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草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的hplc-elsd含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明首次從草烏中分離得到準(zhǔn)噶爾烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭胺、多根烏頭堿,并在此的基礎(chǔ)上，提供了一種利用HPLC-ELSD法測定草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的含量的方法，色譜條件和檢測條件為流動相：乙腈-0.1％三乙胺溶液的體積比為(40-50)：(50-60)；柱溫：20-30℃；流速：0.5-1.50mL·min-1；進(jìn)樣量：10-30μL；ELSD檢測器的漂移管溫度：90-98℃；氣體壓力：2.00-3.00bar；撞擊器呈關(guān)閉狀態(tài)，本發(fā)明為完善草烏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及車前子的開發(fā)利用提供了新的科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用HPLC-ELSD法測定草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的含量的方法，屬于 生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]草烏（Aconiti kusnezoffii Radix)為毛茛科植物北烏頭（Aconitum kusnezoffii Reichb.)的千燥塊根，民間藥用歷史悠久，常用于治療風(fēng)濕、麻痹、寒疝、疼痛等癥狀。
[0003] 草烏的主要生物活性成分為二萜類生物堿，它們既是藥材中主要的藥效成分，同 時又是毒性很強(qiáng)的成分，用藥不當(dāng)易造成中毒現(xiàn)象。因此，為保證用藥安全，有必要弄清草 烏中所有生物堿類成分的種類并通過含量測定嚴(yán)格控制藥材中此類生物堿成分的含量。到 目前為止人們針對草烏中的烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿建立了含量測定方法。但還沒有 關(guān)于草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿含量的研究。本發(fā)明提供了一種利用HPLC-ELSD法測定草烏中準(zhǔn) 噶爾烏頭堿的含量的方法，不僅能完善草烏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還能為草烏的安全用藥及開發(fā) 利用提供科學(xué)依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種利用HPLC-ELSD法測定草 烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的含量的方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0006] 草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，其色譜條件和檢測條件、供試 品溶液的制備和對照品溶液的制備如下：
[0007] 色譜條件和檢測條件：
[0008] 流動相：乙腈-ο. 1 %三乙胺溶液的體積比為（40-50) :(50-60)
[0009] 柱溫：20-30 °C
[0010] 流速：0. 5-1. 50mL · min-1
[0011] 進(jìn)樣量：10-30 μ L
[0012] ELSD檢測器的漂移管溫度：90-981
[0013] 氣體壓力：2· 00-3. OObar
[0014] 撞擊器呈關(guān)閉狀態(tài)；
[0015] 供試品溶液的制備
[0016]精密稱取草烏粉末適量，以氨水浸濕，氯仿加熱回流提取1_3次，每次加入氨水料 液比（g/ml)為1: (0· 5_2)、氯仿料液比（g/ml)為1: (6_8),提取時間均為〇· 5_2· 0h，過濾， 合并濾液，減壓回收溶劑，再用乙腈重新溶解至容量瓶中，定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為 供試品溶液；
[0017] 對照品溶液的制備
[0018]精密稱取化合物準(zhǔn)噶爾烏頭堿，用乙腈溶解至容量瓶中，定容，搖勻，得 1· 0-2. Omg · mL_1的對照品溶液，冷藏備用。
[0019] 進(jìn)一步地，草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，色譜條件和檢測條 件：
[0020] 流動相：乙腈-0. 1 %三乙胺溶液的體積比為40 :60
[0021] 柱溫：25°C
[0022] 流速：1. OmL · mirT1 [0023]進(jìn)樣量：20yL
[0024] ELSD檢測器的漂移管溫度：96°C
[0025] 氣體壓力：2· 5〇bar
[0026] 撞擊器呈關(guān)閉狀態(tài)。
[0027] 更進(jìn)一步地，草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，供試品溶液的制 備：
