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納米等離子體激元共振器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供納米等離子體激元共振器(NPR)，其包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤,具有結(jié)合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子。NPR以高度重現(xiàn)性的方式將拉曼信號增強(qiáng)至6.1×1010倍，使得能夠在6pM(0.2ng/ml)的靈敏度下以3個(gè)數(shù)量級的動(dòng)態(tài)范圍實(shí)時(shí)地進(jìn)行蛋白酶和酶活性如前列腺特異性抗原(paPSA)的快速檢測。對來自paPSA-陽性細(xì)胞的細(xì)胞外液(ECF)的實(shí)驗(yàn)證明了在復(fù)雜的生物流體背景中的特異性檢測。這種方法提供了以非常小的樣品量檢測蛋白酶活性的快速、靈敏、精確且單步的手段。
【專利說明】納米等離子體激元共振器
[0001] 本申請是國際申請日為2008年11月3日、申請?zhí)枮?00880123805. 8、發(fā)明名稱 為"具有超高靈敏度的使用納米等離子體激元共振器的實(shí)時(shí)單步生物測定"的發(fā)明專利申 請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2007年11月2日提交的美國臨時(shí)專利申請No. 60/984, 859的優(yōu)先權(quán)， 其全部內(nèi)容引入本文作為參考。
[0004] 政府支持的聲明
[0005] 本工作得到以下支持：NSF Nano-scale Science and Engineering Center(DMI-0327077)、NSFSST/Collaborative Research Program(DMI-0427679)、和 NASA Institute for Cell Mimetic Space Exploration(CMISE),以 Award No. NCC2-1364 ； NHLBI/NIH HL078534 和 NCI/NIH R1CA95393-01;DARPA 和 UCSF Prostate Cancer SPORE award(NIH Grant P50CA89520和P01CA072006)，以Contract no. DE-AC02-05CH11231，由美 國會泛源部授予，在University of California/Lawrence Berkeley National Laboratory〇
[0006] 參考序列表
[0007] 紙張形式序列表的全部內(nèi)容引入本文作為參考，如附在說明書后一樣。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0008] 本發(fā)明涉及使用單獨(dú)的納米等離子體激元共振器（nanoplasmonic resonator)和 納米等離子體激元共振器陣列檢測酶活性的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)的領(lǐng)域。本發(fā)明具 體涉及蛋白酶活性，例如用于前列腺癌診斷應(yīng)用的前列腺特異性抗原（PSA)和蛋白水解活 性PSA的檢測。

【背景技術(shù)】
[0009] 最早在1928年開發(fā)的拉曼光譜已經(jīng)廣泛地用于表征分子性質(zhì)（Kazuo Nakamoto John R. Ferraro, Chris ff. Brown, Introductory Raman Spectroscopy,第二版（Elsevier Science，2003)。表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS)通過靠近表面的增強(qiáng)電磁場顯著提高拉 曼信號（C. R. Yonzon, C. L. Haynes, X. Zhang 等，Anal Chem76 (1)，78 (2004) ;Α· E. Grow, L. L. Wood, J.L.Claycomb 等，J Microbiol Methods53 (2) ,221 (2003) ;K.Nithipatikom，M. J. McCoy, S.R.Hawi 等，Anal Biochem322 (2) ,198(2003) J.B. Jackson 和 N.J.Halas，P Natl Acad Sci USA101 (52) ,17930 (2004))。在粗糙金屬表面或分散的金屬納米顆粒聚集 體上進(jìn)行的SERS測量顯示對于下至單個(gè)分子水平的檢測的高達(dá)10 14的最高拉曼增強(qiáng)因子 (Katrin Kneipp, Harald Kneipp, Irving Itzkan 等，Current Science (Bangalore) 77 (7) ，915(1999) ;S. Nie 和 S. R. Emory, Science275(5303), 1102(1997))，但是這些測量經(jīng)常遭 受差的重現(xiàn)性（M.Moskovits, Reviews of Modern Physics57 (3) ,783 (1985))。