一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特點(diǎn)是：制作方法包括將組織細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)沉淀、離心處理后，提取組織細(xì)胞標(biāo)本并加入一種環(huán)保型生物合成劑，經(jīng)超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐對(duì)組織細(xì)胞標(biāo)本同步進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是快速，無污染，操作簡(jiǎn)便，染色過程可與日常工作一并進(jìn)行，也可進(jìn)行分子病理檢測(cè)，且結(jié)果穩(wěn)定。提高了病理診斷的陽性檢出率及準(zhǔn)確率。
【專利說明】一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床病理診斷、科研領(lǐng)域中對(duì)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法，具體說一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]通過胸、腹水及淋巴液檢測(cè)腫瘤細(xì)胞是臨床病理診斷常用的檢測(cè)方法之一，目前采用較多的方法有涂片法、TCT、LCT等，其制作的細(xì)胞涂片分布均勻，形態(tài)清晰，陽性診斷率較高，但由于負(fù)載的腫瘤細(xì)胞少，可出現(xiàn)細(xì)胞成團(tuán)、重疊、擠壓等現(xiàn)象，同時(shí)也不能滿足后期的免疫組化的鑒別診斷。經(jīng)細(xì)胞蠟塊制作的切片細(xì)胞數(shù)量多，可連續(xù)切片，并可滿足免疫組化、分子病理檢測(cè)，滿足了臨床病理的需求。但常規(guī)制作時(shí)間需要3?5天，加上免疫組化時(shí)間往往需要5?7天才能拿到診斷報(bào)告。且在制作過程中因甲醛、二甲苯的揮發(fā)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒害。因此，目前的制作方法亟待改進(jìn)。
[0003]如何提供一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，具有制作時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，步驟少，結(jié)果穩(wěn)定，陽性檢出率及準(zhǔn)確率高，并減少污染環(huán)境。這是本發(fā)明面臨的技術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，具有制作時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，步驟少，不易出差錯(cuò)，結(jié)果穩(wěn)定，陽性檢出率及準(zhǔn)確率高，并減少環(huán)境污染。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，制作方法包括將組織細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)沉淀、離心處理后，提取組織細(xì)胞標(biāo)本并加入一種環(huán)保型生物合成劑，經(jīng)超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐對(duì)組織細(xì)胞標(biāo)本同步進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。
[0006]對(duì)上述技術(shù)方案的一種改進(jìn):所述的組織細(xì)胞標(biāo)本為胸腔積液或腹腔積液，所述提取組織細(xì)胞標(biāo)本的具體步驟如下:
(1)沉淀組織細(xì)胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液100?500ml放入干凈的器皿中，靜止1-2小時(shí)，使大量的胸腔積液或腹腔積液中的組織細(xì)胞自然沉降到器皿的底部；
(2)采集組織細(xì)胞:棄去上清液，將底層的沉淀50?IOOml置于多個(gè)容積為5ml的試管中離心，離心轉(zhuǎn)速為2000?2500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為5-10分鐘，將上清液棄去，最后將所述多個(gè)試管內(nèi)的組織細(xì)胞集中至一個(gè)試管中，直到獲得較多的組織細(xì)胞數(shù)量；
(3)凝固組織細(xì)胞:在最后沉淀組織細(xì)胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的組織細(xì)胞打散，再離心1-3分鐘，至少靜置15分鐘后將半凝固狀成團(tuán)的組織細(xì)胞放入紗布中包好，放入包埋盒中。
[0007]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):對(duì)于離心后組織細(xì)胞數(shù)量少的標(biāo)本:
(I)所述采集組織細(xì)胞步驟中，所述多個(gè)試管內(nèi)的組織細(xì)胞集中至一個(gè)試管的形狀為錐形的試管，使用錐形試管再次離心1-3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與組織細(xì)胞混合，使較少的組織細(xì)胞與蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細(xì)胞中加入無水酒精，1-3分鐘后取出半凝固狀的組織細(xì)胞放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將組織細(xì)胞包裹在內(nèi)，起支撐固定作用。
[0008]對(duì)上述技術(shù)方案的另一種改進(jìn):所述的組織細(xì)胞標(biāo)本為尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液，具體步驟如下:
(1)離心采集組織細(xì)胞:先將大量的尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種，用大型離心機(jī)分多次離心，棄去上清液，最后將沉淀物集中到一個(gè)試管內(nèi)離心，棄去上清液；淋巴液和細(xì)胞懸液因標(biāo)本總量較少，但細(xì)胞含量大，可直接放入試管中離心后棄去上清液；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種組織細(xì)胞內(nèi)加入熔點(diǎn)為45°C -52°C的5%瓊脂或5%蛋白，室溫下快速凝聚成團(tuán)狀，放入紗布中包好放入包埋盒中，起支撐作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種組織細(xì)胞內(nèi)加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性緩沖甲醛，至少靜置15分鐘后，將已凝固的組織細(xì)胞取出放人紗布中包好放入包埋盒中。
[0009]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述的固定步驟之前增加預(yù)固定步驟，預(yù)固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐中15分鐘；
所述固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細(xì)胞標(biāo)本繼續(xù)放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環(huán)保型生物合成劑，溫度45°C，時(shí)間12分鐘，共3次；
浸蠟時(shí)間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環(huán)保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時(shí)進(jìn)行，以達(dá)到石蠟浸入組織細(xì)胞的目的；
