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一種高靈敏度測試游離生物素的方法
【專利摘要】一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿菌對游離生物素的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成正比的關(guān)系，根據(jù)吸光值與工作曲線進(jìn)行比較，即可算出試樣中待測物的濃度；其中，所述吸光值為采用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)后的液體獲得的吸光度。本發(fā)明提供了一種簡便、高效的游離生物素的檢測方法。
【專利說明】一種高靈敏度測試游離生物素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物食品檢測領(lǐng)域，具體地，涉及一種高靈敏度測試游離生物素的 方法，特別是針對嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的檢測。 技術(shù)背景
[0002] 生物素又稱為維生素H，是水溶性維生素，屬于B族維生素，是含硫的一種維生素， 也是生物體內(nèi)羧基轉(zhuǎn)化酶作用的一種輔酶，故又稱為輔酶R。
[0003] 生物素是生物題生長發(fā)育必需的一種營養(yǎng)素，它參與有機(jī)體多種主要的新陳代謝 活動(dòng)。特別是對嬰幼兒及孕產(chǎn)婦有著特殊的重要性，因此在嬰幼兒乳制品、孕產(chǎn)婦乳制品 及食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑中添加生物素是十分必要的。其主要的性能與用途有：構(gòu)成視沉細(xì)胞內(nèi) 感光物質(zhì)；維持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整和健全；增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)和抵抗力和維持正常生長 發(fā)育。
[0004] 生物素主要來源于牛奶、牛肝、蛋黃、動(dòng)物腎臟、草莓、柚子、葡萄等水果中，此外， 瘦肉、糙米、啤酒、小麥中也含有生物素。
[0005] 近些年生物素的發(fā)展越來越受到關(guān)注，檢測的方法也比較多，但每種檢測方法的 原理，時(shí)效，以及針對的產(chǎn)品都各不相同，故在實(shí)際應(yīng)用上，能針對樣品的不同而選擇合適 的生物素檢測方法也是至關(guān)重要的。
[0006] 常用的生物素檢測方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫 法、突光法等。
[0007] 其中微生物的方法是目前應(yīng)用比較廣泛的方法，也是嬰幼兒食品和乳品中游離生 物素國標(biāo)檢測方法中唯一的檢測方法，這個(gè)方法主要用于檢測樣品中生物素含量較少的情 況，原理是利用生物素營養(yǎng)缺陷型菌株對生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試驗(yàn)中待 測物質(zhì)的含量。在含有除待測物質(zhì)以外的所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長與待測 物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測物質(zhì) 的含量。
[0008] 選用上述傳統(tǒng)的檢測方式，此方法雖然靈敏度高，但該方法工作量大，在用分光光 度計(jì)讀數(shù)時(shí)要求漩渦混合后立即移入比色皿內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)，并且要求每支試管的穩(wěn)定時(shí)間相 同，對操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測1到3個(gè)培養(yǎng)管，檢測效率低，也會(huì) 增加誤差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此需要開發(fā)一種更簡便和實(shí)用的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種簡便、高效的游離生物素的檢 測方法。
[0010] 本發(fā)明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿 菌對游離生物素的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成 正比的關(guān)系，根據(jù)吸光值與工作曲線進(jìn)行比較，即可算出試樣中待測物的濃度；其中，吸光 值為采用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)后的液體獲得的吸光度。
[0011] 其中，本發(fā)明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其植物乳桿菌為 ATCC8014。
[0012] 另外，本發(fā)明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，還具備這樣的特點(diǎn)， 艮P、具體分析步驟如下所示：步驟一、接種菌懸液的制備；步驟二、樣品的處理；步驟三、標(biāo) 準(zhǔn)曲線的制作；步驟四、待測液的制作；步驟五、滅菌；步驟六、接種；步驟七、培養(yǎng)；步驟八、 分析測試；其中，在步驟七中將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36°c±1°C培養(yǎng)19h?20h。
[0013] 此外，在上述步驟八中具體地，包括如下測試程序：
[0014] (1)、對每支試管進(jìn)行視覺檢查，接種空白試管S1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，若出現(xiàn)渾 濁，則結(jié)果無效；
[0015] (2)、以接種空白孔S1做對照，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時(shí)后重 新測定，兩次結(jié)果透光率差值若小于2%，則取出全部檢驗(yàn)管測其吸光度A;
[0016] (3)、以接種空白試管S2為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0, 一次讀出其他每支試管的吸光 度A，樣品空白的吸光度A-并讀出；
[0017] (4)、充分混合每一支試管后，立即將培養(yǎng)液移入96孔板中，每孔200uL，每個(gè)試管 讀數(shù)前搖勻樣液，于660nm波長下讀吸光值；
[0018] 上述混合過程，優(yōu)選用漩渦混合器充分混合每一支試管，之后還可根據(jù)需要加入 一滴消泡劑。
[0019] (5)、對每個(gè)編號的待測液孔，用每個(gè)孔的吸光度值計(jì)算每毫升該編號待測液生物 素的含量，并計(jì)算該編號待測液的生物素含量平均值。每支試管測得的該濃度不得超過該 平均值的±15%，超過者要舍去，如果符合該要求的孔少于所有四個(gè)編號待測液總孔數(shù)的 2/3,需要重新檢驗(yàn)；如果符合該要求的孔數(shù)大于等于原來孔數(shù)的2/3,重新計(jì)算每一編號 的有效試樣孔中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號試樣孔的總 平均值，用于計(jì)算試樣中的生物素含量。