為了改善 重現(xiàn)性，已經(jīng)開發(fā)了其它方法以高達(dá)108的重現(xiàn)性增強(qiáng)因子在大面積上制造由同質(zhì)特征組 成的SERS基底，所述方法包括金屬膠體納米顆粒的自組裝（R. G. Freeman，K. C. Grabar，Κ. J. Allison 等，Science267 (5204)，1629 (1995))、納米球平版印刷術(shù)（lithography) (NSL)和納米球上的金屬膜（MFON) (C. L. Haynes 和 R. P. Van Duyne, Journal of Physical Chemistry B107 (30)，7426 (2003))、拋光的金基底的電化學(xué)糙化（J. M Sylvia, ΙΑ. Janni, J. D. Klein 等， Analytical Chemistry72 (23) ， 5834 (2000)) 和 使用電 子束平 版印刷術(shù)的周期結(jié)構(gòu)化的金屬基底（M. Kahl, E. Voges, S. Kostrewa等，Sensors and Actuators B-Chemical51 (1-3)，285 (1998))。雖然這些努力導(dǎo)致 SERS 分析成功用 于許多有前途的應(yīng)用中，但是缺少在特定位置制造 SERS熱點(diǎn)的能力限制了對于非常 小的樣品量的應(yīng)用，所述有前途的應(yīng)用包括基因和蛋白質(zhì)鑒別（Y. C. Cao, R. C. Jin，J. M.Nam 等，J Am Chem Socl25(48)，14676(2003) ;Y.W.C.Cao，R.C.Jin 和 C.A.Mirkin，S cience297 (5586) ,1536 (2002) ;T.Vo_Dinh，F(xiàn).Yan 和 M.B.Wabuyele，Journal of Raman Spectroscopy36 (6-7)，640 (2005))、生物戰(zhàn)劑檢測（D. A. Stuart, K. B. Biggs 和 R. P. Van Duyne, Analystl31 (4) ,568 (2006))和實(shí)時(shí)葡萄糖監(jiān)測（O.Lyandres，N.C. Shah, C. R. Yonzon 等，Analytical Chemistry77 (19)，6134 (2005))。
[0010] 為了克服這種限制，我們最近開發(fā)了可調(diào)的納米等離子體激元共振器（NPR)，其由 夾在引入本文作為參考的 Durant S.Su K, Steel M.J·，Xiong Y. Sun C, Zhang X，Journal of Physical Chemistry B110(9), 3964(2006)中所述的金屬納米盤之間的薄5;[02層組成。 可通過改變介電層厚度和NRP的縱橫比精確地調(diào)控共振頻率。在對于單獨(dú)的SERS基底或 納米顆粒所得的最大值之中，個(gè)別NPR可增加拉曼強(qiáng)度至6. 1 X 101°倍。使用已經(jīng)確立的 (well established)納米平版印刷術(shù)方法制造，基于NPR的方法使得能夠在所需位置以小 得多的尺度可重現(xiàn)地制造 SERS熱點(diǎn)，容許多重的（多路的，multiplexed)高通過量檢測和 芯片上的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
[0011] 前列腺癌生物標(biāo)記物前列腺特異性抗原（PSA)，一種激肽釋放酶（hK)家族絲氨 酸蛋白酶（S. R. Denmeade 和 J. T. Isaacs, BJU Int93Suppll, 10 (2004) ;J. A. Clements, N. M.Willemsen,S.A.Myers 等，Crit Rev Clin Lab Sci41(3), 265(2004))用作本申請中 的模型蛋白酶。通常使用的前列腺特異性抗原（PSA)血液測試已經(jīng)被廣泛地用于前列 腺癌（最主要的男性癌癥）的早期診斷和處理（H.Gronberg，Lancet361(9360)，859(200 3) ;S.R.Denmeade 和 J.T.Isaacs，Nat Rev Cancer2(5)，389(2002))。然而，血清 PSA 濃 度更經(jīng)常地反映良性前列腺增生（BPH)的存在，而不是癌癥（A.Caplan和A.Kratz，Am J Clin Patholll7Suppl，S104 (2002) ;Ε·Ι· Canto, S.F. Shariat 和 K.M.Slawin，Cu;rr Urol Rep5(3)，203(2004))。特異性的缺乏導(dǎo)致高的假陽性率并且經(jīng)常導(dǎo)致昂貴的 用于診斷的前列腺針吸活組織檢查和活組織檢查后的并發(fā)癥（complication))以及 相當(dāng)大的焦慮（M.B.Gretzer 和 A.W. Partin, Urol Clin North Am30 (4) ,677 (2003); A.Haese，M.Graefen，H.Huland 等，Curr Urol Rep5(3)，231(2004))。