一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法
【專利摘要】一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法，本發(fā)明涉及飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法。本發(fā)明的目的是為了解決目前雙光子熒光顯微鏡成本昂貴、成像速度無(wú)法滿足需求。外界環(huán)境的影響容易導(dǎo)致飛秒激光器失鎖，而激光器失鎖后無(wú)法激勵(lì)樣品產(chǎn)生雙光子熒光信號(hào)。雙光子熒光顯微成像是對(duì)樣品特定成分進(jìn)行成像，不能對(duì)樣品進(jìn)行完整成像。一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于：所述系統(tǒng)包括：可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami(1)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數(shù)據(jù)采集卡(6)、電動(dòng)平移臺(tái)(7)、電動(dòng)平移臺(tái)控制器(8)、計(jì)算機(jī)(9)和分束片(10)；所述生物顯微鏡(2)包括反射鏡M1(11)、反射鏡M2(12)、二向色鏡(13)、發(fā)射濾波片(14)、物鏡(15)和聚光器(16)。本發(fā)明應(yīng)用于熒光顯微成像領(lǐng)域。
【專利說明】一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光是某些物質(zhì)受一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)的一種發(fā)光現(xiàn)象。十九世紀(jì)中期，英國(guó)科學(xué)家G.Stokes利用紫外光照射螢石礦物第一次觀察到了熒光現(xiàn)象，但是直到二十世紀(jì)三十年代，奧地利科學(xué)家M.Haitinger等人才將熒光標(biāo)記技術(shù)引入到生命科學(xué)領(lǐng)域，他們使用熒光染料對(duì)細(xì)菌病毒等特定成分進(jìn)行標(biāo)記，推動(dòng)了熒光顯微鏡的發(fā)展。
[0003]熒光顯微鏡的基本工作原理就是利用光照射有熒光物質(zhì)標(biāo)記的樣品，產(chǎn)生的熒光信號(hào)通過濾波片與激勵(lì)信號(hào)分開后被探測(cè)器采集，染料標(biāo)記區(qū)域就會(huì)被分辨出來(lái)。由于普通熒光顯微鏡使用的汞燈光源發(fā)射的主要是短波長(zhǎng)的紫外光，使得成像的分辨率大大提高。但是當(dāng)我們觀察較厚樣品時(shí)，樣品的不同層次深度上均有被標(biāo)記的結(jié)構(gòu)，而且相互堆疊起來(lái)，普通熒光顯微鏡的光源會(huì)同時(shí)激發(fā)樣品在焦點(diǎn)附近的較大一片區(qū)域，導(dǎo)致焦點(diǎn)上下的散射光也會(huì)被收集，降低了分辨率。除此之外，熒光顯微鏡受到衍射極限的限制，其分辨率很難達(dá)到Ium以下。
[0004]20世紀(jì)80年代后期,作為目前世界上非常先進(jìn)的生物學(xué)熒光成像技術(shù),共聚焦熒光顯微成像技術(shù)在生物材料的熒光顯微成像領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。相比于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，它的技術(shù)有以下改進(jìn):首先，采用方向性和單色性良好的激光作為光源消除了色差的影響；其次，共聚焦技術(shù)中小孔的存在擋住了焦點(diǎn)以外的雜散光，提高了信噪比；最后，逐點(diǎn)逐行掃描只會(huì)激發(fā)焦平面內(nèi)極小區(qū)域的熒光，避免了標(biāo)本上相鄰點(diǎn)的衍射光和散射光的干擾，大大提高了圖像的清晰度和精密度。
[0005]共聚焦熒光顯微成像技術(shù)如圖1所示，裝置包括激光光源(I)、樣品(2)、探測(cè)器
(3)、物鏡(4)、焦點(diǎn)(5)、二向色鏡(6)和共焦小孔(7)，以光學(xué)系統(tǒng)的共焦成像為基礎(chǔ)，激光光源(I)、樣品(2)和探測(cè)器(3)處于彼此共軛的位置。光源經(jīng)物鏡(4)在樣品(2)內(nèi)聚焦成衍射極限的光點(diǎn)，樣品發(fā)射的熒光被物鏡(4)匯聚到達(dá)共焦小孔(7)內(nèi)，被靠近共焦小孔(7)的探測(cè)器(3)接收。激光通過對(duì)樣品進(jìn)行的掃描而對(duì)物體進(jìn)行成像。然而共焦小孔(5)不僅擋住了焦點(diǎn)(5)以外產(chǎn)生的熒光，還擋住了焦點(diǎn)(5)產(chǎn)生的被生物組織散射的熒光，導(dǎo)致熒光的收集效率下降。