所述二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團(tuán)的組織細(xì)胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細(xì)胞蠟塊；如經(jīng)過初次包埋的組織細(xì)胞，可將組織細(xì)胞標(biāo)本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，已得到組織細(xì)胞數(shù)量的最大面積；
所述組織細(xì)胞切片步驟:將上述經(jīng)石蠟包埋的組織細(xì)胞蠟塊在組織切片機(jī)上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時(shí)間10?15分鐘；
所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(I)先將環(huán)保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘； (11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍(lán)；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I(xiàn)分鐘；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環(huán)保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環(huán)保型中性快干膠封片；
對(duì)部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細(xì)胞懸液制成的蠟塊，根據(jù)診斷需求進(jìn)行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環(huán)保透明脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復(fù)，按第一抗體選擇不同的修復(fù)液及修復(fù)方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體；
(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風(fēng)機(jī)吹干，經(jīng)環(huán)保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0010]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述環(huán)保型生物合成劑的主要成分為生物合成劑及脫水劑，由廣東省佛山市南海鈞鎰醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)。
[0011]對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述環(huán)保透明脫蠟液為無錫市江源實(shí)業(yè)技貿(mào)公司生產(chǎn)。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
本發(fā)明通過與普通離心涂片法、TCT法進(jìn)行比較，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞三者間無顯著差異，但本發(fā)明獲得的腫瘤細(xì)胞比上兩種方法更多，且可行免疫組織化學(xué)染色，必要時(shí)行分子病理檢測(cè)，提高了臨床病理診斷的準(zhǔn)確率。與其他細(xì)胞蠟塊制備方法比，染色結(jié)果無明顯差異，具有環(huán)保、時(shí)間短(一般僅需2天)，操作更簡(jiǎn)便，步驟更少，制作面更廣為優(yōu)勢(shì)，且不易出差錯(cuò)，經(jīng)臨床應(yīng)用結(jié)果穩(wěn)定。縮短了患者就診時(shí)間，提高了工作效率。切片染色背景清晰，與常規(guī)HE染色無差異，免疫組織化學(xué)定位準(zhǔn)確，提高了細(xì)胞學(xué)病理診斷的準(zhǔn)確率，特別是科研方面對(duì)養(yǎng)殖細(xì)胞爬片法無法行免疫組織化學(xué)染色提供良好的幫助。應(yīng)用環(huán)保型生物合成劑制作標(biāo)本減少了有害物質(zhì)如二甲苯等對(duì)工作環(huán)境及人體的危害?！揪唧w實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
本發(fā)明一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法的實(shí)施方式，制作方法包括將組織細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)沉淀、離心處理后，提取組織細(xì)胞標(biāo)本并加入一種環(huán)保型生物合成劑，經(jīng)超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐對(duì)組織細(xì)胞標(biāo)本同步進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。
[0014]實(shí)施例1:本發(fā)明一種胸腔積液或腹腔積液細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，具體步驟如下:
(1)沉淀細(xì)胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液IOOml放入干凈的器皿中，靜止I小時(shí)，使胸腔積液或腹腔積液中的細(xì)胞自然沉降到器皿的底部；
(2)采集組織細(xì)胞:棄去上清液，將底層的沉淀約50ml置于10個(gè)容積為5ml的試管中離心，離心轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為10分鐘，將上清液棄去，最后將所述10個(gè)試管內(nèi)的組織細(xì)胞集中至一個(gè)試管中，直到獲得較多的組織細(xì)胞數(shù)量；
(3)凝固組織細(xì)胞:在最后沉淀組織細(xì)胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的細(xì)胞打散，再離心3分鐘，靜置15分鐘后將半凝固狀成團(tuán)的細(xì)胞組織取出，入紗布中包好，放入包埋盒中。
[0015]對(duì)于離心后組織細(xì)胞數(shù)量少的標(biāo)本:
(1)所述采集組織細(xì)胞步驟中，所述10個(gè)試管離心后，將較少的組織細(xì)胞集中至一個(gè)形狀為錐形的試管內(nèi)，使用錐形試管再次離心3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與細(xì)胞混合，使較少的細(xì)胞與蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細(xì)胞中加入無水酒精，3分鐘后取出半凝固狀的細(xì)胞組織放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將細(xì)胞包裹在內(nèi)，起支撐固定作用。
[0016]在固定步驟之前增加預(yù)固定步驟，預(yù)固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐中15分鐘；
固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細(xì)胞標(biāo)本繼續(xù)放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環(huán)保型生物合成劑，溫度45°C，時(shí)間12分鐘，共3次；
浸蠟時(shí)間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環(huán)保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時(shí)進(jìn)行，以達(dá)到石蠟浸入組織細(xì)胞的目的。
[0017]二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團(tuán)的組織細(xì)胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細(xì)胞蠟塊；如經(jīng)過初次包埋的組織，可將組織細(xì)胞標(biāo)本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，以得到細(xì)胞數(shù)量的最大面積；