最近的研究已經(jīng) 鑒定了 一類高度特異性的肽，其可在異種移植模型（S. R. Denmeade, C. M. Jakobsen, S. Janssen等，J Natl Cancer Inst95 (13) ,990 (2003))和人類樣品（P.Wu，U.H.Stenman，M. Pakkala 等，Prostate58 (4) ,345 (2004) ;P.Wu，L.Zhu，U.H.Stenman 等，Clin Chem50(l)，125(2004))中被paPSA同種型（isoform)切割，因此，來自體內(nèi)樣品的paPSA 蛋白酶活性的測量是可能的，并且作為前列腺癌的更特異性的篩選劑（掩蔽劑，screening agent)和在復(fù)發(fā)性疾病的檢測中是潛在有價(jià)值的。然而，基于免疫肽分析（IMPA)的報(bào)道 結(jié)果顯示出低的熒光信噪比，妨礙在臨床上重要的60?300pM范圍內(nèi)較低的濃度下的可 靠測量（P. Wu, U. H. Stenman, M. Pakkala 等，Prostate58 (4)，345 (2004) ;P. Wu, L. Zhu，U. H. Stenman等，Clin Chem50(l)，125(2004))。此外，通常從細(xì)針吸活組織檢查或循環(huán)細(xì)胞 捕獲中分離有限數(shù)量的前列腺癌細(xì)胞（〈1000)。不存在對于臨床分期可以在少量細(xì)胞上進(jìn) 行paPSA蛋白酶活性測定的商業(yè)化方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供容許以非常少的 樣品量進(jìn)行用于前列腺癌檢測的paPSA的特異性和靈敏的測量的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供使用由納米等離子體激元共振器（NPR)組成的納米傳感器以至 少皮摩爾靈敏度在體外和原位檢測和測量酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物結(jié)合的 (bioconjugated) NPR增強(qiáng)在表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS)中的拉曼光譜強(qiáng)度并且使得能夠 以非常小的量靈敏地單步檢測酶活性。
[0013] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括納米等離子體激元共振SERS平臺的 納米傳感器。所述平臺包括特征在于單獨(dú)的或陣列形式的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)納米 等離子體激元共振器的基底，其中所述納米等離子體激元共振器（NPR)具有與其結(jié)合的生 物分子（biomolecule)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述NPR包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤， 具有結(jié)合或束縛（tether)到所述NPR表面的被標(biāo)記的生物分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所 述標(biāo)記物是拉曼活性標(biāo)記物。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述肽包 括可被特異性修飾或者通過酶切割的特異性序列。因此，這種肽結(jié)合的納米等離子體激元 共振器意圖用作特異性篩選工具以提供關(guān)于酶例如蛋白酶、激酶和肽酶的存在、濃度和活 性的信息。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選將測量在生物樣品中癌生物標(biāo)記例如前列腺特異性抗 原（PSA)的活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽應(yīng)為被待檢測的相應(yīng)酶特異性識別、修飾和/ 或發(fā)揮作用的底物。
[0015] 在另一實(shí)施方式中，實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測還提供關(guān)于酶活性的關(guān)鍵（臨界，critical)信 息，而不是僅測量蛋白質(zhì)的存在?？墒褂貌煌睦鼧?biāo)記物分子，使得可通過多重肽結(jié)合的 NPR進(jìn)行兩種或更多種類型酶的檢測。而且，在基底上的肽結(jié)合的NPR的陣列描述用于進(jìn)一 步放大或擴(kuò)展檢測。
[0016] 在另一實(shí)施方式中，彼此正交或者具有特異性的較小重疊的不同生物分子底物可 用于檢測相應(yīng)的酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子庫可與NPR結(jié)合并且以無規(guī)陣列或有序 的微陣列形式空間分離。生物分子-納米等離子體激元共振器的多重陣列可用于同時(shí)檢測 多種酶。