[0006]雙光子熒光顯微成像技術(shù)如圖2所示，裝置包括激光光源(I)、樣品(2)、探測(cè)器
(3)、物鏡(4)、焦點(diǎn)(5)和二向色鏡￠)，與共聚焦熒光顯微成像技術(shù)不同的是，雙光子熒光顯微成像技術(shù)利用近紅外的飛秒激光作為光源而非利用紫外光源。而且雙光子吸收的非線性本質(zhì)使得雙光子熒光顯微成像技術(shù)無(wú)需共焦小孔的加入，與傳統(tǒng)的單光子激光共聚焦顯微鏡相比，雙光子熒光顯微成像技術(shù)具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):①熒光收集率高:雙光子顯微成像無(wú)需共焦小孔的加入，因此熒光收集效率大大提高；②光損傷小:雙光子熒光顯微鏡的激勵(lì)源使用可見光或者近紅外光，它們對(duì)生物活體組織的光損傷小，因此可以對(duì)樣品進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的科學(xué)研究；③空間分辨率和對(duì)比度高:由于在雙光子顯微成像中，熒光只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生，焦點(diǎn)外無(wú)熒光產(chǎn)生，背景熒光影響小光漂白區(qū)很小:焦點(diǎn)外不發(fā)生漂白現(xiàn)象。⑤成像深度大:可見光或近紅外光比紫外光的穿透性強(qiáng)，一般情況下，共聚焦熒光顯微成像技術(shù)的成像深度只能達(dá)到50 μ m左右，而雙光子顯微成像技術(shù)的成像深度可達(dá)1600 μ m 對(duì)探測(cè)光路的要求低:對(duì)于雙光子顯微成像而言，發(fā)射突光的波長(zhǎng)值與激發(fā)光相差很大，因此對(duì)探測(cè)收集系統(tǒng)的要求比單光子共焦顯微鏡低；⑦適合多標(biāo)記復(fù)合成像:由于很多染料熒光探針的雙光子激發(fā)光譜比較寬，多種探針可以同時(shí)被單一波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，進(jìn)而得到同一樣品的不同信息。
[0007]雖然商業(yè)化的雙光子熒光顯微鏡已經(jīng)問世，但是其成本昂貴、成像速度無(wú)法滿足需求。外界環(huán)境的影響很容易導(dǎo)致飛秒激光器失鎖，而激光器失鎖后無(wú)法激勵(lì)樣品產(chǎn)生雙光子熒光信號(hào)。雙光子熒光顯微成像是對(duì)樣品特定成分進(jìn)行成像，不能對(duì)樣品進(jìn)行完整成像。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是為了解決目前雙光子熒光顯微鏡成本昂貴、成像速度無(wú)法滿足需求。外界環(huán)境的影響容易導(dǎo)致飛秒激光器失鎖，而激光器失鎖后無(wú)法激勵(lì)樣品產(chǎn)生雙光子熒光信號(hào)。雙光子熒光顯微成像是對(duì)樣品特定成分進(jìn)行成像，不能對(duì)樣品進(jìn)行完整成像。而提出了一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)及其成像方法。
[0009]上述的發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0010]一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述系統(tǒng)包括:可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數(shù)據(jù)采集卡￠)、電動(dòng)平移臺(tái)(7)、電動(dòng)平移臺(tái)控制器(8)、計(jì)算機(jī)(9)和分束片(10);所述生物顯微鏡⑵包括反射鏡Ml (11)、反射鏡M2(12)、二向色鏡(13)、發(fā)射濾波片(14)、物鏡
(15)和聚光器(16)；
[0011]所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)產(chǎn)生的激光經(jīng)過分束片(10)對(duì)激光進(jìn)行分束，分別進(jìn)入生物顯微鏡(2)和光譜儀(3)，光譜儀(3)用于監(jiān)控可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)的工作狀態(tài)，激光進(jìn)入生物顯微鏡(2)經(jīng)反射鏡Ml (11)反射進(jìn)入二向色鏡
(13)，通過物鏡(15)打到電動(dòng)平移臺(tái)(7)上的樣品，然后一部分激光穿過樣品，經(jīng)聚光器