組織細(xì)胞切片步驟:將上述經(jīng)石蠟包埋的組織細(xì)胞蠟塊在組織切片 機(jī)上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時(shí)間10?15分鐘。
[0018]所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(I)先將環(huán)保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預(yù)熱； (2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘；
(11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍(lán)；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I(xiàn)分鐘；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環(huán)保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環(huán)保型中性快干膠封片。
[0019]對(duì)部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細(xì)胞懸液制成的蠟塊，根據(jù)診斷需求進(jìn)行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環(huán)保透明脫蠟液放入58°c恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復(fù)，按第一抗體選擇不同的修復(fù)液及修復(fù)方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體；
(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風(fēng)機(jī)吹干，經(jīng)環(huán)保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0020]實(shí)施例2:本發(fā)明一種胸腔積液或腹腔積液細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，具體步驟如下:
(I)沉淀細(xì)胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液500ml放入干凈的器皿中，靜止2小時(shí)，使大量的胸腔積液或腹腔積液中的細(xì)胞自然沉降到器皿的底部； (2)采集組織細(xì)胞:棄去上清液，將底層的沉淀IOOml置于10個(gè)容積為IOml的試管中離心，離心轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為5分鐘，將上清液棄去，最后將所述10個(gè)試管內(nèi)的組織細(xì)胞集中至一個(gè)試管中，直到獲得較多的組織細(xì)胞數(shù)量；
(3)凝固組織細(xì)胞:在最后沉淀組織細(xì)胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的細(xì)胞打散，再離心3分鐘，至少靜置15分鐘后將半凝固狀成團(tuán)的細(xì)胞組織放入紗布中包好，放入包埋盒中。
[0021]對(duì)于離心后組織細(xì)胞數(shù)量少的標(biāo)本:
(1)所述采集組織細(xì)胞步驟中，所述10個(gè)試管離心后，將較少的組織細(xì)胞集中至一個(gè)形狀為錐形的試管內(nèi)，使用錐形試管再次離心3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與細(xì)胞混合，使較少的細(xì)胞與蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細(xì)胞中加入無水酒精，3分鐘后取出半凝固狀的細(xì)胞組織放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將細(xì)胞包裹在內(nèi)，起支撐固定作用。
[0022]在固定步驟之前增加預(yù)固定步驟，預(yù)固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐中15分鐘；
固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細(xì)胞標(biāo)本繼續(xù)放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環(huán)保型生物合成劑，溫度45°C，時(shí)間12分鐘，共3次；
浸蠟時(shí)間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環(huán)保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時(shí)進(jìn)行，以達(dá)到石蠟浸入組織細(xì)胞的目的；
二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團(tuán)的組織細(xì)胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細(xì)胞蠟塊；如經(jīng)過初次包埋的組織，可將組織細(xì)胞標(biāo)本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，以得到細(xì)胞數(shù)量的最大面積；
組織細(xì)胞切片步驟:將上述經(jīng)石蠟包埋的組織細(xì)胞蠟塊在組織切片機(jī)上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時(shí)間10?15分鐘；
所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(1)先將環(huán)保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘；
(11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍(lán)；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I(xiàn)分鐘； (14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環(huán)保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環(huán)保型中性快干膠封片；
對(duì)部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細(xì)胞懸液制成的蠟塊，根據(jù)診斷需求進(jìn)行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環(huán)保型脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復(fù)，按第一抗體選擇不同的修復(fù)液及修復(fù)方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體；
(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風(fēng)機(jī)吹干，經(jīng)環(huán)保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0023]實(shí)施例3:本發(fā)明一種尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，具體步驟如下:
(1)離心采集組織細(xì)胞:先將大量的尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種，用50ml離心管多個(gè)，在大型離心機(jī)上離心，棄去上清液，最后將沉淀物集中到一個(gè)5ml試管內(nèi)再離心，棄去上清液；淋巴液和細(xì)胞懸液因標(biāo)本總量較少，但細(xì)胞含量大，可直接放入試管中離心后棄去上清液；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種組織細(xì)胞內(nèi)加入熔點(diǎn)為45°C -52°C的5%瓊脂，室溫下快速凝聚成團(tuán)狀，放入紗布中包好放入包埋盒中，起支撐作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種組織細(xì)胞內(nèi)加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性緩沖甲醛，至少靜置15分鐘后，將已凝固的細(xì)胞組織取出放人紗布中包好放入包埋盒中。
[0024]在固定步驟之前增加預(yù)固定步驟，預(yù)固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐中15分鐘；
固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細(xì)胞標(biāo)本繼續(xù)放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環(huán)保型生物合成劑，溫度45°C，時(shí)間12分鐘，共3次；
浸蠟時(shí)間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環(huán)保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時(shí)進(jìn)行，以達(dá)到石蠟浸入組織細(xì)胞的目的；
二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團(tuán)的組織細(xì)胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細(xì)胞蠟塊；如經(jīng)過初次包埋的組織，可將組織細(xì)胞標(biāo)本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，以得到細(xì)胞數(shù)量的最大面積；組織細(xì)胞切片步驟:將上述經(jīng)石蠟包埋的組織細(xì)胞蠟塊在組織切片機(jī)上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時(shí)間10?15分鐘；
所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(1)先將環(huán)保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘；
(11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍(lán)；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I(xiàn)分鐘；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環(huán)保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環(huán)保型中性快干膠封片；
對(duì)部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細(xì)胞懸液制成的蠟塊，根據(jù)診斷需求進(jìn)行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環(huán)保透明脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預(yù)熱；
(2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復(fù)，按第一抗體選擇不同的修復(fù)液及修復(fù)方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體； (15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風(fēng)機(jī)吹干，經(jīng)環(huán)保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0025]上述固定、脫水、透明、浸蠟工藝所用環(huán)保型生物合成劑由廣東省佛山市南海鈞鎰醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)，其主要成分為生物合成劑及脫水劑，不含甲醛和二甲苯，親水性和親脂性良好，無色無味，使用環(huán)保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時(shí)進(jìn)行。
[0026]上述環(huán)保透明脫蠟液為無錫市江源實(shí)業(yè)技貿(mào)公司生產(chǎn)。
[0027]當(dāng)然，上述說明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明并不限于上述舉例，本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，制作方法包括將組織細(xì)胞標(biāo)本經(jīng)沉淀、離心處理后，提取組織細(xì)胞標(biāo)本并加入一種環(huán)保型生物合成劑，經(jīng)超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐對(duì)組織細(xì)胞標(biāo)本同步進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。
2.按照權(quán)利要求1所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述的組織細(xì)胞標(biāo)本為胸腔積液或腹腔積液，所述提取組織細(xì)胞標(biāo)本的具體步驟如下: (1)沉淀組織細(xì)胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液100~500ml放入干凈的器皿中，靜止1-2小時(shí)，使大量的胸腔積液或腹腔積液中的組織細(xì)胞自然沉降到器皿的底部； (2)采集組織細(xì)胞:棄去上清液，將底層的沉淀50~100mL置于多個(gè)容積為5ml的試管中離心，離心轉(zhuǎn)速為2000~2500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為5-10分鐘，將上清液棄去，最后將所述多個(gè)試管內(nèi)的組織細(xì)胞集中至一個(gè)試管中，直到獲得較多的組織細(xì)胞數(shù)量； (3)凝固組織細(xì)胞:在最后沉淀組織細(xì)胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的組織細(xì)胞打散，再離心1-3分鐘，至少靜置15分鐘后將半凝固狀成團(tuán)的組織細(xì)胞放入紗布中包好，放入包埋盒中。
3.按照權(quán)利要求2所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，對(duì)于離心后組織細(xì)胞數(shù)量少的標(biāo)本: (1)所述采集組織細(xì)胞 步驟中，所述多個(gè)試管內(nèi)的組織細(xì)胞集中至一個(gè)試管的形狀為錐形的試管，使用錐形試管再次離心1-3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與組織細(xì)胞混合，使較少的組織細(xì)胞與蛋白相溶； (2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細(xì)胞中加入無水酒精，1-3分鐘后取出半凝固狀的組織細(xì)胞放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將組織細(xì)胞包裹在內(nèi)，起支撐固定作用。