[0020] 上述方法主要應(yīng)用于測定嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素。
[0021]本發(fā)明的作用和效果
[0022] 本發(fā)明提供了一種檢測生物素含量的方法。主要是對"GB5413. 19-2010嬰幼兒食 品和乳品中游離生物素的測定"方法進(jìn)行了改進(jìn)發(fā)明，用96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)的比色皿進(jìn)行讀 數(shù)，在讀數(shù)時(shí)可以省去單支試管逐一讀數(shù)所用的時(shí)間，減少誤差，使該方法操作更簡便和準(zhǔn) 確，節(jié)省人力和物力。
[0023]另外，本發(fā)明無須特別的培養(yǎng)方式即可施行，操作簡單，限定條件少。
[0024] 此外，還限定了具體的分析條件等參數(shù)，能夠更為準(zhǔn)確、快捷的測定嬰幼兒食品中 的游離生物素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 附圖1為分光光度計(jì)法測定讀數(shù)曲線；
[0026] 附圖2為酶標(biāo)儀測定讀數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 1、范圍
[0028] 本方法適用于嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定。
[0029] 2、原理
[0030] 利用植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)對游離生物素的特異性和靈敏性， 定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。在含有除待測物質(zhì)以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微 生物的生長與待測物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算 出試樣中待測物質(zhì)的含量。
[0031] 3試劑和材料
[0032] 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。
[0033]3. 1 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)，ATCC8014。
[0034] 3. 2 生物素（d-Biotin或VitaminH)標(biāo)準(zhǔn)品（C1QH16N203S):純度彡 99%。
[0035] 3. 3培養(yǎng)基
[0036] 3. 3. 1乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基。
[0037] 3. 3. 2乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基。
[0038] 3.3.3生物素測定用培養(yǎng)基。
[0039] 注：一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。
[0040] 3. 4 乙醇溶液（50% )。
[0041] 3. 5硫酸溶液（3% ):量取3mL硫酸加入到水中，定容至100mL。
[0042] 3. 6氫氧化鈉溶液（2. 0mol/L):稱取80g氫氧化鈉溶于1000mL水中。
[0043] 3. 7氯化鈉溶液（9g/L):稱取9. 0g氯化鈉溶解于1000mL水中，分裝試管，每管 lOmLo121。。滅菌 15min。
[0044] 3.8標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0045] 3. 8. 1生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100yg/mL):稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品（3. 2)用乙醇溶液 (3.4)定容至生物素濃度為100iig/mL，貯于冰箱中。
[0046] 3. 8. 2生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1yg/mL):吸取lmL生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（3. 8. 1)，用乙 醇溶液（3. 4)定容至100mL。
[0047] 3. 8. 3生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液（10ng/mL):吸取lmL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（3. 8. 2)，用乙 醇溶液（3. 4)定容至100mL。
[0048] 3. 8. 4標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分兩個(gè)濃度，高濃度溶液的濃度為0. 2ng/mL;低濃度溶液 的濃度為〇.Ing/mL。從工作液中（3. 8. 3)吸取兩次各5mL，用水分別定容到250mL和500mL。
[0049] 注：所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲(chǔ)存于冰箱內(nèi)。3. 8. 1、3. 8. 2、和3. 8. 3保存期三個(gè)月，3. 8. 4 臨用前配制。
[0050] 4、儀器和設(shè)備
[0051] 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
[0052] 4. 1 天平：感量為0?lmg。
[0053] 4. 2pH計(jì)：精度彡 0? 02。
[0054] 4.3分光光度計(jì)。
[0055] 4.4渦旋混合器。
[0056] 4. 5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速彡2000轉(zhuǎn)/分鐘。
[0057] 4. 6 恒溫培養(yǎng)箱：36°C± 1 °C。
[0058] 4. 7 冰箱：2°C?5°C。
[0059] 4. 8無菌吸管：10mL(具0?lmL刻度）或微量移液器或吸頭。
[0060] 4. 9 瓶口分液器：0mL?10mL。
[0061] 4. 10 錐形瓶：200mL。
[0062] 4. 11 容量瓶（A類）：100mL，250mL，500mL。
[0063] 4. 12單刻度移液管（A類）：容量5mL。
[0064] 4. 13 漏斗：直徑 90mm。
[0065] 4. 14定量濾紙：直徑90_。
[0066] 4. 15 試管：18mmX180mm。
[0067] 4. 16 96 孔板。
[0068] 4. 17 酶標(biāo)儀。
[0069]注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即 可）對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后在200°C干熱2h。