(16)聚焦，反射鏡M2(12)反射，進(jìn)入光電二極管(5)采集透射信號(hào)，把透射信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；另一部分激光返回物鏡(15)，通過二向色鏡(13)，經(jīng)發(fā)射慮波片(14)濾除雜波，進(jìn)入光電倍增管(4)采集熒光信號(hào)，把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；光電倍增管(4)和光電二極管(5)的數(shù)據(jù)傳入數(shù)據(jù)采集卡￠)，數(shù)據(jù)采集卡￠)的數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī)(9)，計(jì)算機(jī)(9)通過電動(dòng)平移臺(tái)控制器⑶控制電動(dòng)平移臺(tái)(7)移動(dòng)，電動(dòng)平移臺(tái)(7)位于聚光器(16)和物鏡(15)間，由兩個(gè)表面平坦且相互正交垂直的X軸平移臺(tái)和Y軸平移臺(tái)組成；計(jì)算機(jī)控制電動(dòng)平移臺(tái)以完成成像。
[0012]一種權(quán)利要求1所述飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法，其特征在于:一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法包括如下步驟:
[0013]步驟一、將可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami發(fā)出的激光進(jìn)行分束:一束激光通過多模光纖與光譜儀連接，從而監(jiān)控可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami的工作狀態(tài)；另一束激光與生物顯微鏡連接，用來(lái)激勵(lì)樣品；
[0014]步驟二、光束經(jīng)過生物顯微鏡的物鏡后，光束分為前向透射光和后向出射光；
[0015]步驟三、前向透射光經(jīng)過聚光器的收集后進(jìn)入光電二極管，光電二極管輸出的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集；
[0016]步驟四、后向出射光被物鏡收集后，通過二向色鏡將激光與熒光分開，經(jīng)發(fā)射濾波片后，進(jìn)入光電倍增管進(jìn)行探測(cè)采集熒光，光電倍增管輸出的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集;
[0017]步驟五、將數(shù)據(jù)采集卡采集的信息傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行雙光子熒光顯微成像；
[0018]步驟六、計(jì)算機(jī)控制電動(dòng)平移臺(tái)以完成成像。
[0019]發(fā)明效果
[0020]采用本發(fā)明的雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成像方法，可以充分利用已有的儀器設(shè)備，而且許多實(shí)驗(yàn)器材均為自行組裝制作而成，而非購(gòu)買昂貴的商業(yè)化產(chǎn)品，因此自行搭建的雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成本相對(duì)低廉，而且還可以根據(jù)自己需求搭建系統(tǒng)。例如，力口入多個(gè)二向色鏡實(shí)現(xiàn)了多通道復(fù)合成像，還可以通過選擇不同的掃描振鏡獲得不同的成像速度。
[0021]一般情況下，我們很容易通過輸出光譜的信息判斷激光器的工作狀態(tài)。圖4為激光器在鎖模和失鎖狀態(tài)下的輸出脈沖的光譜信息，從中可以看出，失鎖時(shí)輸出為一個(gè)尖峰信號(hào)，與鎖模狀態(tài)下的光譜形狀相差較大。因此在實(shí)驗(yàn)過程中利用光譜儀監(jiān)測(cè)激光器的輸出光譜信息就可以判斷激光器的鎖模狀態(tài)。
[0022]同時(shí)，本發(fā)明采用透射成像的原理進(jìn)行顯微成像，透射顯微成像就是利用樣品的不同位置對(duì)通過物鏡的光的透過率不同而進(jìn)行的顯微成像。通常入射光被聚焦到樣品上從而使得入射光強(qiáng)最大，然后光通過物鏡并被目鏡收集，眼睛透過目鏡便可以看到樣品被放大的透射像。透射成像可以對(duì)樣品進(jìn)行完整成像，因此，透射顯微成像不僅可以檢驗(yàn)雙光子熒光顯微成像的正確性，還對(duì)雙光子熒光顯微成像信息進(jìn)行了補(bǔ)充。
[0023]在進(jìn)行雙光子熒光顯微成像時(shí)，實(shí)驗(yàn)采用UPLSAP040X2萬(wàn)能平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，其放大倍數(shù)為X 40，數(shù)值孔徑為0.95，濾波片為帶通濾波片BP580-70k和紅外截止濾波片，將掃描間隔設(shè)置為ΙΟμπι，掃描范圍為lXlmm2，得到像素為100X100圖像，如圖5，激光進(jìn)入顯微鏡前功率為45mW，從圖中可以明顯看出Rhodamine B染料的痕跡。
