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鑒定anammox反應(yīng)器污泥中的anammox菌是否利用有機(jī)物的方法
【專(zhuān)利摘要】鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，它涉及一種鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中微生物是否利用有機(jī)物的方法。本發(fā)明提供一種不用富集高純度ANAMMOX菌，無(wú)需分離、鑒定、純化，不必純培養(yǎng)，便可以鑒定ANAMMOX反應(yīng)器中污泥內(nèi)的ANAMMOX菌是否可以利用有機(jī)物的方法。鑒定方法：一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的氨氮，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的有機(jī)物，然后厭氧氨氧化反應(yīng)；二、TEM觀察；三、制備導(dǎo)電樣品；四、根據(jù)NanoSIMS圖片進(jìn)行得出結(jié)果。本發(fā)明應(yīng)用于水處理及微生物領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】鑒定ANA圖OX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中微生物是否利用有機(jī)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著全球工業(yè)化、城市化的發(fā)展，人口的快速增長(zhǎng)，用水量大大增加，水資源的日益緊缺正威脅著人類(lèi)的生存與發(fā)展。我國(guó)是嚴(yán)重缺水國(guó)家之一，淡水量?jī)H占世界平均的1/4，并且已進(jìn)入水資源危機(jī)初期，同時(shí)水源地域分布的不平衡，使淡水短缺矛盾更加突出。更為嚴(yán)峻的問(wèn)題是我國(guó)水資源污染較嚴(yán)重，從一般污染物擴(kuò)展到有毒有害污染物，已經(jīng)形成了點(diǎn)源與面源共存，生活污染和工業(yè)排放疊加，各種新舊污染和二次污染相互復(fù)合的態(tài)勢(shì)。同時(shí)，城市人口的膨脹給有限的給水系統(tǒng)和排水設(shè)施造成巨大的壓力，污水處理設(shè)施總量不足，也導(dǎo)致一部分污水未經(jīng)處理直接排放到自然水體中。因此，控制和治理我國(guó)水環(huán)境污染成為迫切需要解決的問(wèn)題，除了需要控制污染，減少污染源外，更重要的是加快提高污水處理效率極其資源化程度。
[0003]根據(jù)《中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)》，2001年到2012年我國(guó)廢水排放總量逐年提高，從2001年的432.9億噸增加到684.6億噸(其中氨氮總排放量為253.6萬(wàn)噸，工業(yè)排放量為26.4萬(wàn)噸，生活排放量為144.7萬(wàn)噸)，其中生活污水所占比例逐年提高。生活污水是城市污水的主要組成部分，而且是氨氮污染物的主要來(lái)源。含氮污染物會(huì)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化；影響給水源水水質(zhì)，增加給水處理成本，而且化合態(tài)氮對(duì)人體和生物具有毒害作用。早在2003年，我國(guó)正式實(shí)施了《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》根據(jù)二級(jí)強(qiáng)化處理的技術(shù)水平，增加對(duì)總氮控制。2008年，國(guó)家環(huán)保部、國(guó)家質(zhì)監(jiān)總局先后出臺(tái)了 7個(gè)行業(yè)共計(jì)12個(gè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)。新標(biāo)準(zhǔn)新增了控制項(xiàng)目，分年限對(duì)各行業(yè)不同工藝制定了污染物控制項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)限值。水污染物也增加了總磷、總氮等基本項(xiàng)目。
[0004]隨著公眾環(huán)境意識(shí)的提高和國(guó)家對(duì)氮、磷排放限制標(biāo)準(zhǔn)的日趨嚴(yán)格，傳統(tǒng)污水生物處理工藝日益顯示出一些自身無(wú)法克服的缺點(diǎn)，例如流程長(zhǎng)，基建費(fèi)用高，操作麻煩；需要曝氣，能源消耗大；需要控制碳氮比，或投加額外碳源；釋放二氧化碳等等。因此，如何經(jīng)濟(jì)并有效地去除污水中的含N、P的化合物，有效地保護(hù)受納水體，進(jìn)而防治水體的富營(yíng)養(yǎng)化，成為迫切需要解決的問(wèn)題。
[0005]ANAMMOX (厭氧氨氧化)工藝是目前已知的最經(jīng)濟(jì)的生物脫氮技術(shù)，與傳統(tǒng)的硝化反硝化技術(shù)相比，ANAMMOX工藝具有能耗低、不消耗有機(jī)碳、剩余污泥量小、不釋放CO2等優(yōu)點(diǎn)，在生物脫氮領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0006]ANAMMOX菌是一種化能自養(yǎng)型細(xì)菌，以無(wú)機(jī)碳為碳源，之前認(rèn)為不能利用有機(jī)碳。由于受無(wú)機(jī)物氧化產(chǎn)生能量不足的制約，ANAMMOX微生物存在生長(zhǎng)緩慢、世代時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)胞得率低等諸多缺陷，導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致其實(shí)際應(yīng)用效率被限制。
[0007]如能證明ANAMMOX菌可利用有機(jī)物，則可以通過(guò)人為調(diào)節(jié)水體中有機(jī)物的方式大大縮短ANAMMOX微生物的生長(zhǎng)周期和世代，提高細(xì)胞得率和脫氮效果。但是研究ANAMMOX菌20余年，至今ANAMMOX污泥中的ANAMMOX微生物仍未獲得純培養(yǎng)，為生理生化研究造成了巨大的困難。雖經(jīng)研究人員的不懈努力、采用多種方法截至2011年一共從厭氧氨氧化反應(yīng)器污泥中分離、鑒定出了 8株ANAMMOX菌，但鑒定結(jié)果顯示這些ANAMMOX菌分屬于不同的種屬，而且分別出現(xiàn)在不同的ANAMMOX污泥中。由于ANAMMOX污泥的來(lái)源不同，組成ANAMMOX污泥的微生物也不同，所以不同ANAMMOX污泥的生理生化特點(diǎn)也不相同。盡管利用同位素示蹤技術(shù)已經(jīng)證明已知的ANAMMOX菌中某些特定菌株可以利用有機(jī)物，但是依靠分離、鑒定的方式無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)不同ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌研究的需要。
