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用液相層析-質譜法分析體液內的氨基酸的制作方法
【專利摘要】本公開提供了對從人類患者獲得的各種體液中的個體氨基酸進行定量的方法。也提供了各種體液內(例如血漿、尿、腦脊髓液和唾液)和各年齡組(例如，嬰兒、幼兒、兒童和成人)正常氨基酸水平的參考范圍。
【專利說明】用液相層析-質譜法分析體液內的氨基酸
[0001]本申請是分案申請，原申請的申請日為2008年6月27日、申請?zhí)枮?00880024878.1 (PCT/US2008/068653)、發(fā)明名稱為“用液相層析-質譜法分析體液內的氨基酸”。
發(fā)明領域
[0002]本發(fā)明一般涉及氨基酸，特別是包含在生物學流體內的氨基酸的檢測和分析。
[0003]背景
[0004]由于許多原因，患者體液(例如，血漿)內的氨基酸的身份和數(shù)量對于患者的健康是重要的。異常氨基酸水平能用于診斷疾病或病變。例如，低血漿氨基酸水平可以發(fā)生在患有癌癥、厭食癥、關節(jié)炎、毛囊炎、酗酒、胰高血糖素瘤和/或懷孕的患者體內。經(jīng)歷重壓或抑郁的患者也可以具有低的血漿氨基酸水平。特別地，抑郁患者可能缺乏苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸和/或牛磺酸。精神病患者可能具有低水平的氨基酸如甘氨酸、色氨酸和/或組氨酸，和升高水平的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和/或絲氨酸。
[0005]患有傳染病和/或發(fā)熱的患者也可以具有降低的氨基酸水平，盡管在這樣的患者體內的一些氨基酸如苯丙氨酸可以以升高水平存在。腎衰竭患者可以具有低水平的氨基酸如酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和/或組氨酸?；加锌肆_恩病(Crohn’ s disease)、潰瘍性結腸炎、慢性疲勞綜合征的患者血楽;中可以異常地具有低水平的胱氨酸和谷氨酰胺。
[0006]此外，高于正常的氨基酸水平也許是疾病狀態(tài)的指示。例如，升高的血漿氨基酸水平可以在患有肝臟疾病、胰腺炎、重金屬中毒、維生素C缺乏和/或維生素D缺乏的患者體內被觀察到。特別地，威爾遜病(wilson’s disease)患者可以顯示升高的色氨酸和組氨酸水平?；加袔炫d病(cushing’s disease)或痛風的患者可以顯示升高的丙氨酸水平。糖尿病患者可以顯示升高水平的纈氨酸、亮氨酸和/或異亮氨酸。多動兒童可以顯示升高水平的酪氨酸和苯丙氨酸。槭糖尿病(Maple Syrup Urine Disease)患者血衆(zhòng)中可以具有升高水平的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。因此，分析體液如血漿中的氨基酸的方法在醫(yī)學和科學情形(settings)中是有用的。
[0007]傳統(tǒng)上，氨基酸的分析方法已經(jīng)包括了衍生化步驟。在衍生化過程中，氨基酸與促進樣品中的氨基酸分析的衍生化試劑發(fā)生反應。衍生化試劑通常與樣品中氨基酸的游離氨基發(fā)生反應。用于衍生化氨基酸的常見試劑包括異硫氰酸酯(例如，苯基異硫氰酸酯(PITC))、鄰苯二醛(OPA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和N α - (2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(alainamide) (FDAA)。衍生化試劑是有用的，因為它們可以包括促進衍生化氨基酸的分析的取代基。例如，衍生化試劑可以包括用于UV-吸收檢測的生色團或用于熒光檢測的熒光團。
[0008]通過進行與質譜連接的層析如液相層析(LC)或氣相層析(GC)(即，LC-MS或GC-MS)，可以分離和檢測衍生化氨基酸。但是，氨基酸具有不同的化學結構(例如，堿性的、酸性的、芳香族的、極性的、非-極性的等)，并且由于可能存在于體液中的各種氨基酸在化學結構上的重大差異，這些化合物給分析者提出了解決LC-MS或GC-MS中衍生/分離的艱巨任務。
[0009]使用LC和MS檢測氨基酸的方法已經(jīng)被報導過，包括，例如，Casetta等人，"Development of a method for rapid quantificat1n of aminoacids by liquid chromatrography, tandem mass spectrometry"(LC-MSMS)in plasma"Clin Chem lab Med(2000)38:391-401 ;Hess 等人，"Acid hydrolysisof silk fibroins and determinat1n of the enrichment of isotopicalIylabeled amino acids using precolumn derivitizat1n and high performanceliquid chromatography-electrspray 1nizat1n mass spectrometry〃AnalB1chem(2002)311:19-26 ;Ji 等人，"Determinat1n of phenethyl isoth1cyanatein human plasma and urine by ammonia derivatizat1n and