4.按照權(quán)利要求1所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述的組織細(xì)胞標(biāo)本為尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液，具體步驟如下: (1)離心采集組織細(xì)胞:先將大量的尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種，用大型離心機(jī)分多次離心，棄去上清液，最后將沉淀物集中到一個(gè)試管內(nèi)離心，棄去上清液；淋巴液和細(xì)胞懸液因標(biāo)本總量較少，但細(xì)胞含量大，可直接放入試管中離心后棄去上清液； (2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種組織細(xì)胞內(nèi)加入熔點(diǎn)為45°C -52°C的5%瓊脂或5%蛋白，室溫下快速凝聚成團(tuán)狀，放入紗布中包好放入包埋盒中，起支撐作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細(xì)胞懸液中的一種組織細(xì)胞內(nèi)加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性緩沖甲醛，至少靜置15分鐘后，將已凝固的組織細(xì)胞取出放人紗布中包好放入包埋盒中。
5.按照權(quán)利要求3或4所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述的固定步驟之前增加預(yù)固定步驟，預(yù)固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫(yī)用微波爐中15分鐘； 所述固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細(xì)胞標(biāo)本繼續(xù)放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環(huán)保型生物合成劑，溫度45°C，時(shí)間12分鐘，共3次； 浸蠟時(shí)間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環(huán)保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時(shí)進(jìn)行，以達(dá)到石蠟浸入組織細(xì)胞的目的；所述二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團(tuán)的組織細(xì)胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細(xì)胞蠟塊；如經(jīng)過初次包埋的組織細(xì)胞，可將組織細(xì)胞標(biāo)本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，已得到組織細(xì)胞數(shù)量的最大面積； 所述組織細(xì)胞切片步驟:將上述經(jīng)石蠟包埋的組織細(xì)胞蠟塊在組織切片機(jī)上切成3~4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時(shí)間10~15分鐘； 所述染色包括HE染色和免疫組織化染色； 所述HE染色步驟如下: (1)先將環(huán)保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預(yù)熱； (2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘； (3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘； (4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘； (5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液2分鐘； (6)95%乙醇沖洗2分鐘； (7)80%乙醇沖洗2分鐘； (8)自來水沖洗2分鐘； (9)蘇木素染色5-10分鐘； (10)自來水沖洗2分鐘； (11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍(lán)； (12)自來水流水沖洗10分鐘； (13)1%伊紅染色I(xiàn)分鐘； (14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環(huán)保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次； (15)環(huán)保型中性快干膠封片； 對(duì)部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細(xì)胞懸液制成的蠟塊，根據(jù)診斷需求進(jìn)行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下: (1)切片前先將環(huán)保透明脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預(yù)熱； (2)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第一次脫蠟2分鐘； (3)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第二次脫蠟2分鐘； (4)將切片浸入環(huán)保透明脫蠟液中進(jìn)行第三次脫蠟2分鐘； (5)無水乙醇洗去環(huán)保透明脫蠟液； (6)95%乙醇沖洗2分鐘； (7)80%乙醇沖洗2分鐘； (8)自來水沖洗2分鐘； (9)蒸餾水I分鐘； (10)抗原修復(fù)，按第一抗體選擇不同的修復(fù)液及修復(fù)方式； (11)蒸餾水I分鐘，至少3次； (12)3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶； (13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次； (14)滴加第一抗體；(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次； (16)滴加第二抗體； (17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次； (18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘， (19)蘇木素淺染核后，吹風(fēng)機(jī)吹干，經(jīng)環(huán)保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
6.按照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環(huán)保型生物合成劑的主要成分為生物合成劑及脫水劑，由廣東省佛山市南海鈞鎰醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)。
7.按照權(quán)利要求5所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環(huán)保型生物合成劑的主要成分為生物合成劑及脫水劑，由廣東省佛山市南海鈞鎰醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)。
8.按照權(quán)利要求5所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環(huán)保透明脫蠟液為無錫市江源實(shí)業(yè)技貿(mào)公司生產(chǎn)。
9.按照權(quán)利要求7所述的組織細(xì)胞標(biāo)本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環(huán)保透明脫蠟液為無錫市 江源實(shí)業(yè)技貿(mào)公司生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】G01N1/36GK103940658SQ201410141939
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】趙潔, 付海洋 申請(qǐng)人:青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
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