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專利名稱：一種蛋白酶譜的活性電泳檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型蛋白酶譜的電泳檢測方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白酶(proteases, proteinases)也稱為肽酶(peptidases),是一類能水解蛋白質(zhì)和多肽水解的酶類，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，執(zhí)行許多不同的生理功能。根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以將蛋白酶分成很多種。根據(jù)水解肽鍵的方式，可細(xì)分為內(nèi)肽酶、外肽酶、轉(zhuǎn)肽酶等。根據(jù)最適pH，可以將蛋白酶分為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶。MEROPS數(shù)據(jù)庫記錄了蛋白酶及蛋白酶的肽類抑制劑的相關(guān)信息，根據(jù)催化中心參與催化的氨基酸的不同，在該數(shù)據(jù)庫中蛋白酶可分成6大類:天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和未知催化類型的蛋白酶。蛋白酶是用途最廣泛的酶制劑之一，占了世界酶類銷售總額的60%，在食品、醫(yī)藥、紡織、制革、洗滌劑、化妝品、動(dòng)植物蛋白以及廢物處理等行業(yè)都有著很好的應(yīng)用前景。酶譜分析是一種電泳技術(shù)，是在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，它在聚丙烯酰胺凝膠中添加了底物分子，從而可以檢測酶活性。雖然存在許多不同類型的酶譜分析(根據(jù)酶的類型)，其中使用最頻繁的檢測蛋白酶活性的是明膠酶譜分析。上樣緩沖液配方與標(biāo)準(zhǔn)的SDS-PAGE上樣緩沖液基本相同，但是不含還原劑[2-mercaptoetanol, 二硫蘇糖醇(DTT)],也不加熱。電泳結(jié)束后，將SDS凝膠在Triton X-100中洗3次，然后將其孵育于一個(gè)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液中，使酶和底物發(fā)生反應(yīng)，隨后SDS凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，被酶降解的區(qū)域會(huì)有明顯的條帶顯示。經(jīng)過五十多年的發(fā)展，酶譜法也衍生出很多新的技術(shù)，具體有:(I)常規(guī)方法，一維酶譜電泳膠中添加蛋白酶底物與膠共聚合。電泳結(jié)束后，酶進(jìn)行膠內(nèi)復(fù)性，降解膠中的底物，此時(shí)在膠的藍(lán)色背景下會(huì)出現(xiàn)白色透明水解條帶。(2) 二維酶譜電泳的原理同一維酶譜電泳，但樣品事先要經(jīng)過等電聚焦(IEF)初步分離，酶降解底物后膠上會(huì)有白色水解圈。(3) 二維電泳結(jié)束后得到的水解圈，可通過MALD1-T0F/MS鑒定蛋白酶。(4)組織樣品可直接進(jìn)行膠內(nèi)酶解(In-situ zymography, ISZ),這樣就可根據(jù)酶活對細(xì)胞定位。(5)實(shí)時(shí)定量酶譜法(Real-time zymography,RTZ)可對酶活的變化定時(shí)監(jiān)測。(6)多層次底物酶譜法(Multiplelayer substrate zymography, MLSZ)可以利用一塊膠來檢測不同的酶。具體方法是樣品經(jīng)電泳分離后再用電轉(zhuǎn)的方法將膠里的蛋白轉(zhuǎn)移到含不同底物的膠上。這就實(shí)現(xiàn)了一次電泳，多次檢測的效果。(7)反向酶譜法(Reverse zymography),與其他酶譜法的膠內(nèi)添加底物不同，這種方法是將酶加入膠中，然后檢測酶的抑制劑。有抑制作用的會(huì)在亮的背景里出現(xiàn)黑色條帶。其中底物膠方法雖然常被用來檢測蛋白水解酶類的活性酶譜，但有些蛋白酶在含有底物的膠中的遷移率會(huì)受到嚴(yán)重影響，所以導(dǎo)致蛋白酶條帶很難分開或是難以確定其分子量。為了解決這一問題，有些研究者就將此方法進(jìn)行了改良，首先將蛋白酶樣品首先進(jìn)行不含底物的非變性的SDS-PAGE電泳，在通過電轉(zhuǎn)將跑好的條帶轉(zhuǎn)移到事先準(zhǔn)備好的含有底物蛋白的另一張凝膠上，反應(yīng)一段時(shí)間后，第二張含有底物的授予膠去染色，脫色，會(huì)在相應(yīng)的位置產(chǎn)生透明的條帶。雖然該方法在一定程度上解決了底物對蛋白酶遷移率受到阻礙的問題，但是要求必須有電轉(zhuǎn)裝置，而且增加了操作步驟，在電轉(zhuǎn)過程中還可能造成蛋白酶的失活。本發(fā)明針對上述問題進(jìn)行了改良，通過底物浸泡方法解決了上述傳統(tǒng)方法可能的造成的誤差，可有效應(yīng)用于蛋白酶譜分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更為快速準(zhǔn)確地檢測蛋白酶譜的新方法，應(yīng)用該方法，可以減少傳統(tǒng)底物膠方法蛋白條帶堆積，分子量偏差，以及使用昂貴儀器的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對多種蛋白酶譜進(jìn)行高通量快速檢測。