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一種基于磁性微珠的低場nmr稀有細(xì)胞檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，包含以下步驟：(1)分別制備目標(biāo)稀有細(xì)胞懸浮液的標(biāo)準(zhǔn)樣本和待測樣本；(2)分別加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑，使核磁共振造影劑與樣本中的稀有細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)富集，除去未反應(yīng)的核磁共振造影劑，得到核磁共振造影劑富集的標(biāo)準(zhǔn)樣本和待測樣本；(3)用低場核磁共振分析儀分別對標(biāo)準(zhǔn)樣本和待檢樣本進(jìn)行弛豫時間測定，并以無菌的去離子水或緩沖液作為空白對照；(4)計算弛豫時間改變量，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待檢樣本中目標(biāo)稀有細(xì)胞的含量。本發(fā)明可簡便、快速、高特異性和高靈敏度地檢測生物體液樣本中含量較低的稀有細(xì)胞。
【專利說明】一種基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，特別涉及一種生物體液樣本中稀有細(xì)胞的檢測 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 稀有細(xì)胞是指生物體液樣本（包括血液、胸水、腹水、尿液、腦脊液等）中的一些非 典型細(xì)胞，大量研究表明，對稀有細(xì)胞的檢測和鑒定對于相關(guān)疾病的病理機(jī)制及靶向藥物 開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。因此，尋找準(zhǔn)確、快速地的稀有細(xì)胞檢測方法將成為亟待解決的問 題。然而稀有細(xì)胞在生物體液中的濃度非常低，與非目標(biāo)細(xì)胞的比例大約是1 :1〇7,用傳統(tǒng) 技術(shù)無法計數(shù)，所以迫切需要一種簡單準(zhǔn)確快速的方法解決這一難題。
[0003] 由于循環(huán)稀有細(xì)胞在體液中的含量很少，要經(jīng)過有效的富集步驟才能在后續(xù)的實 驗中識別鑒定。目前市場上廣泛應(yīng)用于稀有細(xì)胞檢測研究的方法主要有密度梯度離心法、 膜過濾法和免疫磁性分離技術(shù)。
[0004] 密度梯度區(qū)帶離心法又稱為區(qū)帶離心法，是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心 沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶 的分離方法。使用此法可以同時使樣品中幾個活全部組分分離，具有良好的分辨率。此法 的優(yōu)點是：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離 具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；③顆粒不會擠壓變形，能保持 顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對流而引起混合。此法的缺點是：①離心時間較長；② 需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液。研究中經(jīng)常利用密度梯度離心的原理，用Ficoll液分離和純 化人或動物外周血單個核細(xì)胞（PBMC)。
[0005] 膜過濾方法是根據(jù)某些稀有細(xì)胞體積大于外周血中粒細(xì)胞從而使稀有細(xì)胞從外 周血中分離富集出來，然后利用免疫熒光技術(shù)對稀有細(xì)胞進(jìn)行鑒別診斷。該方法中，膜過濾 細(xì)胞富集過程相對容易，但是并不是所有稀有細(xì)胞體積都大于外周血中粒細(xì)胞的，很多稀 有細(xì)胞的體積和粒細(xì)胞大小差不多，甚至比粒細(xì)胞體積更小。基于以上的認(rèn)識，膜過濾方法 被逐漸拋棄。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種可簡便、快速、高特異性和高靈敏度地檢測生物體液 樣本中含量較低的稀有細(xì)胞的低場核磁共振檢測分析方法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測 方法，包含以下步驟：
[0008] (1)樣本制備
[0009] 將純培養(yǎng)的目標(biāo)稀有細(xì)胞的細(xì)胞系，以緩沖液進(jìn)行不同梯度稀釋，制得系列濃度 的稀有細(xì)胞懸浮液標(biāo)準(zhǔn)樣本；
[0010] 對待測生物體液樣本進(jìn)行Ficoll密度梯度離心獲取候選混合細(xì)胞群，遞經(jīng)洗滌 高心重懸，制得稀有細(xì)胞懸浮液待檢樣本；
[0011] (2)核磁共振造影劑親和富集
[0012] 取上述標(biāo)準(zhǔn)樣本，加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑，使 核磁共振造影劑與標(biāo)準(zhǔn)樣本中的稀有細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)富集，然后除去未反應(yīng)的核磁共振 造影劑，得到核磁共振造影劑富集的標(biāo)準(zhǔn)樣本；
[0013] 取上述待檢樣本，加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑，使 核磁共振造影劑與待檢樣本中的稀有細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)富集，然后除去未反應(yīng)的核磁共振 造影劑，得到核磁共振造影劑富集的待檢樣本；
[0014] (3)核磁共振弛豫時間檢測
[0015] 取上述核磁共振造影劑富集的標(biāo)準(zhǔn)樣本，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測 定，得弛豫時間值T sampl^以緩沖液作為空白對照，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測 定，得弛豫時間值 ^blank ?