[0024]對(duì)于透射顯微成像技術(shù)，由于光電二極管的增益較大，而數(shù)據(jù)采集卡的輸入范圍是+-5v，激光進(jìn)入顯微鏡前功率為40 μ W，其它參數(shù)與雙光子熒光顯微成像設(shè)置一致，成像大小lXlmm2，像素為100X 100，如圖6雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對(duì)應(yīng)，證明了本發(fā)明搭建的雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的正確性；如圖7和圖8所示，雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對(duì)應(yīng)，證明了本發(fā)明搭建的雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的正確性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是共聚焦顯微成像技術(shù)原理圖；
[0026]圖2是雙光子突光顯微成像技術(shù)原理圖；
[0027]圖3是本發(fā)明成像系統(tǒng)裝置示意圖；
[0028]圖4是可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami在失鎖和鎖模狀態(tài)下的輸出光譜，失鎖狀態(tài)用細(xì)線表示，鎖模狀態(tài)用粗線表示；
[0029]圖5是本發(fā)明實(shí)施例一 Rhodamine B樣品的雙光子突光顯微成像；
[0030]圖6是本發(fā)明實(shí)施例一 Rhodamine B樣品的透射成像；
[0031]圖7是本發(fā)明實(shí)施例二雙光子熒光顯微成像；
[0032]圖8是本發(fā)明實(shí)施例二透射成像。
【具體實(shí)施方式】
[0033]【具體實(shí)施方式】一:結(jié)合圖3說明本實(shí)施方式,一種飛秒激光雙光子突光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述系統(tǒng)包括:可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數(shù)據(jù)采集卡￠)、電動(dòng)平移臺(tái)(7)、電動(dòng)平移臺(tái)控制器(8)、計(jì)算機(jī)(9)和分束片(10);所述生物顯微鏡(2)包括反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)、二向色鏡(13)、發(fā)射濾波片(14)、物鏡(15)和聚光器(16)；
[0034]所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)產(chǎn)生的激光經(jīng)過分束片(10)對(duì)激光進(jìn)行分束，分別進(jìn)入生物顯微鏡(2)和光譜儀(3)，光譜儀(3)用于監(jiān)控可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)的工作狀態(tài)，激光進(jìn)入生物顯微鏡(2)經(jīng)反射鏡Ml (11)反射進(jìn)入二向色鏡
(13)，通過物鏡(15)打到電動(dòng)平移臺(tái)(7)上的樣品，然后一部分激光穿過樣品，經(jīng)聚光器
(16)聚焦，反射鏡M2(12)反射，進(jìn)入光電二極管(5)采集透射信號(hào)，把透射信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；另一部分激光返回物鏡(15)，通過二向色鏡(13)，經(jīng)發(fā)射慮波片(14)濾除雜波，進(jìn)入光電倍增管(4)采集熒光信號(hào)，把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；光電倍增管(4)和光電二極管(5)的數(shù)據(jù)傳入數(shù)據(jù)采集卡￠)，數(shù)據(jù)采集卡￠)的數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī)(9)，計(jì)算機(jī)(9)通過電動(dòng)平移臺(tái)控制器⑶控制電動(dòng)平移臺(tái)(7)移動(dòng)，電動(dòng)平移臺(tái)(7)位于聚光器(16)和物鏡(15)間，由兩個(gè)表面平坦且相互正交垂直的X軸平移臺(tái)和Y軸平移臺(tái)組成；計(jì)算機(jī)控制電動(dòng)平移臺(tái)以完成成像。
[0035]所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami為美國(guó)光譜物理公司(Spectra-Physics)所生產(chǎn)的摻鈦藍(lán)寶石固體激光器系統(tǒng)Tsunami，為中心波長(zhǎng)800nm，重頻82MHz，脈寬約50fs的超短脈沖鎖模激光；