[0008]另有研究人員通過(guò)富集的手段對(duì)ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌的生理生化進(jìn)行研究，但富集的微生物中還包含有非ANAMMOX菌，因此其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到非ANAMMOX菌的干擾，而且富集過(guò)程中也可能導(dǎo)致微生物種群發(fā)生變化，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0009]由于ANAMMOX菌沒(méi)有獲得純培養(yǎng)，所以ANAMMOX菌利用有機(jī)物的研究都是建立在反應(yīng)器水平上的，作為一個(gè)混合培養(yǎng)體系，僅能證明有機(jī)物對(duì)ANAMMOX過(guò)程無(wú)影響，其結(jié)果均通過(guò)水體中物質(zhì)的濃度變化分析間接得出的，不能為ANAMMOX菌利用有機(jī)物提供直接證據(jù)；而且無(wú)法獲知利用有機(jī)物的是富集物中的哪種或哪些微生物。即使對(duì)污泥中的ANAMMOX菌富集培養(yǎng)并采用現(xiàn)有的同位素示蹤技術(shù)，由于未能實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，微生物中的干擾因素未能排除，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然缺乏可信度和說(shuō)服力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明要提供一種不用富集高純度ANAMMOX菌，無(wú)需分離、鑒定、純化，不必純培養(yǎng)，便可以鑒定ANAMMOX反應(yīng)器中污泥內(nèi)的ANAMMOX菌是否可以利用有機(jī)物的方法。
[0011]本發(fā)明鑒定方法按以下步驟進(jìn)行:
[0012]一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的游離態(tài)氨，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的有機(jī)物，然后厭氧氨氧化反應(yīng)10~100小時(shí)，之后終止反應(yīng)，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定`；
[0013]二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品，然后進(jìn)行TEM觀察；
[0014]三、根據(jù)步驟二 TEM觀察結(jié)果選擇目標(biāo)微生物分布均勻的位置，利用切片機(jī)切片成半薄切片，放置于導(dǎo)電硅片上，經(jīng)固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導(dǎo)電樣品；
[0015]四、利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描步驟三制備的導(dǎo)電樣品中的標(biāo)記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中有13C明顯富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌可以利用有機(jī)物；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中沒(méi)有13C富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌不能利用有機(jī)物。
[0016]本發(fā)明方法為反應(yīng)器內(nèi)污泥中的ANAMMOX菌是否可以利用有機(jī)物提供了直接證據(jù)。本發(fā)明方法不改變微生物的生存環(huán)境，保證了 ANAMMOX微生物的原有種群和豐度，不受反應(yīng)器的影響，并排除了非ANAMMOX菌的干擾，具有準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)；而且為ANAMMOX菌的后期研究和發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是【具體實(shí)施方式】十一中利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描15N的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區(qū)域?yàn)?5N標(biāo)記富集區(qū)域。[0018]圖2是【具體實(shí)施方式】十一中利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描13C的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區(qū)域?yàn)?3C標(biāo)記富集區(qū)域。
[0019]圖3是【具體實(shí)施方式】十二中利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描15N的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區(qū)域?yàn)?5N標(biāo)記富集區(qū)域。
[0020]圖4是【具體實(shí)施方式】十二中利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描13C的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區(qū)域?yàn)?3C標(biāo)記富集區(qū)域。
[0021]圖5是【具體實(shí)施方式】十二中利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描15N的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區(qū)域?yàn)?5N標(biāo)記富集區(qū)域。
[0022]圖6是【具體實(shí)施方式】十二中利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描13C的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色位點(diǎn)為13C標(biāo)記物。
[0023]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0024]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式鑒定方法按以下步驟進(jìn)行:
[0025]一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的游離態(tài)氨(15NH4+_N)，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的有機(jī)物，然后厭氧氨氧化反應(yīng)10?100小時(shí)，之后終止反應(yīng)，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0026]二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品(TEM樣品)，然后進(jìn)行TEM觀察；
[0027]三、根據(jù)步驟二 TEM觀察結(jié)果選擇目標(biāo)微生物分布均勻的位置，利用切片機(jī)切片成半薄切片，放置于導(dǎo)電硅片上，經(jīng)固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導(dǎo)電樣品；
[0028]四、利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描步驟三制備的導(dǎo)電樣品中的標(biāo)記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中有13C明顯富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌可以利用有機(jī)物；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中沒(méi)有13C富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌不能利用有機(jī)物。
[0029]本實(shí)施方式方法同時(shí)利用兩種穩(wěn)定性同位素進(jìn)行示蹤和鑒定。ANAMMOX反應(yīng)器污泥中能吸收利用游離態(tài)氨的無(wú)一例外均為ANAMMOX菌，因此NanoSIMS (納米二次離子質(zhì)譜技術(shù))圖片中15N標(biāo)記富集的區(qū)域顯示為ANAMMOX菌；而ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)只有有機(jī)物含有13C,所以15N標(biāo)記富集的區(qū)域中有13C明顯富集則直接證明ANAMMOX菌利用有機(jī)物。
[0030]本實(shí)施方式方法對(duì)任何來(lái)源的ANAMMOX反應(yīng)器污泥都適用，不受其他因素的干擾，具有準(zhǔn)確度高、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)。
[0031]用13C標(biāo)記不同的有機(jī)物然后分組進(jìn)行試驗(yàn)，可以快速得出上述有機(jī)物是否被此ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)ANAMMOX菌利用的直接證據(jù)，大大縮短了試驗(yàn)周期；而且相對(duì)于代謝產(chǎn)物的濃度分析，本實(shí)施方式方法的鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確和可信。
[0032]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一的不同點(diǎn)是:步驟二透射電子顯微鏡樣品按以下步驟制備:
[0033]A、從2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中取出樣品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%鋨酸固定液固定2?3小時(shí),而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15分鐘；再在4°C條件下用梯度濃度為50%、70%、90%、95%的乙醇溶液對(duì)樣品依次進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15分鐘；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分別脫水三次，每次15?20min，然后在室溫下放入濃度為100%的丙酮中脫水三次，每次15?20min ；
[0034]B、用純丙酮與包埋液的混合液對(duì)步驟A處理后的樣品室溫處理3?4小時(shí)，然后37°C下純包埋液包埋2?3小時(shí)、60°C固化5小時(shí)、再80°C固化24小時(shí)；
[0035]C、切片；
[0036]D、用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色切片，即完成透射電子顯微鏡樣品；
[0037]步驟A中乙醇丙酮混合液由濃度為90%的乙醇和濃度為90%的丙酮按1:1的體積比混合而成；
[0038]步驟B純丙酮與包埋液的混合液中純丙酮與包埋液的體積比為2:1。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
[0039]鋨酸固定液又稱(chēng)為四氧化鋨固定液。
[0040]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二的不同點(diǎn)是:步驟C中切片厚度為50?60nm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
[0041]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二或三的不同點(diǎn)是:步驟三中半薄切片的厚度為500?lOOOnm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二或三相同。
[0042]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二至四之一的不同點(diǎn)是:步驟三中導(dǎo)電硅片為噴金的玻璃片。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二至四之一相同。
[0043]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二至五之一的不同點(diǎn)是:步驟三中噴金覆蓋厚度為8?12nm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二至五之一相同。
[0044]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一的不同點(diǎn)是:步驟一中厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)間為10?50小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至六之一相同。
[0045]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至七之一的不同點(diǎn)是:步驟一中厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)間為15?30小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至七之一相同。