[0028]精密稱取草烏粉末3. 〇g，以氨水浸濕，氯仿加熱回流提取2次，每次加入氨水 3. OmL、氯仿20mL，提取時間分別為1. 5h、l. 0h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，再用乙腈重 新溶解至10mL容量瓶中，定容，搖勻，過0· 22 μ m微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。 [0029] 更進(jìn)一步地，草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，對照品溶液的制 備：
[0030] 精密稱取化合物準(zhǔn)噶爾烏頭堿75mg，純度為99. 5%，用乙腈溶解至50mL容量瓶 中，定容，搖勻，得1. 5mg · ml/1的對照品溶液，置于4°C冷藏備用。
[0031]本發(fā)明所用到的對照品準(zhǔn)噶爾烏頭堿為自制，純度為99. 5%，準(zhǔn)噶爾烏頭堿的制 備方法如下：
[0032] (1)提取
[0033]取干燥的草烏，以氯仿-氨水溶液（20:1)為流動相滲漉提取，將提取液濃縮，用 0· 5%的HC1酸化至pH = 1?2,氯仿萃取4次，將水層合并、濃縮，再用〇· 5%的NaOH堿化 至pH = 11?12,氯仿萃取4次，取氯仿層合并、濃縮，得粗提取物。
[0034] (2)分離
[0035]將粗提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑1?5為流動相梯度洗脫，TCL檢驗(yàn),合并組 分相同的流份，回收溶劑，得到三個部分，通過檢測TCL其中第一部分含有準(zhǔn)噶爾烏頭堿， 第二部分含有準(zhǔn)噶爾烏頭胺，第三部分含有新烏頭堿。
[0036] (3)純化
[0037]將步驟（2)所得三個部分分別反復(fù)純化，最后純化得到8個化合物，分別是準(zhǔn)噶爾 烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭胺、化合物塔拉烏頭胺、多根烏頭堿、3_脫氧烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、 新烏頭堿。步驟（3)中的采用的純化方法為娃膠柱層析和/或重結(jié)晶。
[0038] I在上述研究的基礎(chǔ)上本發(fā)明建立了草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HpLC_ELSD(高效液相 色譜-蒸發(fā)激光散射檢測器）含量測定方法，測得河北安國產(chǎn)草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的平均 含9238mg .g-1，吉林磐石產(chǎn)草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的平均含量為丨· 319mg ，云南大 理產(chǎn)草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的平均含量為丨_ 768mg · g-i，安徽亳州產(chǎn)草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的 平均含量為1. 635mg .g1。不同產(chǎn)地的草烏藥材中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的含量有所差別，但除個別 樣品含量低于1. Omg，g-1外（可能存在取樣不均等誤差因素），其余均在丨.〇mg (〇. 1% ) 以上，屬于含量較高的生物堿類成分（2010版藥典測得草烏中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭 堿的總量為0. 10%?〇. 50% )。因此，將準(zhǔn)噶爾烏頭堿的含量測定指標(biāo)納入草烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 之中有利于草烏藥材的質(zhì)量控制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0040] 圖1是本發(fā)明的實(shí)施例方式中對照品的色譜圖；
[0041] 圖2是本發(fā)明的實(shí)施例方式中藥材的色譜圖；
[0042] 圖3是本發(fā)明的實(shí)施例方式中不同溶劑的提取結(jié)果對比；
[0043] 圖4是本發(fā)明的實(shí)施例方式中加 氨水與不加氨水的提取結(jié)果對比；
[0044] 圖5是本發(fā)明的實(shí)施例方式中提取方法不同時的提取結(jié)果的對比；
[0045] 圖6是本發(fā)明的實(shí)施方式中提取次數(shù)不同時的提取結(jié)果的對比；
[0046]圖7是本發(fā)明的實(shí)施方式中提取溶劑體積不同時的提取結(jié)果的對比。
[0047] 圖8是本發(fā)明的實(shí)施例1中的線性關(guān)系曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0048]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí) 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0049] 一、草烏化學(xué)成分的提取及分離