一種蛋白酶譜的活性電泳檢測方法，包括以下步驟:a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝膠；b.樣品與不含巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時(shí)樣品不在沸水浴中加熱；c.電泳；d.洗膠；e.將膠在底物溶液中浸泡；f.反應(yīng)顯色；步驟b中使用的不含巰基乙醇的加樣緩沖液配方為:60mM Tris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚蘭0.1%、甘油25%組成，加樣時(shí)樣品和加樣緩沖液的體積比為4:1。步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質(zhì)量濃度為1%底物的溶液中，37° C溫浴2h。上述方法具體包括以下步驟:I).配制質(zhì)量濃度為12.5%的分離膠:30%凝膠貯備液1.6ml, pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸餾水1.4ml, 10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED2.5 μ I ;混勻后立即將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5%的上層濃縮膠:30%凝膠貯備液 0.15ml, ρΗ6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl0.35ml，蒸餾水 0.5ml, 10% 過硫酸胺 20 μ I,TEMED2.0 μ I ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下；2).將樣品與加樣緩沖液混勻后加樣；3).電泳緩沖液為ρΗ8.8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進(jìn)行；采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方法，5mA穩(wěn)流進(jìn)樣后，IOmA穩(wěn)流分離樣品直至溴酚蘭指示劑到達(dá)膠的最前沿；4).電泳結(jié)束后，用預(yù)冷的2.5%Triton X-100將膠洗三次，每次15min ;然后用預(yù)冷的蒸餾水漂洗數(shù)次去除殘留的Triton X-100 ；5).將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質(zhì)量濃度為1%底物的溶液中，37° C溫浴2h后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈，用0.1% (w/v)的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為:lg考馬斯亮藍(lán)R-250, 350ml乙醇，IOOml乙酸,加水至IOOOml ;脫色液配方為:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至1000ml。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和有益效果:1、運(yùn)用底物浸泡方法測定蛋白酶譜，避免了底物在膠中對蛋白遷移率的影響，本發(fā)明所用的蛋白底物反浸的方法同底物膠的方法在耗時(shí)上基本相同，但是在活性條帶的分子量的確定上卻有著明顯的優(yōu)勢，且活性條帶更加清晰，如圖2所示，非常有利于后續(xù)的蛋白酶鑒定工作；2、重復(fù)性好，靈敏度高，活性條帶測定準(zhǔn)確，如圖3所示；3、本發(fā)明所用的蛋白底物反浸的方法同電轉(zhuǎn)方法相比在耗時(shí)上明顯縮短，省去了電轉(zhuǎn)步驟，而且不需要電轉(zhuǎn)裝置，且在條帶清晰度及分子量準(zhǔn)確度上基本相同；4、底物浸泡蛋白酶譜法可以用于各種蛋白酶譜的檢測，有廣闊的應(yīng)用空間。


圖1、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶譜檢測；圖2、海洋弧菌(Vibrio sp.CSH1301)胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶譜檢測；1.為本發(fā)明的酪蛋白底物浸泡方法；2為酪蛋白底物膠方法；當(dāng)SDS-PAGE膠中加入酪蛋白底物時(shí)，嚴(yán)重阻礙了胰蛋白酶的遷移率，酶解條帶彌散，而本發(fā)明是將酪蛋白底物反浸入凝膠，所以不會(huì)對蛋白遷移率有任何影響，活性條帶清晰；圖3、胰蛋白酶活性電泳；1.為本發(fā)明的酪蛋白底物浸泡方法；2為酪蛋白底物膠方法；胰蛋白酶分子量約為23.3kDa，當(dāng)SDS-PAGE膠中加入酪蛋白底物時(shí)，嚴(yán)重阻礙了胰蛋白酶的遷移率，造成了胰蛋白酶分子量的偏差，而本發(fā)明由于是將底物反浸入凝膠，所以不會(huì)對蛋白遷移率有任何影響，而且活性條帶清晰。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。本發(fā)明使用的試劑:丙稀酰胺、N，N’ -甲叉雙丙稀酰胺、SDS、過硫酸氨(Sigma)，Tris (Sigma進(jìn)口分裝)，甘氨酸(國產(chǎn))，酪蛋白(Sigma進(jìn)口分裝)，其他試劑均為普通市
