基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法,本發(fā)明設(shè)計(jì)了1對(duì)引物用于擴(kuò)增MYOD1基因5′調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)片段,將膠回收產(chǎn)物用T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒構(gòu)建含有目的片段的重組質(zhì)粒,然后利用Promoter-BindingTFProfilingAssayI和NuclearExtractionKit(CatalogNumberSK-0001)進(jìn)行MYOD1基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選,便于對(duì)牛MYOD1基因啟動(dòng)子的調(diào)控方式及調(diào)控元件進(jìn)行研究。本發(fā)明的方法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡單、同時(shí)篩選多種轉(zhuǎn)錄因子、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域,尤其是一種基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物基因表達(dá)的時(shí)間和水平嚴(yán)格按照發(fā)育順序進(jìn)行。某些特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)由轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于調(diào)控區(qū)相關(guān)元件,成為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟,并最終導(dǎo)致基因的時(shí)間和空間表達(dá)。編碼組織特異蛋白的基因嚴(yán)格按照組織特異性和發(fā)育階段性表達(dá),為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了很好的研究|吳式。在特異聞效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中,獲得能廣泛應(yīng)用的特異性啟動(dòng)子非常重要。但啟動(dòng)子的特異性由多個(gè)元件控制,在不同種類和不同發(fā)育時(shí)期起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件并不相同,調(diào)控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復(fù)雜。
[0003]/的全稱為myogenic differentiation I,其中文名稱為生肌決定因子,是骨骼肌生長發(fā)育過程中重要的正調(diào)控基因,在肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中,MyoD /起著總開關(guān)的作用,可以結(jié)合到肌細(xì)胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結(jié)蛋白等基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮重要調(diào)控作用,促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活。生肌決定因子/的主要功能包括:促使靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化;能把許多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞,并可促進(jìn)成肌細(xì)胞進(jìn)一步融合、分化為成熟的肌纖維。
[0004]MyoD I介導(dǎo)的肌分化機(jī)制作為研究細(xì)胞分化的最佳模型,已成為當(dāng)前眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。目前,國內(nèi)外對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控在小鼠、雞和豬的肌細(xì)胞生成機(jī)理等方面的相關(guān)研究較多,在牛上已有一些研究,包括遺傳變異及功能研究等,但主要集中在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平,/基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。因此,篩選/基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)為探究/基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有一定的意義,為轉(zhuǎn)基因牛的培育和牛肉品質(zhì)的提聞提供理論依據(jù)。MyoD /基因啟動(dòng)子的研究具有廣闊的研究如景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法,它具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、檢測(cè)種類多、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),克服了凝膠遷移試驗(yàn)和構(gòu)建一系列啟動(dòng)子缺失或突變的報(bào)告體的復(fù)雜性。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法,包括以下步驟:
步驟I)進(jìn)行目的片段的克隆,構(gòu)建含有目的片段的T載體:根據(jù)NCBI上牛MYODl基因的序列進(jìn)行啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析,找到該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),并預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū);然后根據(jù)5,調(diào)控區(qū)序列設(shè)計(jì)I對(duì)兩端引物,以基因組DNA為模板,利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,獲得目的片段;對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收純化;再將純化的目的片段與PUCm-T載體連接過夜;過夜后將連接體系轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,然后進(jìn)行鋪板培養(yǎng)過夜;步驟2)重組質(zhì)粒的鑒定:挑取上述平板上的白斑單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)過夜,然后提取質(zhì)粒進(jìn)行per,將per產(chǎn)物送出測(cè)序;將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì),利用測(cè)序正確的質(zhì)粒為模版進(jìn)行目的片段的大量擴(kuò)增,然后進(jìn)行膠回收并純化;將測(cè)序正確的質(zhì)粒菌液加甘油后_80°C保存;