[0050] 1、實(shí)驗(yàn)原料與試劑材料
[0051] 實(shí)驗(yàn)原料
[0052] 本實(shí)驗(yàn)提取及分離用草烏藥材購自河北安國。
[0053] 試劑材料
[0054] 本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，包括石油醚、丙酮、二乙胺、氨水等。石油醚和二乙 胺購自天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；丙酮、乙酸乙酯、氯仿和氨水購自北京化工廠。TLC silica gel60F254 和 TLC silica gel60RP-18F254S 購自 Merck,柱層析娃膠（200-300 目） 購自青島海洋化工廠。
[0055] 2、化學(xué)成分的提取和分離
[0056](一）提取
[0057]取干燥的草烏10kg，粉碎，以氯仿-氨水溶液（20:1)為流動相滲漉提取，將提取液 濃縮，用〇· 5%的HC1酸化至pH = 1?2,氯仿萃取4次，將水層合并、濃縮，再用0. 5%的 NaOH堿化至pH = 11?I2,氯仿萃取4次，取氯仿層合并、濃縮，得粗提取物310g。
[0058](二）分離及純化
[0059]將粗提取物（310g)進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑1?5為流動相梯度洗脫，薄層色 譜（TLC)檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，得到三個部分，通過檢測τ(χ其中第一部分含 有準(zhǔn)噶爾烏頭堿，第二部分含有準(zhǔn)噶爾烏頭胺，第三部分含有新烏頭堿。
[ooeo]將第一部分（40g)進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑7?10為流動相梯度洗脫，TLC 檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，得到A(10g)、B(5g)兩個部分。再將A部分進(jìn)行硅 膠柱層析，以8、9、10為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，析出白 色粉末即為化合物cw-1 (2. 0g);將母液濃縮，進(jìn)行硅膠柱層析，得到白色粉末即為化合物 Cw_6(860mg)。將B部分進(jìn)行硅膠柱層析，以8、9、10為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相 同組分，減壓回收溶劑，白色沉淀用石油醚和丙酮的混合溶液結(jié)晶、重結(jié)晶，得到無 色塊狀 結(jié)晶即為化合物cw-3(1. 0g)。將第二部分（35g)進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑6?9為流動 相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，得到C(9.4g)、D(3.0g)兩個部分。再 將C部分進(jìn)行硅膠柱層析，以 6、8、9為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收 溶劑，得到化合物cw-7(白色粉末，560mg)和C-l(5.2g)部分。再將C-1部分進(jìn)行硅膠柱層 析，以洗脫劑6、8、9為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，白色沉淀 用石油醚和丙酮的混合溶液結(jié)晶、重結(jié)晶，得到無色粒狀結(jié)晶即為化合物 cw-5(200mg)。將 D部分進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑6、8、9、10為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減 壓回收溶劑，白色沉淀用石油醚和丙酮的混合溶液結(jié)晶、重結(jié)晶，得到無色塊狀結(jié)晶即為化 合物cw-2(550mg)。將第三部分（42g)進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑6、8、9、11為流動相梯度 洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，得到E(17g)部分。再將E部分進(jìn)行硅膠柱 層析，以洗脫劑7?10為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，得到化 合物cw-8 (白色粉末，4. 0g)和E-1 (5. 0g)部分。再將E-1部分進(jìn)行硅膠柱層析，以洗脫劑 7?10為流動相梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，減壓回收溶劑，白色沉淀用石油醚和丙 酮的混合溶液結(jié)晶、重結(jié)晶，得到無色粒狀結(jié)晶即為化合物cw-4(70mg)。
[0061] 二、化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定
[0062] 化合物cw-Ι的結(jié)構(gòu)鑒定