liquidchromatography-tandem mass spectrometry^AnaI B1chem(2003) 323:39-47 ；VanEijik 等人，"Determinat1n of amino acid isotope enrichment using liquidchromatography-mass spectrometry^(1999)Anal B1chem271:8-17 ;和 Liu 等人，^Derivitizat1n of amino acids with N,N-dimethyl-2, 4-dinitro-5-fluorobenzylamine for liquid chromatography/electrospray 1nizat1n mass spectrometry^(2004)Rapid Commun Mass Spectroml8:1059-65。檢測體液內氨基酸的改進方法是令人期望的。
[0010]發(fā)明概述
[0011]公開的是檢測可能存在于個體的體液內的各種個體氨基酸的方法。體液內的個體氨基酸的檢測可以用于確定體液是否包含異常的一個或多個氨基酸。一方面，該方法包括衍生化體液氨基酸，通過液相層析(LC)分離衍生化氨基酸，用質譜(MS)分析鑒定衍生化氨基酸，以及通過與來自一系列氨基酸標準物的結構上相近的氨基酸的比較來量化衍生化氨基酸。優(yōu)選地,MS不同于串聯(lián)MS，其包括，例如，單一 MS。結構上相似的氨基酸共有重要的結構特征如關鍵的官能團，以便使用質譜法鑒定一個氨基酸能夠以同樣的方法用于鑒定其它結構上相似的氨基酸。通過在處理之前添加一系列個體氨基酸標準物到體液中，該系列個體氨基酸標準物優(yōu)選地用作一系列內標。
[0012]適合的體液包括，例如，血漿、血清、唾液、尿液和腦脊髓液(CSF)。對于檢測、鑒定和/或量化血漿中個體氨基酸的方法，其水平可以與表1中提供的參考范圍相比較。落在表1的參考范圍之外的血漿氨基酸水平可以被鑒定為異常。對于檢測、鑒定和/或量化尿液中個體氨基酸的方法，其水平可以與表2中提供的參考范圍相比較。落在表2的參考范圍之外的尿液氨基酸水平可以被鑒定為異常。對于檢測、鑒定和/或量化CSF中個體氨基酸的方法，其水平可以與表3中提供的參考范圍相比較。處于表3的參考范圍之外的CSF氨基酸水平可以被鑒定為異常。對于檢測、鑒定和/或量化唾液中個體氨基酸的方法，其水平可以與表4中提供的參考范圍相比較。處于表4的參考范圍之外的唾液氨基酸水平可以被鑒定為異常。在一些實施方式中，每個氨基酸的參考范圍基于對象(即，嬰兒、幼兒、兒童或成人)的年齡而不同。
[0013]該系列標準物可以是非-衍生化的，并在衍生化之前添加到初始體液中或任何后處理步驟中。在優(yōu)選的實施方式中，該標準物包含個體氘化氨基酸(即，包含一個或多個氘離子的單個氨基酸)。該系列標準物也可以在衍生化步驟之后添加到體液氨基酸中。在這種情況下，添加的標準物應該以與體液氨基酸同樣的方式被衍生化。在一種方法中，該氨基酸用異硫氰酸酯(例如，苯基異硫氰酸酯(PITC))衍生化。在優(yōu)選的實施方式中，衍生化試劑是PITC。其它適合的衍生化試劑可以包括鄰苯二醛(OPA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和N α - (2，4- 二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(FDAA)。
[0014]每個來自一定量體液的鑒定的氨基酸的數(shù)量，能通過將其質譜信號與已知數(shù)量的結構相似的氨基酸的信號相比較來確定。然后體液中氨基酸的數(shù)量可以相對于分析的體液的體積表示，以獲得原始體液內氨基酸的濃度。定量分析優(yōu)選地用內標進行。
[0015]在一些實施方式中，在進一步分析之前，體液可以被處理以獲得具有濃縮的氨基酸濃度的部分。在一種方法中，獲得了體液的低分子量部分(例如，使體液通過分子量濾器獲得)。
[0016]在一個實施方式中，該方法可以用于檢測至少20個不同的個體氨基酸。在其它實施方式中，該方法可以用于檢測至少25、30、35或40個個體氨基酸。
[0017]例如，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述個體氨基酸包括但不限于:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸、磷酸乙醇胺(ΡΕΑ)、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、肌氨酸、?；撬帷⒓‰?、瓜氨酸、精氨酸、鵝肌肽、1-甲基-組氨酸、3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸(AAD)、蘇氨酸、丙氨酸、丙氨酸(BALA)、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸(GABA)、β -氨基-異丁酸(BAIB)、α -氨基-丁酸(AAB)、半胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、L-別-胱硫醚(胱硫醚-A)、L-胱硫醚(胱硫醚-B)、胱氨酸、異亮氨酸、別-異亮氨酸、亮氨酸、DL-羥賴氨酸(羥賴氨酸(I))、DL-別-羥賴氨酸(羥賴氨酸(2))、苯丙氨酸、鳥氨酸、色氨酸、高胱氨酸、精氨琥珀酸(ASA)、賴氨酸和Hawkinsin ((2-L-半胱氨酸-S-基-1，4- 二羥基環(huán)己-5-烯-1-基)-乙酸)。此外，基于任何檢測到的體液內個體氨基酸的水平，該方法可以用于診斷疾病狀態(tài)。