售產(chǎn)品。實(shí)施例1:短小芽孢桿菌蛋白酶底物浸泡法活性酶譜檢測所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址:中國科學(xué)院微生物研究所，菌種編號CGMCC NO: 1.1625。步驟如下:(I)將購買的短小芽孢桿菌劃線接種于固體培養(yǎng)基，在28°C條件下活化培養(yǎng)3天，然后接種于5ml液體LB培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)I天，然后按5%(v/v)的接種量接種于IOOml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)36h，IOOOOrpm離心，制得發(fā)酵液；上述固體培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:蛋白胨I份，酵母粉0.5份、1.5份瓊脂，蒸餾水100份，pH為7.5 8.0 ;LB培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:
蛋白胨I份，酵母粉0.5份，蒸餾水100份，pH為7.5 8.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量份:玉米粉I 分，麩皮 0.5 份，豆柏 I 份，Na2HPO40.4 份，KH2PO40.03 份，CaCl20.1 份，蒸餾水 100 份，pH7.5。(2)將步驟(I)制得發(fā)酵液在4°C條件下，IOOOOrpm離心lOmin，取上清，制得胞外酶液；4°C冰箱保存待用。(3)配制 12.5%分離膠:30%凝膠貯備液 1.6ml, 1.5mol/L Tris-HCl (ρΗ8.8) 1.0ml,蒸餾水1.4ml, 10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED2.5 μ I?；靹蚝罅⒓葱⌒牡貙⒎蛛x膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。聚合完成之后，倒掉覆蓋液體。配制5%上層濃縮膠:30%凝膠貯備液0.15ml，ρΗ6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸餾水 0.5ml, 10% 過硫酸胺 20 μ I, TEMED 2.0 μ I ；插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下。(4)將步驟(2)制得的胞外酶液20 μ I與5 μ I加樣緩沖液(使用的加樣緩沖液配方為:60mMTris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚蘭0.1%、甘油25%組成)混勻，樣品不在沸水浴中加熱。電泳采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方法，在Mini PR0TAIN3小型垂直電泳槽和蛋白質(zhì)電泳儀電泳儀上進(jìn)行。在冰浴中穩(wěn)壓120V電泳，分離樣品直至溴酚蘭指示劑到達(dá)膠的最前沿。(5)電泳結(jié)束后，將步驟(4)得到的電泳凝膠用預(yù)冷的Triton X-100 (2.5%)洗三次，每次15min。然后用預(yù)冷的蒸餾水漂洗數(shù)次去除殘留的Triton X-100。(6)將步驟(5)清洗好的膠浸泡在用ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖液配制的含有1%酪蛋白溶液中，37° C溫浴2h，然后用蒸餾水將膠上殘留的酪蛋白沖洗干凈，用0.l%(w/v)的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰。其中染色液配方為:lg考馬斯亮藍(lán)R_250，350ml乙醇，IOOml乙酸，加水至IOOOml ;脫色液配方為:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至1000ml。酶譜條帶如圖1所示。實(shí)施例2:海洋弧菌(Vibrio sp.CSH1301)胞外蛋白酶譜的測定及同底物膠方法比較各操作步驟同實(shí)施例1，所不同的是培養(yǎng)基中的蒸餾水換做海水，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。海洋弧菌(Vibrio sp.CSH1301)為本實(shí)驗(yàn)室分離自?？诩t樹林海水的菌株。對照試驗(yàn)配制12.5%分離膠:30%凝膠忙備液1.6ml, 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8) 1.0ml，蒸懼水