[0063] 化合物(^-1為白色粉末，1114.195.5?196.51：，易溶于氯仿、丙酮，微溶于乙腈， 碘化鉍鉀反應(yīng)呈陽性。
[0064] IR(KBr)光譜^δΟΟαιΓ1處強(qiáng)吸收峰的出現(xiàn)說明該化學(xué)結(jié)構(gòu)中含羥基，1700CHT1處 強(qiáng)強(qiáng)吸收峰的出現(xiàn)說明該結(jié)構(gòu)中含羰基，l65〇cm_1處吸收峰的出現(xiàn)說明該結(jié)構(gòu)中含雙鍵。 [0065] ESI-MS:m/z358. 3[M+H]+，提示該化合物的分子量為 357. 3。
[0066] 13C-NMR(CDC13, 125MHz)譜共給出22個碳信號，結(jié)合DEPT譜可知，化合物cw-Ι有 2 個甲基信號（δ c, ppm:26. 09、13· 62)，8 個亞甲基信號（δ c，ppm: 111. 45、57. 42、50. 95、 38. 16、37· 34、32· 19、31· 66、23· 21)，7 個次甲基信號（δ。，ppm:77. 32、70· 37、66· 03、53· 80、 49. 19、43· 52、35· 22) ,5 個季碳信號（δ c，ppm:210. 03、151· 01、52· 41、50· 00、34· 11)，其中 δ c210. 03ppm處季碳信號為羰基碳信號，δ。151· 01、111· 45ppm處季碳、亞甲基信號分別為 端烯的兩個碳信號。
[0067] iH-NMRCCDClw 500MHz)譜：δΗ(ρρπι)〇· 771(3H, s)為甲基的質(zhì)子信號， SH1.072(3H，t，J = 7.5Hz)為氮乙基上甲基的質(zhì)子信號，δΗ2.491(2Η，πι)為氮乙基上亞甲 基的質(zhì)子信號，S A S49 (1Η，s)、4· 365 (1Η，d，J = 8. 0Hz)分別為兩個連羥基次甲基碳上的 質(zhì)子信號，SH5.201、5.293(各lH，s)為端烯的兩個質(zhì)子信號。
[0068] 根據(jù)以上13C_NMR和1H-NMR彳目號特征與分布規(guī)律，初步推斷化合物 cw-1為C2。 二萜生物堿類化合物，經(jīng)與文獻(xiàn)對照，確定化合物cw-1為準(zhǔn)噶爾烏頭堿（又名宋果靈， S〇ng〇rine，C22H31N03)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索可知該化合物為首次從草烏中分離得到。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式 如下所示：
[0069]

【權(quán)利要求】
1. 草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，其特征在于， 色譜條件和檢測條件： 流動相：乙腈-0. 1%三乙胺水溶液的體積比為（40-50) :(50-60) 柱溫：20-30°C 流速：〇· 5_L 50mL · min-1 進(jìn)樣量：10-30 μ L ELSD檢測器的漂移管溫度：90-98°C 氣體壓力：2. 00-3. OObar 撞擊器呈關(guān)閉狀態(tài)； 供試品溶液的制備： 精密稱取草烏粉末適量，以氨水浸濕，氯仿加熱回流提取1-3次，每次加入氨水料液比 (g/ml)為1:(0. 5-2)、氯仿料液比（g/ml)為1:(6-8)，提取時間均為0.5-2. 0h，過濾，合并 濾液，減壓回收溶劑，用乙腈重新溶解至容量瓶中，定容，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品 溶液； 對照品溶液的制備： 精密稱取準(zhǔn)噶爾烏頭堿，用乙腈溶解至容量瓶中，定容，搖勻，得1. 0-2. Omg · ml/1的對 照品溶液。
2. 如權(quán)利要求1所述的草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，其特征在于， 色譜條件和檢測條件： 流動相：乙腈-0. 1 %三乙胺溶液的體積比為40 :60 柱溫：25°C 流速：1. OmL · min-1 進(jìn)樣量：20 μ L ELSD檢測器的漂移管溫度：96°C 氣體壓力：2. 50bar 撞擊器呈關(guān)閉狀態(tài)。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，其特征 在于，供試品溶液的制備： 精密稱取草烏粉末3. 0g，以氨水浸濕，氯仿加熱回流提取2次，每次加入氨水3. OmL、 氯仿20mL，提取時間分別為1. 5h、l. 0h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，用乙腈重新溶解至 10mL容量瓶中，定容，搖勻，過0. 22 μ m微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的草烏中準(zhǔn)噶爾烏頭堿的HPLC-ELSD含量測定方法，其特征 在于，對照品溶液的制備： 精密稱取化合物準(zhǔn)噶爾烏頭堿75mg，純度為99. 5 %，用乙腈溶解至50mL容量瓶中，定 容，搖勻，得1. 5mg · ml/1的對照品溶液，置于4°C冷藏備用。
【文檔編號】G01N30/88GK104297401SQ201410348232
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】李緒文, 金永日, 彭劭, 陳妍心, 臧慧明, 楊潔, 李蘭杰 申請人:吉林大學(xué)