[0018]在一個實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:天冬氨酸、ASA、S-半胱氨酸、谷氨酸、OH-脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、PEA、AAD、甘氨酸、谷氨酰胺、肌氨酸、組氨酸、β -丙氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、肌肽、蘇氨酸、精氨酸、鵝肌肽、1-甲基-組氨酸、3-甲基-組氨酸、丙氨酸、GABA、ΒΑΙΒ、脯氨酸、乙醇胺、ΑΑΒ、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚Α、胱硫醚B、胱氨酸、異亮氨酸、別-異亮氨酸、亮氨酸、羥基-賴氨酸-1、羥基-賴氨酸_2、高胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。
[0019]在另一個實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:羥脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、肌氨酸、?；撬?、瓜氨酸、精氨酸、1，3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸、蘇氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、氨基-異丁酸、α-氨基-丁酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、L-胱硫醚、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、色氨酸、高胱氨酸和賴氨酸。
[0020]仍在另一個實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:羥脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、肌氨酸、?；撬?、瓜氨酸、精氨酸、1，3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸、蘇氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、氨基-異丁酸、α-氨基-丁酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、L-胱硫醚、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、色氨酸、高胱氨酸、賴氨酸、胱氨酸和羥賴氨酸。
[0021]仍在另一個實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:羥脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、肌氨酸、?；撬?、瓜氨酸、精氨酸、α-氨基-己二酸、蘇氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、脯氨酸、Y -氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、α -氨基-丁酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸、色氨酸、高胱氨酸和賴氨酸。
[0022]在一個實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、α-氨基-己二酸、丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、半胱氨酸、L-別-胱硫醚-A、L_胱硫醚、胱氨酸、別-異亮氨酸、DL-羥賴氨酸、DL-別-羥賴氨酸和高胱氨酸。
[0023]在另一個實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸、β -丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、半胱氨酸、L-別-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羥賴氨酸、DL-別-羥賴氨酸和高胱氨酸。在進一步的實施方式中，該方法可以用于鑒別半胱氨酸、磷酸絲氨酸或精氨琥珀酸中的任一種。
[0024]在進一步的實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸、β -丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、半胱氨酸、L-別-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、別-異亮氨酸、DL-羥賴氨酸、DL-別-羥賴氨酸和高胱氨酸。
[0025]在進一步的實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、L-別-胱硫醚-A、L_胱硫醚、胱氨酸、別-異亮氨酸、DL-羥賴氨酸、DL-別-羥賴氨酸和高胱氨酸。