步驟3:目的片段的濃縮:將上述回收純化的目的片段混到一起,然后加2倍目的片段總體積的無水乙醇、與目的片段總體積相等的異丙醇,以及濃度為3mol/l的目的片段總體積的1/10的醋酸鈉,然后混勻沉淀30分鐘之后,在轉(zhuǎn)速為12000-15000rpm/min的條件下,離心3-5min,去除上清液;加質(zhì)量百分比為75%的乙醇Iml,用這些乙醇沖洗管壁直至混勻,然后在轉(zhuǎn)速為12000-15000rpm/min的條件下,離心3-5min,去除上清液;重復(fù)一次,然后將管子倒扣在紙上晾干,直至無乙醇味;用ddH20溶解,并沖洗管壁振蕩混勻,測(cè)其濃度;
步驟4)細(xì)胞核提取物的提取:利用Nuclear Extraction Kit試劑盒提取牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物,并利用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)所提的細(xì)胞核提取物進(jìn)行濃度測(cè)定;
步驟5)牛#76497基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè):利用Promoter-Binding TFProfiling Assay I所提的細(xì)胞核提取物和回收純化后濃縮的目的片段進(jìn)行?;騿?dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理,即完成了基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選。
[0007]單--次試驗(yàn)可明確48種TF與特定啟動(dòng)子的結(jié)合,
由于采用了上述技術(shù)方案,本發(fā)明設(shè)計(jì)了 I對(duì)引物用于擴(kuò)增基因5'調(diào)控區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)片段,將膠回收產(chǎn)物用T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒構(gòu)建含有目的片段的重組質(zhì)粒,然后利用Promoter-Binding TF Profiling Assay I和Nuclear Extraction Kit (CatalogNumber SK-0001)進(jìn)行MY0D1基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選,便于對(duì)牛MY0D1基因啟動(dòng)子的調(diào)控方式 及調(diào)控元件進(jìn)行研究。本發(fā)明的方法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡單、同時(shí)篩選多種轉(zhuǎn)錄因子、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1為從牛肌肉組織中提取的DNA的電泳示意圖;
圖2為本發(fā)明中的以圖1中的DNA為模板進(jìn)行的/基因5'調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子區(qū)片段的per擴(kuò)增的電泳示意圖;
圖3為本發(fā)明中的圖2中的per產(chǎn)物的膠回收產(chǎn)物的電泳示意圖;
圖4為構(gòu)建的重組T載體質(zhì)粒的電泳示意圖;
圖5為以重組T載體質(zhì)粒為模板進(jìn)行的/基因5'調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子區(qū)片段的per擴(kuò)增的電泳示意圖;
圖6為圖5中的per產(chǎn)物的膠回收產(chǎn)物的電泳示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]本發(fā)明的實(shí)施例:基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法,具體如下:
一、菌株、質(zhì)粒以及試劑的準(zhǔn)備
菌株:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α購自大連Takara公司;Promoter-Binding TF Profiling Assay I 和 Nuclear Extraction Kit (CatalogNumber SK-0001 )試劑盒購自 Signosis 公司;
試劑來源:2XEs Taq MasterMix和BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒、動(dòng)物組織DNA提取試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0010]試劑配制:
Amp (100 mg/ml):稱取Ampicillin 5g,加50ml超純水溶解,0.22 μ m過濾除菌后,按I ml/份分裝,-20 °C保存。
[0011]IPTG貯存液(0.1 M):稱取IPTG 0.6g,用超純水溶解定容至25 ml, -20°C冷凍保存。
[0012]X-gal (20mg/ml):稱取 0.4gX_gal (5_ 溴 ~4~ 氯 _3_ 口引哚-β -D-半乳糖苷)粉末,溶于二甲基甲酰胺,定容至20ml。0.22 μ m過濾除菌后,按I ml/份分裝于1.5ml離心管,用鋁箔封裹避光保存于_20°C。
[0013]LB液體培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨lg,酵母提取物0.5g,NaCl lg,置于100ml三角瓶中,加入95ml超純水溶解,調(diào)pH值至7.0,加超純水至總體積為100ml,121 1:高壓滅菌30min,冷卻至室溫,臨用時(shí)加入抗生素,氨節(jié)青霉素工作濃度為100 μ g/ml。
[0014]LB固體培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨lg,酵母提取物0.5g,NaCl lg,細(xì)菌用瓊脂1.5g置于100mL三角瓶中,加入95ml超純水溶解,調(diào)pH值至7.0,加超純水至總體積為100ml,高壓滅菌后冷卻至45°C左右,加入抗生素(100 μ g/ml),搖勻后倒入培養(yǎng)皿。