[0016] 取上述核磁共振造影劑富集的待檢樣本，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測 定，得弛豫時間值T test;
[0017] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與結(jié)果得出
[0018] 計算標(biāo)準(zhǔn)樣本的弛豫時間改變量Λ T2,所述Λ T2 = Tsample_Tblank，以Λ T2為縱坐 標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣本中的目標(biāo)稀有細(xì)胞含量為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0019] 計算待檢樣本的弛豫時間改變量AT2test，所述AT2test = Ttest_Tblank，AT2test不為 ο，則表明待檢樣本中含有目標(biāo)稀有細(xì)胞，同時依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待檢樣本中目標(biāo)稀有 細(xì)胞的含量。
[0020] 由上述檢測步驟可知：本發(fā)明利用核磁共振造影劑可以和稀有細(xì)胞結(jié)合的特性， 運用免疫磁性分離技術(shù)，在外加低磁場的作用下通過檢驗磁珠-細(xì)胞懸浮液中水分子的氫 原子信號來定量循環(huán)稀有細(xì)胞。
[0021] 具體來說，本發(fā)明首先在樣品前處理中進(jìn)行稀有細(xì)胞的快速富集；然后，基于特異 性抗體抗原免疫反應(yīng)、利用低場核磁共振分析儀檢測被結(jié)合在稀有細(xì)胞表面的核磁共振造 影劑的弛豫時間的變化，實現(xiàn)對稀有細(xì)胞的快速而靈敏地定性及定量的檢測。本發(fā)明中所 述的目標(biāo)稀有細(xì)胞的最終檢出評價方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時間特性參數(shù)的變化，所 述弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間。
[0022] 優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測方法中，步驟（2)中所使用的核磁共振造影劑為順磁性 納米磁珠或超順磁性納米磁珠，且所述的順磁性納米磁珠或超順磁性納米磁珠優(yōu)選為抗 EpCAM免疫納米磁珠、抗CD45免疫納米磁珠、鏈霉親和素納米磁珠、葉酸修飾的磁性脂質(zhì)體 中的一種或幾種。上述的免疫磁珠將固化試劑特有的優(yōu)點與免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性結(jié)合 于一體，從而快速地實現(xiàn)從混合細(xì)胞群中捕獲和分離稀有目標(biāo)細(xì)胞的目的。所得稀有細(xì)胞 可用于計數(shù)或其他方面研究應(yīng)用。
[0023] 優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測方法中，使核磁共振造影劑分別與標(biāo)準(zhǔn)樣本、待檢樣本中的 稀有細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)富集的反應(yīng)條件為：混合均勻后在4?8°C低溫下孵育10?15min。
[0024] 在上述反應(yīng)條件下，核磁共振造影劑與樣本中稀有細(xì)胞進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng)產(chǎn) 生的背景信號最低，準(zhǔn)確性更好。
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測方法中，所述步驟（2)中，在加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異 表達(dá)抗體的核磁共振造影劑之前，還包括下述步驟：加入偶聯(lián)有抗CD45的核磁共振造影劑 將非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記，通過外加磁場方式將上述標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞除去。
[0026] 本發(fā)明中免疫磁珠富集方法，除上述
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟（2)所描述的直接加入偶聯(lián) 有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑，使核磁共振造影劑與稀有細(xì)胞發(fā)生靶向 免疫（抗原抗體反應(yīng)）富集（陽性富集）外，亦可采用陰性+陽性雙富集的方法達(dá)到目標(biāo)細(xì) 胞磁性富集的目的。具體操作方法即為：在加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁 共振造影劑之前，先利用偶聯(lián)有抗⑶45的核磁共振造影劑（磁性微珠）將非目標(biāo)細(xì)胞（主 要為上皮細(xì)胞中含量較多的白細(xì)胞等）進(jìn)行磁性標(biāo)記，通過外加磁場方式將白細(xì)胞從含有 目標(biāo)稀有細(xì)胞的細(xì)胞群混合物中去除掉（陰性標(biāo)記非目標(biāo)細(xì)胞）；然后，上述獲得細(xì)胞亞群 混合物，根據(jù)亞群標(biāo)志物選擇適宜的偶聯(lián)有目標(biāo)細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑（磁 性微珠）進(jìn)行免疫反應(yīng)富集，從而獲得標(biāo)記有目標(biāo)細(xì)胞的核磁共振造影劑（陽性標(biāo)記目標(biāo) 細(xì)胞）。通過上述陰性+陽性雙富集的操作方法，可更精確可靠地達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞磁性富集的 目的。