[0036]所述二向色鏡用于反射激光，透射熒光；由美國(guó)Chroma公司生產(chǎn)，型號(hào)為680dcspxr ；
[0037]所述發(fā)射濾波片由紅外截止濾波和帶通濾波片構(gòu)成；帶通濾波片是兆九光電公司的產(chǎn)品BP580/70K和BP450/100k。紅外截止濾波片為Chroma公司的NC212066_ET670sp型女口廣叩；
[0038]所述光譜儀是美國(guó)海洋光學(xué)公司(Ocean Optics)的HR400光纖光譜儀；
[0039]所述光電倍增管是日本濱松公司(Hamamatsu)生產(chǎn)的R3896型；
[0040]所述光電二極管為PIN型光電二極管；
[0041]所述數(shù)據(jù)采集卡為研華公司生產(chǎn)的PC1-1714型數(shù)據(jù)采集卡。
[0042]所述電動(dòng)平移臺(tái)為英國(guó)pr1r公司的H117P2IX型電動(dòng)平移臺(tái)。
[0043]所述電動(dòng)平移臺(tái)控制器用于電動(dòng)平移臺(tái)的手動(dòng)和外部驅(qū)動(dòng)控制；為H31XYZE型控制器。用于Hl 17P2IX型電動(dòng)平移臺(tái)的手動(dòng)和外部驅(qū)動(dòng)控制。
[0044]所述計(jì)算機(jī)利用電動(dòng)平移臺(tái)控制器控制電動(dòng)平移臺(tái)移動(dòng)；同時(shí)接收數(shù)據(jù)采集卡傳來(lái)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行成像。
[0045]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:所述發(fā)射濾波片(14)由帶通濾波片和紅外截止濾波片構(gòu)成，帶通濾波片位于靠近二向色鏡(13)的一側(cè)，紅外截止濾波片位于靠近光電倍增管(4)的一側(cè)。
[0046]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是:所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami產(chǎn)生的激光是中心波長(zhǎng)為800nm、重頻為82MHz、脈寬為50fs的超短脈沖鎖模激光。
[0047]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一、二或三不同的是:所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出，分束片(10)軸向豎直放置，與可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)同軸設(shè)置，表面與光線成45° ;反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)、電動(dòng)平移臺(tái)(7)、物鏡(15)和聚光器(16)同軸設(shè)置，與可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出和分束片
(10)垂直設(shè)置，反射鏡Ml(ll)、反射鏡M2(12)軸向與地面成45°放置，表面與光線成45° ;二向色鏡(13)軸向與地面成45°放置,表面與光線成45° ;物鏡(15)和聚光器(16)同軸豎直放置；電動(dòng)平移臺(tái)(7)與地面成水平放置；發(fā)射濾波片(14)軸向豎直放置，表面與光線成90° ;光線水平射入光電倍增管(4)、光電二極管(5)。
[0048]【具體實(shí)施方式】五:一種權(quán)利要求1所述飛秒激光雙光子突光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法，其特征在于:一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法包括如下步驟:
[0049]步驟一、將可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami發(fā)出的激光進(jìn)行分束:一束激光通過多模光纖與光譜儀連接，從而監(jiān)控可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami的工作狀態(tài)；另一束激光與生物顯微鏡連接，用來(lái)激勵(lì)樣品；
[0050]步驟二、光束經(jīng)過生物顯微鏡的物鏡后，光束分為前向透射光和后向出射光；
[0051]步驟三、前向透射光經(jīng)過聚光器的收集后進(jìn)入光電二極管，光電二極管輸出的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集；