SOC培養(yǎng)基:稱取胰蛋白胨2g,酵母提取物0.5g,加0.05%的NaCl,2.5 mM KCl,10 mMMgC12, 20 mM葡萄糖配制成100 ml。
[0015]PBS 緩沖液:KC1 0.29,KH2P040.2g, NaCl 8.0g, Na2HP04.12H20 2.88g,溶于900ml超純水中,調(diào)pH值至7.0-7.2,定容至1000ml,121 °C高壓滅菌30 min后4°C保存。
[0016]二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
步驟1、牛/基因啟動(dòng)子T載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建
1.根據(jù)牛/基因5'調(diào)控區(qū)序列設(shè)計(jì)一組兩端引物,上游引物的序列是5'-ACCTCCCGACATCATACATT-3',下游引物的序列為:5' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3'。
[0017]2.以基因組DNA為模板,利用常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。
[0018]反應(yīng)條件為:在94°C變性2min,再在94°C循環(huán)30s,然后在59°C退火30s,再在72°C延伸80s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后在72°C最終延伸2min。
[0019]3.反應(yīng)結(jié)束后,取5 μ I反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0020](I)加入I g的瓊脂糖至100ml I X TAE電泳緩沖液中。
[0021](2)微波爐中加熱使瓊脂糖完全溶解,溶液冷卻至60°C (手背接觸三角瓶壁不燙手),加入Goldview染料5微升,輕輕搖勻。
[0022](3)倒膠,厚度為0.3-0.5cm,然后放置好梳子。
[0023](4)待膠冷卻后,輕輕拔掉梳子,置于電泳槽中,加電泳緩沖液至完全覆蓋膠面。
[0024](5)上樣,電泳,穩(wěn)壓 100V,30_40min。
[0025](6)取出凝膠,在紫外燈下檢查凝膠,并用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。
[0026]4.瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。[0027](I) PCR產(chǎn)物目的條帶的切割和稱重,并按每IOOmg瓊脂糖中加入300-600 μ I的溶膠液Buffer B2,充分混勻。
[0028](2) 50°C水浴5-10min,間或混勻,直至膠完全熔化,將所得溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中,8000 Xg室溫離心30秒,棄上清。
[0029](3)將吸附柱中加入500μ I漂洗液,9000Xg室溫離心30妙,棄上清。
[0030](4)重復(fù)步驟(3) —次。
[0031](5)將吸附柱于9000Xg室溫離心I分鐘,除去殘留的漂洗液,將吸附柱室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液。
[0032](6)取出吸附柱,放入一個(gè)新的1.5ml離心管中,向吸附柱中間部分滴加15-40 μ lddH20,室溫靜置1-2分鐘。9000Xg室溫離心I分鐘洗脫DNA,收集管中溶液,將所得到的DNA溶液置于-20度保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0033]5.牛MyoD /基因啟動(dòng)子T載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建
利用T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒進(jìn)行?;騿?dòng)子T載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建,反應(yīng)體系如下:
膠回收的PCR產(chǎn)物3μ1
pUCm-T 載體I μ I
IOXLigation BufferI μ I
50%PEG 4000I μ I
Sterilized ddH203 μ I
T4 DNA LigationI μ I
混勻,16 °C連接過夜
6.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a菌株 轉(zhuǎn)化的步驟如下:
(I)取100 μ I感受態(tài)細(xì)胞,置于冰上,完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。
[0034](2)將上述的連接液全部加入感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,冰上放置30分鐘。
[0035](3) 42°C水浴熱激90秒,冰上放置15-20分鐘。
[0036](4)加 400 μ ISOC 培養(yǎng)基,37°C 200_250rpm 振蕩培養(yǎng) I 小時(shí)。
[0037](5)室溫下4000rpm離心5分鐘,用槍頭吸掉400 μ I上清液,用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮。
[0038](6)將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20 μ IlOOMm IPTG和100 μ I 20mg/ml X-gal涂布的氨芐青霉素平板上。
[0039](7)平板在37°C下正向放置I小時(shí)以吸收過多的液體,然后倒置培養(yǎng)過夜。
[0040]步驟2、重組質(zhì)粒的篩選、鑒定
(I)藍(lán)白斑的篩選培養(yǎng):挑取上述固體培養(yǎng)基上的白色單菌落于裝有5ml含有終濃度為20mg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于37°C 200rpm/h的培養(yǎng)箱中搖菌培養(yǎng)過夜。
[0041](2)利用質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取重組質(zhì)粒,并進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0042](3)以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行關(guān)嶺牛MYODl基因啟動(dòng)子得PCR克隆,并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0043](4)將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送到英維捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì)。