[0027] 優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測方法中，所述步驟（2)中，核磁共振造影劑加入量優(yōu)選為： 每200個目標(biāo)稀有細(xì)胞中加入1微升核磁共振造影劑，除去未反應(yīng)的核磁共振造影劑的方 法為：緩慢吸走上清液，然后施加外加磁場或穩(wěn)定離心，將富集核磁共振造影劑的樣本用緩 沖液進(jìn)行洗滌。此比例的核磁共振造影劑不但可以最優(yōu)化地獲得稀有細(xì)胞，還能夠減少由 于核磁共振造影劑加入過多導(dǎo)致的背景增強(qiáng)，影響檢測效果。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測方法中，所述步驟（3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場 強(qiáng)度為20?25MHz，磁體溫度為30?35°C，重復(fù)時間3?5s。更優(yōu)選地，控制低場核磁共 振分析儀的磁場強(qiáng)度優(yōu)選為20. 18MHz，磁體溫度優(yōu)選為35°C，重復(fù)時間優(yōu)選為5s。
[0029] 對上述核磁共振體系磁場強(qiáng)度、磁體溫度和重復(fù)時間的控制，可使檢測更加準(zhǔn)確， 可控性更強(qiáng)，且利于平行實驗的比較和質(zhì)控。
[0030] 優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測方法中，所述步驟（4)中，計算標(biāo)準(zhǔn)樣本的弛豫時間改變量 Λ T2和待檢樣本的弛豫時間改變量△ T2test時，分別取多次測量弛豫時間的平均值進(jìn)行計 算，從而能使本發(fā)明的檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
[0031] 由上述的論述可知，本發(fā)明通過將核磁共振造影劑（如超順免疫微磁珠）富集和 低場核磁共振儀檢測相結(jié)合，將稀有細(xì)胞的分離和鑒定有機(jī)整合在一起，從而快速實現(xiàn)從 混合細(xì)胞群中捕獲和分離稀有目標(biāo)細(xì)胞。在本發(fā)明中利用免疫磁性微珠選擇和分離來高度 富集和濃縮體液樣品中存在的任何稀有細(xì)胞，將所捕獲的細(xì)胞可檢測地標(biāo)以稀有細(xì)胞特異 性表達(dá)抗體，且被超順磁性微珠所包被，以使得能對所捕獲的稀有細(xì)胞進(jìn)行鑒別和計數(shù)以 及與污染性非靶細(xì)胞明確地在核磁共振儀上做區(qū)分。由于具有在每7. 5ml體液中可檢測到 微量稀有細(xì)胞的極強(qiáng)敏感性，是一種具有極強(qiáng)敏感性和特異性的廣譜的分離方案。
[0032] 現(xiàn)有的對于稀有細(xì)胞的檢測方法均涉及到免疫熒光技術(shù)，需通過熒光顯微鏡鏡檢 來對體液中循環(huán)稀有細(xì)胞的個數(shù)進(jìn)行定量，普遍具有操作復(fù)雜、靈敏性低、檢驗時間長、價 格高、對操作人員要求高，不易重復(fù)的弊端（如i · FISH檢測方法成熟的操作人員單次僅 能同時操作6個樣本，整個過程耗時2天）。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將偶聯(lián)有特異表達(dá)抗 體的核磁共振造影劑富集稀有目標(biāo)細(xì)胞技術(shù)與具有快速和高靈敏度檢測技術(shù)的低場核磁 共振儀相結(jié)合，從而實現(xiàn)了快速、高效而高靈敏地檢測外周血中稀有細(xì)胞的目的，具有如下 優(yōu)點：（1)可使目標(biāo)稀有細(xì)胞直接從生物體液中分離出來，具有簡便、快速的特點；（2)和 離心、過濾等方法相比，稀有細(xì)胞在磁性分離時受到的剪切力小，可避免細(xì)胞的失活；(3) 具有很高的選擇性；(4)外加磁場不會對原料液中的離子和帶電溶質(zhì)的運動產(chǎn)生影響；（5) 儀器設(shè)備簡單，操作費用低。本發(fā)明的方法可以實現(xiàn)大規(guī)模樣本的稀有細(xì)胞快速檢測，無 論對于產(chǎn)業(yè)化還是客戶體驗上都無疑具有重要的意義。該方法為首次被提出，目前未見相 關(guān)報道，且該方法適用于對生物體液樣本中的各種稀有細(xì)胞（包括所有的循環(huán)稀有上皮細(xì) 胞）的檢測、鑒定和定量分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法的流程圖；
[0034] 圖2是實施例1中以標(biāo)準(zhǔn)樣本的弛豫時間改變量Λ T2為縱坐標(biāo)、以標(biāo)準(zhǔn)樣本中的 目標(biāo)稀有細(xì)胞含量為橫坐標(biāo)所制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實施方式】
[0035] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的各實 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。