[0046]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至八之一的不同點(diǎn)是:步驟一中厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至八之一相同。
[0047]【具體實(shí)施方式】十:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至九之一的不同點(diǎn)是其特征在于步驟一中用13C標(biāo)記的有機(jī)物為甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至九之一相同。
[0048]【具體實(shí)施方式】十一:哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌是否可利用有機(jī)物按以下步驟進(jìn)行鑒定:
[0049]一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的氨氮(15NH4+-N，購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室CIL)，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的醋酸根(CH313C00_)，然后厭氧氨氧化反應(yīng)20小時(shí)，之后終止反應(yīng)，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0050]二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品(TEM樣品)，然后進(jìn)行TEM觀察；
[0051]三、根據(jù)步驟二 TEM觀察結(jié)果選擇目標(biāo)微生物分布均勻的位置，利用切片機(jī)切片成半薄切片，放置于導(dǎo)電硅片上，經(jīng)固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導(dǎo)電樣品；
[0052]四、利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描步驟三制備的導(dǎo)電樣品中的標(biāo)記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中有13C明顯富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌可以利用有機(jī)物；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中沒(méi)有13C富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌不能利用有機(jī)物；
[0053]其中，步驟三中半薄切片的厚度為800nm;
[0054]步驟三中導(dǎo)電硅片為噴金的玻璃片；
[0055]步驟三中噴金覆蓋厚度為IOnm ；
[0056]步驟二透射電子顯微鏡樣品按以下步驟制備:
[0057]A、從2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中取出樣品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%鋨酸固定液固定2.5小時(shí)，而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分鐘；再在4°C條件下用梯度濃度為50%、70%、90%、95%的乙醇溶液對(duì)樣品依次進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15分鐘；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分別脫水三次，每次15~20min，然后在室溫下放入濃度為100%的丙酮中脫水三次，每次15~20min ；
[0058]B、用純丙酮與包埋液的混合液對(duì)步驟A處理后的樣品室溫處理3.5小時(shí)，然后37°C下純包埋液包埋2.5小時(shí)、60°C固化5小時(shí)、再80°C固化24小時(shí)；
[0059]C、切片；
[0060]D、用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色切片，即完成透射電子顯微鏡樣品；
[0061 ] 步驟A中乙醇丙酮混合液由濃度為90%的乙醇和濃度為90%的丙酮按1:1的體積比混合而成；
[0062]步驟B純丙酮與包埋液 的混合液中純丙酮與包埋液的體積比為2:1;
[0063]其中步驟C中切片厚度為50nm。
[0064]本實(shí)施方式的NanoSMS圖片如圖1和圖2所示，根據(jù)圖1和圖2對(duì)比可以直觀清楚的看到在15N富集區(qū)域中有13C明顯富集，且富集量有所不同，說(shuō)明13C被ANAMMOX菌細(xì)胞吸收,表明本實(shí)施方式反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌可以利用有機(jī)物——醋酸。
[0065]【具體實(shí)施方式】十二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】十一的不同點(diǎn)是:
[0066]一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的氨氮(15NH4+-N，購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室CIL)，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的丙酸根(CH3CH213COO^購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室CIL)，然后厭氧氨氧化反應(yīng)25小時(shí)，之后終止反應(yīng)，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0067]其中步驟二 C中切片厚度為55nm。
[0068]本實(shí)施方式的NanoSMS圖片如圖3和圖4所示，根據(jù)圖3和圖4對(duì)比可以直觀清楚的看到在15N富集區(qū)域中有13C明顯富集，且富集量有所不同，說(shuō)明13C被ANAMMOX菌細(xì)胞吸收,表明本實(shí)施方式反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌可以利用有機(jī)物——丙酸。
[0069]【具體實(shí)施方式】十三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】十一的不同點(diǎn)是:
[0070]一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的氨氮(15NH4+-N，購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室CIL)，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的無(wú)機(jī)碳源(H13C03_，購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室CIL)，然后厭氧氨氧化反應(yīng)20小時(shí)，之后終止反應(yīng)，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0071]其中步驟二 C中切片厚度為60nm。
[0072]本實(shí)施方式的NanoSMS圖片如圖5和圖6所示，根據(jù)圖5和圖6對(duì)比可以直觀清楚的看到在15N富集區(qū)域中沒(méi)有形成比較明顯的13C富集，說(shuō)明本實(shí)施方式反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌通過(guò)厭氧乙酰輔酶A途徑固定二氧化碳，固碳速率較低。
[0073]通過(guò)具體實(shí)施十一至十三可以直接證明哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌具有異養(yǎng)特性，可以利用有機(jī)物CH313COCT 與 CH3CH213COO'
【權(quán)利要求】
1.鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ΑΝΑΜΜ0Χ菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于鑒定方法按以下步驟進(jìn)行: 一、用15N標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的游離態(tài)氨，用13C標(biāo)記ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)的有機(jī)物，然后厭氧氨氧化反應(yīng)10~100小時(shí)，之后終止反應(yīng)，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定； 二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品，然后進(jìn)行TEM觀察； 三、根據(jù)步驟二TEM觀察結(jié)果選擇目標(biāo)微生物分布均勻的位置，利用切片機(jī)切片成半薄切片，放置于導(dǎo)電硅片上，經(jīng)固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導(dǎo)電樣品； 四、利用納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)掃描步驟三制備的導(dǎo)電樣品中的標(biāo)記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中有13C明顯富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌可以利用有機(jī)物；若15N標(biāo)記富集的區(qū)域中沒(méi)有13C富集，則該反應(yīng)器內(nèi)的ANAMMOX菌不能利用有機(jī)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟二透射電子顯微鏡樣品按以下步驟制備: A、從2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中取出樣品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%鋨酸固定液固定2~3小時(shí),而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15分鐘；再在4°C條件下用梯度濃度為50%、70%、90%、95%的乙醇溶液對(duì)樣品依次進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15分鐘；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分別脫水三次，每次15~20min，然后在室溫下放入濃度為100%的丙酮中脫水三次，每次15~20min ； B、用純丙酮與包埋液的混`合液對(duì)步驟A處理后的樣品室溫處理3~4小時(shí)，然后37°C下純包埋液包埋2~3小時(shí)、60°C固化5小時(shí)、再80°C固化24小時(shí)； C、切片； D、用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色切片，即完成透射電子顯微鏡樣品； 步驟A中乙醇丙酮混合液由濃度為90%的乙醇和濃度為90%的丙酮按1:1的體積比混合而成； 步驟B純丙酮與包埋液的混合液中純丙酮與包埋液的體積比為2:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟C中切片厚度為50~60nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟三中半薄切片的厚度為500~lOOOnrn。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟三中導(dǎo)電硅片為噴金的玻璃片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟三中噴金覆蓋厚度為8~12nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟一中厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)間為10~50小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟一中厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)間為15~30小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟一中厭氧氨氧化反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的鑒定ANAMMOX反應(yīng)器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機(jī)物的方法，其特征在于步驟一中用13C標(biāo)記的有機(jī)物為甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103822963SQ201410101312
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】高大文, 黃曉麗, 叢巖 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)