[0052]步驟四、后向出射光被物鏡收集后，通過二向色鏡將激光與熒光分開，經(jīng)發(fā)射濾波片后，進(jìn)入光電倍增管進(jìn)行探測(cè)采集熒光，光電倍增管輸出的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集;
[0053]步驟五、將數(shù)據(jù)采集卡采集的信息傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行雙光子熒光顯微成像；
[0054]步驟六、計(jì)算機(jī)控制電動(dòng)平移臺(tái)以完成成像。
[0055]所述生物顯微鏡為奧林巴斯研究級(jí)倒置顯微鏡1X71。
[0056]光電二極管是一種PIN硅光電二極管，由于可調(diào)諧飛秒激光器輸出激光的中心波長(zhǎng)在800nm，而DETlOA在800nm有很好的響應(yīng)靈敏度，因此DETlOA可以用于對(duì)透射光進(jìn)行探測(cè)。
[0057]二向色鏡將入射激光透射至物鏡，同時(shí)確保產(chǎn)生的熒光信號(hào)能夠通過反射到達(dá)探測(cè)器，因此二向色鏡的透過率對(duì)雙光子熒光的收集效率影響很大；該二向色鏡對(duì)小于700nm波長(zhǎng)的光透過率極低，但是對(duì)高于720nm波長(zhǎng)的光透過率高于90 %，可以使大部分激光透過到達(dá)待測(cè)樣品。使用的二向色鏡為美國(guó)Semrock公司生產(chǎn)的FF705-Di01-25x36型女口廣叩；
[0058]發(fā)射濾波片由帶通濾波片和紅外截止濾波片構(gòu)成,帶通濾波片用于對(duì)RhodamineB和DAPI染料的研究，紅外截止濾波片可以濾除400nm-660nm外的雜散光。光電倍增管(Photomultiplier Tube,PMT)是一種基于光電子發(fā)射效應(yīng)、二次電子發(fā)射和電子光學(xué)理論把微弱入射光轉(zhuǎn)換成電子同時(shí)獲得倍增效果的重要真空發(fā)射器件，使用的光電探測(cè)儀器是由日本濱松公司生產(chǎn)的R3896型光電倍增管，其具有較高的量子效率和陽(yáng)極靈敏度。
[0059]數(shù)據(jù)采集卡是研華公司生產(chǎn)的PC1-1714型數(shù)據(jù)采集卡，它是一款基于32位PCI總線架構(gòu)的高性能數(shù)據(jù)采集卡，采樣速度可達(dá)30MHz/秒，到主機(jī)內(nèi)存的A/D采樣具有連續(xù)不間斷、高速和流式數(shù)據(jù)的特點(diǎn)；將包含前向后向出射光的信息送入計(jì)算機(jī)，進(jìn)行處理后得到成像息;
[0060]計(jì)算機(jī)通過電動(dòng)平移臺(tái)控制器對(duì)電動(dòng)平移臺(tái)進(jìn)行外部驅(qū)動(dòng)操作，電動(dòng)平移臺(tái)通過控制電動(dòng)平移臺(tái)沿X、Y軸的平移，改變激光照射電動(dòng)平移臺(tái)上樣品的位置以完成圖像采集。
[0061]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】五不同的是:所述步驟一中將實(shí)驗(yàn)樣品放于顯微鏡的電動(dòng)平移臺(tái)上，光束經(jīng)過顯微鏡的物鏡照射在電動(dòng)平移臺(tái)上，從而完成對(duì)樣品的激勵(lì)操作。
[0062]采用以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0063]實(shí)施例一:
[0064]采用本發(fā)明構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)Rhodamine B樣品進(jìn)行雙光子突光顯微成像。Rhodamine B樣品制備步驟如下:首先,稱取4mg的Rhodamine B粉末置于試管中；其次，用移液器移取5ml的蒸餾水至裝有粉末樣品的試管中；最后，用磁力攪拌機(jī)攪拌均勻，得Rhodamine B溶液。將Rhodamine B溶液隨意滴在載玻片上,等待風(fēng)干后,制備成待測(cè)樣品，利用已搭建好的顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行雙光子熒光顯微成像和透射成像研究。在進(jìn)行雙光子熒光顯微成像時(shí)，實(shí)驗(yàn)采用UPLSAP040X2萬(wàn)能平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，其放大倍數(shù)為X 40，數(shù)值孔徑為0.95，濾波片為帶通濾波片BP580-70k和紅外截止濾波片，將掃描間隔設(shè)置為10 μ m，掃描范圍為lXlmm2，得到像素為100X100圖像，其結(jié)果如圖5所示。為了避免漂白現(xiàn)象，激光進(jìn)入顯微鏡前功率為45mW，從圖中可以明顯看出RhodamineB染料的痕跡。