[0036] 實施例1
[0037] (1)樣本制備
[0038] 待檢樣本制備：
[0039] 1. 1從乳腺癌模型鼠中獲得抗凝血樣（?10ml)，所述樣品包含懷疑含有目標(biāo)稀有 細(xì)胞的混合細(xì)胞群。采集的標(biāo)本應(yīng)在當(dāng)天處理！室溫避光保持時間不應(yīng)超過24小時；
[0040] 1. 2Ficoll密度梯度離心法獲取候選混合細(xì)胞群
[0041] 1)加入適量細(xì)胞分層液（Ficoll溶液配制而成）至無菌離心管A底部，然后將上 述抗凝血測試樣以PBS液作適當(dāng)稀釋后（2:1)，沿管壁輕輕加在分層液上面，使兩者形成一 個清晰的界面。
[0042] 2) 400 Xg水平離心30min (離心機(jī)轉(zhuǎn)速的增加和減少要均勻、平穩(wěn)，以保證形成清 晰的界面）。
[0043] 3)離心后管內(nèi)最終可見三層液體，上層為黃色液體，中間層為透明液體，底層為 棕紅色沉積紅細(xì)胞（紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集 成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯?個核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀），吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸 (300XglOmin洗滌兩次）于B管中而獲得可用于下一步免疫微磁珠富集的細(xì)胞懸浮液待檢 樣本。
[0044] 標(biāo)準(zhǔn)樣本制備：
[0045] 將純培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞，以PBS進(jìn)行不同梯度稀釋（0, 10, 102, 103, 104, 105, 106， 107cells/ml)，從而獲得系列濃度的稀有細(xì)胞懸浮液標(biāo)準(zhǔn)樣本；
[0046] (2)磁性微珠免疫親和富集
[0047] 分別取上述標(biāo)準(zhǔn)樣本和待檢樣本細(xì)胞懸浮液標(biāo)準(zhǔn)系列于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分 別加入100 μ L偶聯(lián)有稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的超順磁免疫磁珠，于4_8°C孵育反應(yīng)15min， 適當(dāng)可選擇溫和搖床進(jìn)行混勻孵育，得到系列Rare cell-Microbeads-Ab復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)液。此 夕卜，為防止細(xì)胞表面抗體的非特異性結(jié)合，操作必須迅速、細(xì)胞需置于冰上、所需溶液需預(yù) 冷。獲得磁性微珠富集的標(biāo)準(zhǔn)樣本和磁性微珠富集的待檢樣本。
[0048] (3)磁共振弛豫時間測試
[0049] 儀器參數(shù)如下：磁場強(qiáng)度20. 18MHz，磁體溫度35°C，重復(fù)時間5s，每次數(shù)據(jù)測量3 次后取平均值。
[0050] 標(biāo)準(zhǔn)樣本弛豫時間測量與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：
[0051] 分別取180 μ L上述系列Rare cell-Microbeads-Ab復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)液至核磁共振管 中，用低場核磁共振檢測儀測量待測試樣橫向弛豫時間，得弛豫時間值T sample;以無菌的去 離子水或緩沖液作為空白對照，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測定，得弛豫時間值 Tblank，以弛豫時間改變量（ ΔΤ2)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣本中稀有細(xì)胞的含量為橫坐標(biāo)，繪制成 標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，ΛΤ2按照式（1)表示。
[0052] ΔΤ2 = Tsample_Tblank.......................................(1)
[0053] 式中：Tsample :系列標(biāo)準(zhǔn)樣本弛豫時間三次平行測量平均值；Tblank :陰性樣品弛豫時 間三次平行測量平均值。
[0054] 標(biāo)準(zhǔn)樣本中循環(huán)稀有細(xì)胞定量和鑒定結(jié)果統(tǒng)計表：
