jìn)行分析，計(jì)算得平均值為0.125，標(biāo)準(zhǔn)差為0.025，以平均值加上5個標(biāo)準(zhǔn)差作為本方法的檢測臨界值即0.125+0.025X5=0.25，以大于或等于臨界值作為判斷檢測值陽性標(biāo)準(zhǔn)，500例正常人血清均為陰性，可確定本方法的特異度為100%。權(quán)利要求1、一種特異性檢測IV型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒是基于雙抗體夾心ELISA方法的檢測試劑盒，由包被捕獲抗體的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、與標(biāo)記物結(jié)合的檢測抗體、陽性對照物、陰性對照物、濃縮洗液、顯色液和終止液組成，其特征在于所述的捕獲抗體為2E8A5，由保藏號為CCTCC-C200855的雜交瘤細(xì)胞株2E8A5分泌得到；所述的檢測抗體為7A6A1，由保藏號為CCTCC-C200854的雜交瘤細(xì)胞株7A6A1分泌得到。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)記物是辣根過氧化物酶。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測特異性IV型登革病毒抗原的免疫診斷試劑盒，該診斷試劑盒包括包被單抗2E8A5的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、結(jié)合有標(biāo)記物的單抗7A6A1、陽性對照、陰性對照、濃縮洗液、顯色液和終止液。該試劑盒能特異性的檢測IV型登革病毒抗原，與其他3種血清型登革病毒抗原無交叉反應(yīng)，檢測IV型登革病毒培養(yǎng)上清敏感度是商品化同類試劑盒Pan-EDengueEarlyELISAtestkit的64倍，大大提高了臨床血清樣本檢測的靈敏度，同時也降低了臨床應(yīng)用中的漏檢現(xiàn)象。文檔編號G01N33/569GK101551393SQ20091003836公開日2009年10月7日申請日期2009年4月2日優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日發(fā)明者丁細(xì)霞,車小燕申請人:南方醫(yī)科大學(xué)