[0065]對(duì)于透射顯微成像技術(shù)，由于光電二極管的增益較大，而數(shù)據(jù)采集卡的輸入范圍是+-5v，激光進(jìn)入顯微鏡前功率為40 μ W，其它參數(shù)與雙光子熒光顯微成像設(shè)置一致，成像大小lXlmm2，像素為100 X 100，其成像結(jié)果如圖6所示，由對(duì)比可知，雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對(duì)應(yīng)，證明了本發(fā)明搭建的雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的正確性。
[0066]實(shí)施例二:
[0067]Rhodamine B也常常用于細(xì)胞和生物組織的染色，實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)染有Rhodamine B的Hela細(xì)胞進(jìn)行雙光子熒光顯微成像，其樣品制備過程如下:
[0068](a)制備 Rhodamine B 儲(chǔ)存液:將 0.5mg Rhodamine B 溶解到 ImL PBS 緩沖液中，充分?jǐn)噭蚝?，制備成Rhodamine B儲(chǔ)存液。并置于4°C的溫度下保存；
[0069](b)染色:將DAPI儲(chǔ)存液稀釋1000倍后加入培養(yǎng)基中，與Hela細(xì)胞在37°C共同孵育過夜；
[0070](c)漂洗:用PBS緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行漂洗，至少漂洗6次從而將未結(jié)合的RhodamineB 洗掉；
[0071](d)制備細(xì)胞懸液:用酶消化后離心得到細(xì)胞，將其加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液；
[0072](e)封片:取少量細(xì)胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片后封片。
[0073]在對(duì)染有Rhodamine B染料的細(xì)胞進(jìn)行成像時(shí)，采用UPLSAP040X2萬(wàn)能平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡，其放大倍數(shù)為X 40，數(shù)值孔徑為0.95，飛秒激光中心波長(zhǎng)800nm，帶寬50nm，入射到顯微鏡之前的激光功率為60mw，利用BP580-70K型帶通濾波片。其成像結(jié)果如圖7和圖8所示。由對(duì)比可知，雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對(duì)應(yīng)，證明了本發(fā)明搭建的雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的正確性。
【權(quán)利要求】
1.一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述系統(tǒng)包括:可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數(shù)據(jù)采集卡￠)、電動(dòng)平移臺(tái)(7)、電動(dòng)平移臺(tái)控制器(8)、計(jì)算機(jī)(9)和分束片(10);所述生物顯微鏡⑵包括反射鏡Ml (I I)、反射鏡M2 (12)、二向色鏡(13)、發(fā)射濾波片(14)、物鏡(15)和聚光器(16)； 所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)產(chǎn)生的激光經(jīng)過分束片(10)對(duì)激光進(jìn)行分束，分別進(jìn)入生物顯微鏡(2)和光譜儀(3)，光譜儀(3)用于監(jiān)控可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)的工作狀態(tài)，激光進(jìn)入生物顯微鏡(2)經(jīng)反射鏡Ml (11)反射進(jìn)入二向色鏡(13)，通過物鏡(15)打到電動(dòng)平移臺(tái)(7)上的樣品，然后一部分激光穿過樣品，經(jīng)聚光器(16)聚焦，反射鏡M2 (12)反射，進(jìn)入光電二極管(5)采集透射信號(hào)，把透射信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；另一部分激光返回物鏡(15)，通過二向色鏡(13)，經(jīng)發(fā)射慮波片(14)濾除雜波，進(jìn)入光電倍增管(4)采集熒光信號(hào)，把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；光電倍增管(4)和光電二極管(5)的數(shù)據(jù)傳入數(shù)據(jù)采集卡￠)，數(shù)據(jù)采集卡(6)的數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī)(9)，計(jì)算機(jī)(9)通過電動(dòng)平移臺(tái)控制器(8)控制電動(dòng)平移臺(tái)⑵移動(dòng)，電動(dòng)平移臺(tái)(7)位于聚光器(16)和物鏡(15)間，由兩個(gè)表面平坦且相互正交垂直的X軸平移臺(tái)和Y軸平移臺(tái)組成；計(jì)算機(jī)控制電動(dòng)平移臺(tái)以完成成像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述發(fā)射濾波片(14)由帶通濾波片和紅外截止濾波片構(gòu)成，帶通濾波片位于靠近二向色鏡(13)的一側(cè)，紅外截止濾波片位于靠近光電倍增管(4)的一側(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami產(chǎn)生的激光是中心波長(zhǎng)為800nm、重頻為82MHz、脈寬為50fs的超短脈沖鎖模激光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)，其特征在于:所述可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出，分束片(10)軸向豎直放置，與可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)同軸設(shè)置，表面與光線成45° ;反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)、電動(dòng)平移臺(tái)(7)、物鏡(15)和聚光器(16)同軸設(shè)置，與可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出和分束片(10)垂直設(shè)置，反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)軸向與地面成45°放置，表面與光線成45° ;二向色鏡(13)軸向與地面成45°放置,表面與光線成45° ;物鏡(15)和聚光器(16)同軸豎直放置；電動(dòng)平移臺(tái)(7)與地面成水平放置；發(fā)射濾波片(14)軸向豎直放置，表面與光線成90° ;光線水平射入光電倍增管(4)、光電二極管(5)。
5.一種權(quán)利要求1所述飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法，其特征在于:一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法包括如下步驟: 步驟一、將可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami發(fā)出的激光進(jìn)行分束:一束激光通過多模光纖與光譜儀連接，從而監(jiān)控可調(diào)諧飛秒激光源Tsunami的工作狀態(tài)；另一束激光與生物顯微鏡連接，用來(lái)激勵(lì)樣品； 步驟二、光束經(jīng)過生物顯微鏡的物鏡后，光束分為前向透射光和后向出射光； 步驟三、前向透射光經(jīng)過聚光器的收集后進(jìn)入光電二極管，光電二極管輸出的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集； 步驟四、后向出射光被物鏡收集后，通過二向色鏡將激光與熒光分開，經(jīng)發(fā)射濾波片后，進(jìn)入光電倍增管進(jìn)行探測(cè)采集熒光，光電倍增管輸出的信號(hào)由數(shù)據(jù)采集卡進(jìn)行采集； 步驟五、將數(shù)據(jù)采集卡采集的信息傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行雙光子熒光顯微成像； 步驟六、計(jì)算機(jī)控制電動(dòng)平移臺(tái)以完成成像。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統(tǒng)的成像方法，其特征在于:所述步驟一中將實(shí)驗(yàn)樣品放于顯微鏡的電動(dòng)平移臺(tái)上，光束經(jīng)過顯微鏡的物鏡照射在電動(dòng)平移臺(tái)上，從而完成對(duì)樣品的激勵(lì)操作。
【文檔編號(hào)】G01N21/01GK104198458SQ201410503142
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】夏元?dú)J, 秦一凡, 楊兆輝, 李茜, 張盛, 劉斌, 趙陽(yáng) 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)
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