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，包含以下步驟： (1) 樣本制備 將純培養(yǎng)的目標(biāo)稀有細(xì)胞的細(xì)胞系，以緩沖液進(jìn)行不同梯度稀釋，制得系列濃度的稀 有細(xì)胞懸浮液標(biāo)準(zhǔn)樣本； 對待測生物體液樣本進(jìn)行Ficoll密度梯度離心獲取候選混合細(xì)胞群，遞經(jīng)洗滌離高 心重懸，制得稀有細(xì)胞懸浮液待檢樣本； (2) 核磁共振造影劑親和富集 取上述標(biāo)準(zhǔn)樣本，加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑，使核磁 共振造影劑與標(biāo)準(zhǔn)樣本中的稀有細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)富集，然后除去未反應(yīng)的核磁共振造影 齊U，得到核磁共振造影劑富集的標(biāo)準(zhǔn)樣本； 取上述待檢樣本，加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑，使核磁 共振造影劑與待檢樣本中的稀有細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)富集，然后除去未反應(yīng)的核磁共振造影 齊U，得到核磁共振造影劑富集的待檢樣本； (3) 核磁共振弛豫時間檢測 取上述核磁共振造影劑富集的標(biāo)準(zhǔn)樣本，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測定， 得弛豫時間值Tsampl^以緩沖液作為空白對照，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測定， 得弛豫時間值T blank; 取上述核磁共振造影劑富集的待檢樣本，用低場核磁共振分析儀進(jìn)行弛豫時間測定， 得弛豫時間值Ttest; (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與結(jié)果得出 計算標(biāo)準(zhǔn)樣本的弛豫時間改變量ΔΤ2,所述ΔΤ2 = Tsample;-Tblank，以ΔΤ2為縱坐標(biāo)，以 標(biāo)準(zhǔn)樣本中的目標(biāo)稀有細(xì)胞含量為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線； 計算待檢樣本的弛豫時間改變量AT2test，所述AT2test = Ttest_Tblank，AT2test不為0,則 表明待檢樣本中含有目標(biāo)稀有細(xì)胞，同時依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待檢樣本中目標(biāo)稀有細(xì)胞 的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，步 驟（2)中所使用的核磁共振造影劑優(yōu)選為順磁性納米磁珠或超順磁性納米磁珠。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所 述順磁性或超順磁性納米磁珠優(yōu)選為抗EpCAM免疫納米磁珠、抗CD45免疫納米磁珠、鏈霉 親和素納米磁珠、葉酸修飾的磁性脂質(zhì)體中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所 述步驟（2)中，使核磁共振造影劑分別與標(biāo)準(zhǔn)樣本、待檢樣本中的稀有細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng) 富集的反應(yīng)條件為：混合均勻后在4?8°C溫度下孵育10?15min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所 述步驟（2)中，在加入偶聯(lián)有目標(biāo)稀有細(xì)胞特異表達(dá)抗體的核磁共振造影劑之前，還包括 下述步驟：加入偶聯(lián)有抗CD45的核磁共振造影劑將非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記，通過外加磁 場方式將上述標(biāo)記的非目標(biāo)細(xì)胞除去。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所 述步驟（2)中，除去未反應(yīng)的核磁共振造影劑的方法為：緩慢吸走上清液，然后施加外加磁 場或穩(wěn)定離心，將富集核磁共振造影劑的樣本用緩沖液進(jìn)行洗滌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所 述步驟（2)中，核磁共振造影劑加入量優(yōu)選為：每200個目標(biāo)稀有細(xì)胞中加入1微升核磁共 振造影劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所 述步驟（3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場強(qiáng)度為20?25MHz，磁體溫度為30?35°C， 重復(fù)時間3?5s。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在于， 所述步驟（3)中，控制低場核磁共振分析儀的磁場強(qiáng)度優(yōu)選為20. 18MHz，磁體溫度優(yōu)選為 35°C，重復(fù)時間優(yōu)選為5s。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于磁性微珠的低場NMR稀有細(xì)胞檢測方法，其特征在 于，所述步驟（4)中，計算標(biāo)準(zhǔn)樣本的弛豫時間改變量ΛΤ2和待檢樣本的弛豫時間改變量 Λ T2test時，分別取多次測量弛豫時間的平均值進(jìn)行計算。
【文檔編號】G01N24/08GK104122285SQ201410326420
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月9日
【發(fā)明者】張祥林 申請人:張祥林