[0026]在進一步的實施方式中，該方法可以用于檢測和/或量化個體氨基酸的任何組合，所述氨基酸包括但不限于:磷酸絲氨酸、半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、α-氨基-己二酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、L-別-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羥賴氨酸、DL-別-羥賴氨酸和高胱氨酸。
[0027]在其它實施方式中，該方法量化至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少七個、至少十個、至少十五個、至少二十個、至少二十五個或至少三十個或更多個個體氨基酸。
[0028]該公開的方法可以用作診斷或監(jiān)測對多種已知與異常個體氨基酸(S卩，除二肽和多肽之外的單個氨基酸)水平有關的疾病的治療效果的基礎。例如，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的水平可以用于診斷和/或監(jiān)控腎衰竭；胱氨酸和/或谷氨酰胺可以用于診斷和/或監(jiān)控克羅恩病、潰瘍性結腸炎和/或慢性疲勞綜合征；色氨酸和/或組氨酸可以用于診斷和/或監(jiān)控威爾遜?。槐彼峥梢杂糜谠\斷和/或監(jiān)控庫興病或痛風；纈氨酸、亮氨酸和/或異亮氨酸可以用于診斷和/或監(jiān)控糖尿病和/或槭糖尿??；酪氨酸和/或苯丙氨酸可以用于診斷和/或監(jiān)控機能允進失調(hyperactivity disorder);和hawkinsin可以用于診斷和/或監(jiān)控乙酸尿(霍金斯素尿癥，hawkinsinuria)。
[0029]可以用任何類型的、如商業(yè)上可得的LC系統(tǒng)來進行衍生化氨基酸的LC分離。適合的LC柱是具有包含微小顆粒(例如，具有直徑大約為2-5 μ m,優(yōu)選地大約為3 μ m的二氧化硅顆粒)的填裝材料的柱子。顆粒通常具有大約50到300埃，并且優(yōu)選地大約為150埃的孔。顆粒通常具有大約50-600m2/g的表面積，優(yōu)選地大約100m2/g的表面積。
[0030]顆粒可以包括連接在其表面的疏水固定相。在一個實施方式中，疏水固定相可以是燒基相，其可以包括C_4、C-8和C_18(優(yōu)選地是C-18)。
[0031]柱子可以具有任何適當?shù)某叽?。?yōu)選地，柱子具有的直徑大約為0.5毫米到大約5毫米，并且長度大約為15毫米到大約300毫米，并且最優(yōu)選地，直徑大約2毫米，長度大約50暈米。
[0032]衍生化氨基酸的LC分離也可以用疏水溶劑或梯度中包括疏水溶劑的溶劑混合物作為流動相來進行以洗脫氨基酸。在一個實施方式中，衍生化部分可以被施加到水性緩沖液(即，親水溶劑)中的柱子上，并且可以通過施加流動相到具有漸增數(shù)量的有機溶劑(即，疏水溶劑)的柱子中來洗脫氨基酸。例如，水性緩沖液可以包括(95%7jC，5%乙腈)，且可以通過逐漸增加流動相中乙腈的濃度到大約100%，從柱子上洗脫氨基酸。如果期望，流動相可以被加熱到溫度大約為40-60°C，優(yōu)選地大約為50°C。此外，流動相可以任選地包括一個或多個在LC和/或MS期間有用的額外試劑。例如，乙酸銨或乙酸。
[0033]衍生化氨基酸的MS分析可以通過樣品的電離來進行。適合的電離技術包括電噴霧電離(electrospray 1nizat1n) (ESI)、大氣壓化學電離(APCI)、光電離(photoinonizat1n)、電子電離、快速原子轟擊(FAB)/液相二次電離(liquid secondary1nizat1n) (LSIMS)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)、場電離、場解吸、熱噴霧/等離子噴鍍電離和粒子束電離。優(yōu)選地，使用ESI進行MS。進一步地，可以用陰離子或陽離子模式進行MS，優(yōu)選地是陰離子模式。
[0034]衍生化氨基酸的MS分析可以用幾種類型的離子分析器中的任一種進行，所述離子分析器包括四極分析器、離子阱分析器和時間飛行分析器。優(yōu)選地，可以使用四極分析器進行MS。可以通過使用包括選擇性離子檢測模式(SIM)和掃描模式在內的幾種檢測模式對MS期間產生的離子進行檢測。優(yōu)選地，用SM檢測離子。MS優(yōu)選地不是串聯(lián)MS。
[0035]也提供的是診斷個體內代謝失調——包括氨基酸代謝——的存在的方法。該方法包括通過下述步驟確定體液是否包含異常水平的一個或多個氨基酸:首先(a)衍生化體液氨基酸；(b)用液相層析(LC)分離衍生化氨基酸；(C)使用質譜儀，對分離的衍生化氨基酸進行質譜分析(MS);和(d)通過與來自一系列氨基酸標準物的結構相似的氨基酸相比照，使用MS分析來鑒定來自體液的衍生化氨基酸的量。該方法的各種實施方式與那些已經(jīng)討論過的相似。
[0036]附圖簡述
[0037]圖1是顯示用本文描述的方法檢測和量化的各種氨基酸的表。第三列顯示MT分子量”；第四列顯示PITC分子量；第五列顯示每種PITC衍生化氨基酸的分子量；第六列是LC保留時間；第七列顯示觀察到的質譜離子。
[0038]圖2顯示了包含指定氨基酸的單個樣品的在LC分離之前的MS分析結果。指出了每個氨基酸的離子尺寸特征。
[0039]優(yōu)選實施方式詳述
[0040]如本文所用的，“氨基酸”是指含有共價地連接氨基和酸基的α -碳原子的任何分子。酸基可以包括羧基?！鞍被帷笨梢园哂邢率街坏姆肿?