[0070] 5、分析步驟
[0071] 5. 1接種菌懸液的制備
[0072] 5. 1. 1將凍干菌株（3. 1)活化后，轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（3.3. 1)中， 36°C±1°C培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接2?3代來增強(qiáng)活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸 桿菌肉湯培養(yǎng)基（3. 3. 2)中培養(yǎng)。
[0073] 5. 1. 2將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心2min?3min，傾出上清 液，加入10mL氯化鈉溶液（3. 7)，混勻，再離心2min?3min，如此清洗3次?4次，吸適量 該菌懸液于10mL鹽水（4. 7)中，待測。
[0074] 5. 1.3用分光光度計(jì)以氯化鈉溶液（3.7)做空白，于550nm波長下測菌懸液 (5. 1. 2)的透光率，使其透光率在60%?80%之間。
[0075] 5.2樣品的處理
[0076] 5. 2. 1干粉樣品
[0077] 稱取一定量樣品（精確至O.OOOlg)于250mL三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.2iig? 0. 5iig生物素。繼續(xù)5. 2. 3步驟。
[0078] 5.2.2液體樣品
[0079] 吸一定量的液體樣品于250mL三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.g?0.g生物素。繼 續(xù)6. 2. 3步驟。
[0080] 5.2.3樣品的提取
[0081] 加入硫酸溶液（3. 5) 100mL，121°C水解30min，冷卻后用氫氧化鈉溶液（3. 6)調(diào)節(jié) pH至4. 5 ±0. 2，定量轉(zhuǎn)到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的 幾毫升。吸取濾液5mL，加入約20mL水，用氫氧化鈉溶液（3. 6)調(diào)pH為6. 8 ±0. 2,定量轉(zhuǎn) 至lj100mL容量瓶中，用水定容。
[0082] 5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0083] 按表1順序加入已滅菌的水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（3. 8. 4)和生物素測定用培養(yǎng)基 (3.3.3)于培養(yǎng)管中，一式三份。
[0084]表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

【權(quán)利要求】
1. 一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿菌對游離生物素 的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成正比的關(guān)系，根 據(jù)吸光值與工作曲線進(jìn)行比較，即可算出試樣中待測物的濃度； 其中，所述吸光值為采用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)后的液體獲得的吸光度。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：所述植物 乳桿菌為ATCC8014。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于，具體分析 步驟如下所示： 步驟一、接種菌懸液的制備； 步驟二、樣品的處理； 步驟三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作； 步驟四、待測液的制作； 步驟五、滅菌； 步驟六、接種； 步驟七、培養(yǎng)； 步驟八、分析測試。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：所述步驟 八中包括如下測試程序：步驟七中所述的培養(yǎng)步驟為將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36°C ±1°C培 養(yǎng) 19h ?20h。
5. 如權(quán)利要求3所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：所述步驟 八中包括如下測試程序： (1) 、對每支試管進(jìn)行視覺檢查，接種空白試管S1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，若出現(xiàn)渾濁， 則結(jié)果無效； (2) 、以接種空白孔S1做對照，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時(shí)后重新測 定，兩次結(jié)果透光率差值若小于2%，則取出全部檢驗(yàn)管測其吸光度A ; (3) 、以接種空白試管S2為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0, 一次讀出其他每支試管的吸光度A， 樣品空白的吸光度A-并讀出； (4) 、充分混合每一支試管后，立即將培養(yǎng)液移入96孔板中，每孔200uL，每個(gè)試管讀數(shù) 前搖勻樣液，于660nm波長下讀吸光值； (5) 、對每個(gè)編號的待測液孔，用每個(gè)孔的吸光度值計(jì)算每毫升該編號待測液生物素的 含量，并計(jì)算該編號待測液的生物素含量平均值。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：每支試 管測得的該濃度不得超過該平均值的± 15 %，超過者要舍去，如果符合該要求的孔少于所 有編號待測液總孔數(shù)的2/3,需要重新檢驗(yàn)；如果符合該要求的孔數(shù)大于等于原來孔數(shù)的 2/3,重新計(jì)算每一編號的有效試樣孔中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計(jì) 算全部編號試樣孔的總平均值，用于計(jì)算試樣中的生物素含量。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：用漩渦混 合器充分混合每一支試管。
8. 如權(quán)利要求7所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：充分混合 后還可加入一滴消泡劑。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：用 于測定嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素。
【文檔編號】G01N21/31GK104330288SQ201410331877
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】胡國華, 嚴(yán)婷 申請人:普研（上海）標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司