[0017] NPR也可通過激光或磁場操作以在空間上以高精確度尋址（address)，使得其可 多重化為高密度陣列（具有亞微升容量）。以微陣列或納米陣列形式的用于多種蛋白酶的 另外的空間多重化是預(yù)期的。另外，磁場或激光操縱性容許在所需的位置處生物傳感，這對 于在細(xì)胞內(nèi)得到原位測量是有用的。
[0018] 在另一實(shí)施方式中，本文中所述的納米傳感器可集成到微流體系統(tǒng)或其他芯片系 統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，基于納米傳感器的測定可以液相進(jìn)行，其中樣品與NPR納米傳感 器或NPR陣列接觸，和可進(jìn)行SERS測量。
[0019] 更具體地說，本發(fā)明涉及如下方面。
[0020] 1.納米等離子體激元共振器（NPR)，包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤，具有結(jié) 合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子。
[0021] 2.根據(jù)1的共振器，其中所述標(biāo)記物是用于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)檢測的拉曼 活性標(biāo)記物。
[0022] 3.根據(jù)1的共振器，其中所述標(biāo)記物是熒光或其它能檢測的標(biāo)記物。
[0023] 4.根據(jù)1的共振器，其中所述納米盤包括金屬薄層、半導(dǎo)體材料、金屬多層、金屬 氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料。
[0024] 5.根據(jù)4的共振器，其中所述納米盤由金屬組成。
[0025] 6.根據(jù)1的共振器，其中所述屏蔽層包括具有恒定拉曼光譜的材料。
[0026] 7.根據(jù)6的共振器，其中所述屏蔽層選自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
[0027] 8.根據(jù)1的共振器，其中所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
[0028] 9.根據(jù)1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID N0:1)。
[0029] 10.納米等離子體激元共振SERS檢測平臺，包括特征在于單獨(dú)的或陣列形式的表 面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)納米等離子體激元共振器（NPR)的圖案化基底，其中所述納米等離 子體激元共振器具有與其結(jié)合的生物分子。
[0030] 11.根據(jù)10的平臺，其中其上圖案化所述納米等離子體激元共振器的基底可由石 英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光譜的任意其它材料組成。
[0031] 12.根據(jù)10的平臺，其中所述納米等離子體激元共振器包括具有交替屏蔽層的金 屬納米盤，具有結(jié)合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子， 其中所述標(biāo)記物是用于SERS檢測的拉曼活性標(biāo)記物。
[0032] 13.根據(jù)12的平臺，其中所述納米盤包括金或銀的薄層。
[0033] 14.根據(jù)12的平臺，其中所述屏蔽層包括二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、或右旋 糖酐。
[0034] 15.根據(jù)10的平臺，其中所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
[0035] 16.根據(jù)10的平臺，其中所述陣列形式的納米等離子體激元共振器是相同或不同 的。
[0036] 17.根據(jù)15的方法，其中生物分子庫與所述納米等離子體激元共振器結(jié)合并且以 無規(guī)陣列或有序的微陣列形式空間分離。
[0037] 20.用于使用納米傳感器以至少皮摩爾靈敏度體外檢測和測量酶活性的方法，所 述納米傳感器包括納米等離子體激元共振器（NPR)，其中所述NPR增強(qiáng)在表面增強(qiáng)拉曼光 譜學(xué)（SERS)中的拉曼光譜強(qiáng)度并且使得能夠以非常小的量靈敏地單步檢測酶活性。
[0038] 21.用于酶活性的實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測的方法，包括：
[0039] (a)提供在基底上圖案化的肽結(jié)合的納米等離子體激元共振器陣列，其中各納米 等離子體激元共振器（NPR)包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤并且具有結(jié)合或束縛到所 述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子，其中所述標(biāo)記物是拉曼標(biāo)記物 分子，各自相同或不同，和其中各個(gè)肽包括通過特異性酶使用特異性反應(yīng)識別和修飾的序 列；