[0041]
【權利要求】
1.一種定量來自人個體的體液樣品中一種或多種游離氨基酸水平的方法，包含: (a)衍生化所述樣品內的一種或多種游離氨基酸； (b)通過液相層析法(LC)分離該一種或多種衍生化游離氨基酸；和 (c)用質譜法(MS)分析，定量來自步驟(b)的一種或多種衍生化游離氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種氨基酸包括選自下列的至少一種:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、磷酸乙醇胺、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、L-別-胱硫醚4、和DL-別-羥賴氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、天冬氨酸、肌氨酸、α -氨基-己二酸、β-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、氨基-異丁酸、半胱氨酸、L-胱硫醚、別-異亮氨酸、DL-羥賴氨酸、高胱氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、組氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和hawkinsin。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離氨基酸包括選自下列的至少一種:酪氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸和組氨酸。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離氨基酸包括選自下列的至少一種:胱氨酸和谷氨酰胺。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離氨基酸包括選自下列的至少一種:色氨酸和組氨酸。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離氨基酸包括丙氨酸。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離氨基酸包括選自下列的至少一種:酪氨酸和苯丙氨酸。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中至少一種游離氨基酸用苯基異硫氰酸酯(PITC)、鄰苯二醒(OPA)、2，4- 二硝基氟苯(DNFB)或Na (2, 4- 二硝基_5_氟苯基)_L_丙氨酰胺(FDAA)衍生化。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種游離氨基酸包括hawksinsin。
10.一種定量人個體體液內一種或多種游離氨基酸的方法，包括: (a)衍生化所述體液內的一種或多種游離氨基酸，其中所述一種或多種游離氨基酸包括選自下列的至少一種:磷酸絲氨酸、磺酸半胱氨酸、磷酸乙醇胺、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、L-別-胱硫醚-A和DL-別-羥賴氨酸；(b)通過液相層析法(LC)分離所述一種或多種衍生化游離氨基酸； (c)用質譜法(MS)分析，定量來自步驟(b)的所述一種或多種衍生化游離氨基酸。
11.一種定量人個體體液中一種或多種游離氨基酸水平的方法，所述方法包括: (a)衍生化所述體液內的一種或多種游離氨基酸，其中該一種或多種衍生化游離氨基酸包括選自下列的至少一種:磷酸絲氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羥脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鵝肌肽、1，3-甲基-組氨酸、α -氨基-己二酸、β -丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y -氨基-丁酸、β -氨基-異丁酸、半胱氨酸、L-別-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、別-異亮氨酸、DL-羥賴氨酸、DL-別-羥賴氨酸和高胱氨酸； (b)通過液相層析法(LC)分離所述一種或多種衍生化游離氨基酸； (c)使用質譜法(MS)分析，定量來自步驟(b)的所述一種或多種衍生化游離氨基酸。
12.—種定量人個體唾液或腦脊髓液內一種或多種游離氨基酸的方法，包括: (a)衍生化所述唾液或腦脊髓液內的一種或多種游離氨基酸；(b)通過液相層析法(LC)分離所述一種或多種衍生化游離氨基酸；和 (c)使用質譜法(MS)分析，定量來自步驟(b)的一種或多種衍生化游離氨基酸。
13.一種定量人個體唾液或腦脊髓液中一種或多種游離氨基酸水平的方法，包括: (a)衍生化所述唾液或腦脊髓液內的游離氨基酸； (b)通過液相層析法(LC)分離衍生化游離氨基酸；和 (c)使用質譜法(MS)分析 ，通過與一系列游離氨基酸標準物進行比較，來定量來自步驟(b)的一種或多種衍生化游離氨基酸。
14.根據(jù)權利要求1-13中任一項所述的方法，其中量化至少20種衍生化游離氨基酸。
15.根據(jù)權利要求1-13中任一項所述的方法，其中量化至少22種衍生化游離氨基酸。
【文檔編號】G01N30/02GK104076100SQ201410136266
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2008年6月27日 優(yōu)先權日:2007年6月29日
【發(fā)明者】S·戈爾德曼 申請人:奎斯特診斷投資公司