1.0ml，1%的酪蛋白0.4ml，10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED 2.5 μ I?；靹蚝罅⒓葱⌒牡貙⒎蛛x膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用，聚合完成之后，倒掉覆蓋液體。配制5%上層濃縮膠，插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下。對照試驗(yàn)與本發(fā)明的不同在于配膠時(shí)加入終濃度0.1%的酪蛋白，其它的試驗(yàn)步驟及電泳儀器均相同。凝膠經(jīng)漂洗后，底物膠浸泡在Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中37° C溫浴2h，而非底物膠浸泡在Tris-HCl (pH8.0)緩沖液配制的含有1%酪蛋白的溶液中，37° C溫浴2h，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，最后用脫色液脫色直至透明條帶清晰。蛋白酶譜條帶如圖2所示。實(shí)施例3:胰蛋白酶Trypsin蛋白酶譜的測定及同底物膠方法比較各操作步驟同實(shí)施例，所不同的是采用購買的上海生工的商品酶制劑，胰蛋白酶Trypsin，本發(fā)明的底物浸泡方法同底物膠方法進(jìn)行對比。對照試驗(yàn)電泳膠配制同實(shí)施例2，37° C溫浴2h，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，最后用脫色液脫色直至透明條帶清晰。胰蛋白酶譜條帶如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種蛋白酶譜的活性電泳檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝膠； b.樣品與不含巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時(shí)樣品不在沸水浴中加執(zhí).c.電泳； d.洗膠； e.將膠在底物溶液中浸泡； f.反應(yīng)顯色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為:60mM Tris-HCl pH6.8、SDS2%、溴酚蘭0.1%、甘油25%組成，加樣時(shí)樣品和加樣緩沖液的體積比為4:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質(zhì)量濃度為0.25-2%底物的溶液中，30-40 ° C 溫浴 l-3h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟:制質(zhì)量濃度為12.5%的分離膠:30%凝膠貯備液1.6ml, pH8.8的1.5mol/LTris-HCl1.0ml，蒸餾水1.4ml, 10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED 2.5 μ I ;混勻后立即將分離膠注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5%的上層濃縮膠:30%凝膠貯備液 0.15ml，pH6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸餾水 0.5ml, 10% 過硫酸胺 20 μ I，TEMEDμ I ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下； 2).將樣品與加樣緩沖液混勻后加樣； 3).電泳緩沖液為ρΗ8.8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進(jìn)行；采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳方法，5mA穩(wěn)流進(jìn)樣后，IOmA穩(wěn)流分離樣品直至溴酚蘭指示劑到達(dá)膠的最前沿； 4).電泳結(jié)束后，用預(yù)冷的2.5%Triton X-100將膠洗三次，每次15min ;然后用預(yù)冷的蒸餾水漂洗數(shù)次去除殘留的Triton X-100 ； 5).將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質(zhì)量濃度為1%底物的溶液中，37°C溫浴2h后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈，用0.1% (w/v)的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為:lg考馬斯亮藍(lán)R-250，350ml乙醇，IOOml乙酸，加水至IOOOml ;脫色液配方為:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至IOOOml0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋白酶譜電泳檢測方法，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括制膠、加樣、電泳、洗膠、反應(yīng)顯色步驟，其中制膠時(shí)沒有向凝膠里加入蛋白酶底物，而在顯色之前將膠在1%的底物溶液中浸泡。避免了底物在膠中對蛋白遷移率的影響,不需要價(jià)格昂貴的電轉(zhuǎn)設(shè)備,可以用于各種蛋白酶譜的檢測，應(yīng)用廣泛。
文檔編號G01N27/447GK103105427SQ20131001849
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者何海倫, 陳淑華, 劉丹, 楊興昊, 黃嘉豐 申請人:中南大學(xué)