[0040] (b)提供懷疑含有酶的生物樣品；
[0041] (c)使所述樣品與所述納米等離子體激元共振器陣列接觸；
[0042] ⑷使所述反應(yīng)進(jìn)行；
[0043] (e)通過SERS檢測測量所述酶的檢測。
[0044] 22.根據(jù)21的方法，其中生物分子庫可與所述納米等離子體激元共振器結(jié)合并且 以無規(guī)陣列或有序的微陣列形式空間分離。
[0045] 23.根據(jù)22的方法，其中所述生物分子-納米等離子體激元共振器的陣列可用于 同時(shí)檢測多種酶的活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1 :使用肽結(jié)合的NPR SERS納米傳感器檢測PSA蛋白酶活性的工作原理的示意 性圖解。（a)NPR通過耦合的等離子體激元共振呈現(xiàn)出可調(diào)的等離子體激元共振和高度增強(qiáng) 的局部電磁場。短軸150nm和長軸200nm的NPR由厚度分別為25nm和5nm的銀和Si0 2層的 多重疊層制成。（b)由拉曼染料R19、PSA特異性肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID N0:1)和半胱 氨酸組成的生物標(biāo)記的分子結(jié)構(gòu)。所述肽可通過PSA酶在HSSKLQ和LAAAC之間切割。（c) 用肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO: 1)和拉曼染料R19 (星）官能化的NPR的檢測圖。PSA 酶的存在將切割所述肽序列。切割之后，通過R19部分的SERS標(biāo)志（signature)的消失監(jiān) 測R19(星）離開表面的擴(kuò)散。填充分子辛烷硫醇（HS-(CH 2)2-CH3)用于減小NPR表面上的 報(bào)告肽的填充密度，由此容許PSA酶達(dá)到所述報(bào)告肽。（d)使用標(biāo)準(zhǔn)電子束平版印刷術(shù)和薄 膜沉積方法制造的NPR陣列的光學(xué)顯微圖像。制造的NPR陣列由間隔500nm的30 X 30NPR 組成?？稍谙嗤幕咨媳憷刂圃於鄠€(gè)NPR陣列和對準(zhǔn)標(biāo)記。（e)通過掃描電子顯微鏡 測量的NPR陣列的放大圖像。使用精確平版印刷術(shù)方法，可以受控的方式制備NPR。（f)使 用原子力顯微鏡（AFM)在較高的放大率下測量的NPR圖像。（g)在425?650nm的波長范 圍內(nèi)所測量的NPR陣列的消光光譜。已調(diào)節(jié)NPR的共振峰以緊密匹配激光激發(fā)和拉曼發(fā)射 頻率，并由此使拉曼信號的總體增強(qiáng)最大化。（h)在不同的NPR陣列上測量的結(jié)合在NPR表 面上的對巰基苯胺（PMA)分子的高度重現(xiàn)性拉曼光譜。積分時(shí)間為30秒。
[0047] 圖2 :PSA蛋白酶活性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測量。（a)對于在30分鐘內(nèi)所取的6nMPSA培養(yǎng) 的SERS光譜，積分時(shí)間為30秒。（b)對于在30分鐘內(nèi)所取的陰性對照6nM粒酶B的SERS 光譜。（c)添加 PSA蛋白酶之前和之后在131601^145601^1526(^1和1597CHT1處的拉曼 峰強(qiáng)度的相對變化的時(shí)間分辨的測量。負(fù)時(shí)間表示添加蛋白酶之前的時(shí)間。
[0048] 圖3 :通過改變活性PSA濃度的PSA活性的時(shí)間分辨的測量。（a)對于1316(^1峰 在6pM?6nM的活性PSA濃度下的歸一化的SERS強(qiáng)度變化。可清楚地測量SERS強(qiáng)度的降 低，而在不含活性PSA蛋白酶的對照實(shí)驗(yàn)中不能觀察到顯著的改變。（b) 30分鐘時(shí)獲得的 歸一化SERS強(qiáng)度變化與濃度的關(guān)系。（c)從未處理的細(xì)胞外流體（ECF)中獲得的蛋白酶 活性測量結(jié)果：在將LNCaP細(xì)胞（陽性對照）ECF暴露于NPR納米傳感器開始時(shí)（t = 0分 鐘）和30分鐘之后所得的拉曼光譜。（d)在1316CHT1峰處的歸一化的SERS強(qiáng)度變化，表 示從LNCaP和K562細(xì)胞系中提取的流體中PSA蛋白水解活性。
[0049] 圖4 :使用拉曼檢測和光譜學(xué)的PSA檢測圖。
[0050] 圖5A :SERS顯微光譜學(xué)系統(tǒng)以及納米等離子體激元共振器目測和實(shí)時(shí)酶反應(yīng)檢 測。圖5B:光譜測量設(shè)備的示意圖。
[0051] 圖6(a)具有各個(gè)金屬層的單獨(dú)納米盤的模擬散射光譜。所述納米盤是圓形的，直 徑為90nm，而金屬層和Si0 2層的總厚度均保持為30nm。入射光的偏振在Y-軸方向偏振。 (b)共振頻率下單獨(dú)Au層納米盤（Si02/Au/Si0 2)的局部電場分布的Y-Z面橫截面。（c)共 振頻率下6Au層納米盤（Si02/Au) 6/Si02的局部電場分布的Y-Z面橫截面。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 本發(fā)明證明使用由納米等離子體激元共振器（NPR)組成的納米傳感器以至少皮 摩爾靈敏度在體外檢測和測量酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物結(jié)合的NPR增強(qiáng)表面增 強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS)中的拉曼光譜強(qiáng)度并且使得能夠以非常小的量靈敏地單步檢測酶活 性。