[0044](5)利用測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板進(jìn)行目的片段的大量擴(kuò)增,并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。
[0045]步驟3、目的片段的濃縮
將上述回收純化的目的片段混到一起,然后加2倍體積的無水乙醇、等體積的異丙醇和十分之一體積的3mol/l醋酸鈉,然后混勻沉淀30分鐘之后12000-15000rpm/min離心3-5min,去除上清液;加75%的乙醇1ml,不斷用75%的乙醇沖洗管壁混勻,然后同上離心3-5min,去除上清液;重復(fù)一次,然后管子倒扣在紙上晾干,直至無乙醇味;用ddH20溶解,并沖洗管壁振蕩混勻,并測(cè)其濃度。
[0046]步驟4、利用 Nuclear Extraction Kit (Catalog Number SK-0001 )試劑盒提取關(guān)嶺牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物,并利用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)所提的細(xì)胞核提取物進(jìn)行濃度測(cè)定。
[0047]步驟5、利用Promoter-Binding TF Profiling Assay 1、所提的細(xì)胞核提取物和大量回收純化的目的片段進(jìn)行?;騿?dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選實(shí)驗(yàn)。
[0048]步驟6、數(shù)據(jù)分析 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果按以下方式處理:
對(duì)照組處理結(jié)果=對(duì)照組結(jié)果的平均值-空白組的平均值;
實(shí)驗(yàn)組處理結(jié)果=實(shí)驗(yàn)組結(jié)果的平均值-空白組的平均值;
判斷值=對(duì)照組處理結(jié)果/實(shí)驗(yàn)組處理結(jié)果
如果判斷值大于3就說明啟動(dòng)子區(qū)含有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用Promoter-Binding TF Profiling Assay I試劑盒和前面純化濃縮的目的片段以及細(xì)胞核提取物進(jìn)行牛/基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選,數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表1所示。從結(jié)果中我們可以初步判定/基因啟動(dòng)子區(qū)有以下的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選方法,其特征在于:包括以下步驟: 步驟I)進(jìn)行目的片段的克隆,構(gòu)建含有目的片段的T載體:根據(jù)NCBI上牛MYODl基因的序列進(jìn)行啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析,找到該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),并預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū);然后根據(jù)5,調(diào)控區(qū)序列設(shè)計(jì)I對(duì)兩端引物,以基因組DNA為模板,利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,獲得目的片段;對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收純化;再將純化的目的片段與PUCm-T載體連接過夜;過夜后將連接體系轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,然后進(jìn)行鋪板培養(yǎng)過夜; 步驟2)重組質(zhì)粒的鑒定:挑取上述平板上的白斑單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)過夜,然后提取質(zhì)粒進(jìn)行per,將per產(chǎn)物送出測(cè)序;將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì),利用測(cè)序正確的質(zhì)粒為模版進(jìn)行目的片段的大量擴(kuò)增,然后進(jìn)行膠回收并純化;將測(cè)序正確的質(zhì)粒菌液加甘油后_80°C保存; 步驟3:目的片段的濃縮:將上述回收純化的目的片段混到一起,然后加2倍目的片段總體積的無水乙醇、與目的片段總體積相等的異丙醇,以及濃度為3mol/l的目的片段總體積的1/10的醋酸鈉,然后混勻沉淀30分鐘之后,在轉(zhuǎn)速為12000-15000rpm/min的條件下,離心3-5min,去除上清液;加質(zhì)量百分比為75%的乙醇1ml,用這些乙醇沖洗管壁直至混勻,然后在轉(zhuǎn)速為12000-15000rpm/min的條件下,離心3-5min,去除上清液;重復(fù)一次,然后將管子倒扣在紙上晾干,直至無乙醇味;用ddH20溶解,并沖洗管壁振蕩混勻,測(cè)其濃度; 步驟4)細(xì)胞核提取物的提取:利用Nuclear Extraction Kit試劑盒提取牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物,并利用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)所提的細(xì)胞核提取物進(jìn)行濃度測(cè)定; 步驟5)牛#76497基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè):利用Promoter-Binding TFProfiling Assay I所提的細(xì)胞核提取物和回收純化后濃縮的目的片段進(jìn)行?;騿?dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的篩選實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理,即完成了基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的多通量篩選。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103869081SQ201410094856
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月16日
【發(fā)明者】許厚強(qiáng), 張雯, 陳偉, 陳祥, 趙佳福, 桓聰聰 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)