[0053] 小量性質(zhì)的主要優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用之一是其在單細(xì)胞水平上檢測癌細(xì)胞的蛋白酶例如 前列腺特異性抗原（PSA)的活性中是有用的。小量的要求和靈敏度水平使得可能在捕獲的 循環(huán)前列腺癌細(xì)胞中檢測PSA活性用于指示各種疾病狀態(tài)例如轉(zhuǎn)移，這是使用常規(guī)技術(shù)不 可行的。在精液中，PSA濃度為10?150 μ M，大約三分之二的PSA是酶活性的。使用NPR PSA探針實(shí)現(xiàn)的靈敏度水平（納摩爾范圍）足以進(jìn)行基于精液的測定，因此本文所述的納米 等離子體激元共振SERS平臺意圖具有臨床應(yīng)用。
[0054] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括納米等離子體激元共振SERS平臺的納米 傳感器。所述平臺包括特征在于單獨(dú)的或陣列形式的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)納米等離 子體激元共振器的基底，其中所述納米等離子體激元共振器（NPR)具有與其結(jié)合的生物分 子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述NPR包括至少兩個(gè)具有交替薄屏蔽層的納米盤，和結(jié)合或束縛 到所述NPR的表面的被標(biāo)記的生物分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物是拉曼活性標(biāo) 記物。
[0055] 現(xiàn)有技術(shù)中已知潛在用于拉曼光譜學(xué)的各種檢測裝置并且可使用任意已知的拉 曼檢測裝置。拉曼檢測裝置的非限制性實(shí)例公開在美國專利No. 6, 002, 471中。在該實(shí)例 中，通過532nm (納米）波長的Nd: YAG激光或者365nm波長的Ti :藍(lán)寶石激光產(chǎn)生激發(fā)束。 可使用脈沖激光束或連續(xù)激光束。激發(fā)束通過共焦光學(xué)器件和顯微鏡物鏡，并且可聚焦在 含有連接的生物分子目標(biāo)物的基底上。可通過顯微鏡物鏡和共焦光學(xué)器件收集拉曼發(fā)射光 目標(biāo)，其耦合至用于光譜分離的單色器。所述共焦光學(xué)器件可包括用于減少背景信號的反 射鏡、二向色性濾光器、屏障濾光片、共焦針孔、和透鏡的組合。標(biāo)準(zhǔn)全場光學(xué)器件也可用作 共焦光學(xué)器件。
[0056] 可通過拉曼檢測器檢測拉曼發(fā)射信號。所述檢測器可包括與用于計(jì)算和數(shù)字化信 號的計(jì)算機(jī)接口的雪崩光電二極管。在待分析目標(biāo)陣列時(shí)，可設(shè)計(jì)光學(xué)檢測系統(tǒng)以檢測拉 曼信號和將拉曼信號定位到芯片或格子上的特定位置。例如，發(fā)射光可引導(dǎo)到CCD(電荷耦 合器件）照相機(jī)或在檢測區(qū)域內(nèi)能夠同時(shí)測量來自20個(gè)多重像素或像素組的光發(fā)射的其 它檢測器。
[0057] 各種激發(fā)源包括，但不限于，337nm的氮激光器（Laser Science Inc.)和325nm的 氦-鎘激光器（Liconox)(美國專利No. 6, 174, 677)。激發(fā)束可使用帶通濾光器30(Corion) 光譜純化并且可使用6 X物鏡（Newport，Model L6X)聚焦在基底140上。物鏡可用于激發(fā) 指示器和收集拉曼信號兩者，通過使用全息分束器（Kaiser Optical Systems, Inc.，Model HB647-26NI8)產(chǎn)生用于激發(fā)束和發(fā)射的拉曼信號的直角幾何形狀。全息陷波濾波器 (Kaiser Optical Systems, Inc.)可用于減小瑞利散射福射。供選擇的拉曼檢測器包括， 但不限于，配置有紅色增強(qiáng)強(qiáng)化電荷耦合器件（RE-ICXD)檢測系統(tǒng)的ISA HR-320攝譜儀 (Princeton Instruments)。可使用其它類型的檢測器，例如電荷注射器件、光電二極管陣 列或光電晶體管陣列。
[0058] 現(xiàn)在參考圖1A，NPR的納米級尺寸和高的局部電磁場增強(qiáng)使得能夠在其表面上高 靈敏度地光學(xué)檢測生物分子反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述納米等離子體激元共振器是 包括通過屏蔽層分離的至少兩個(gè)垂直堆疊的納米盤的平版印刷限定的金屬電介質(zhì)納米顆 粒。在各種實(shí)施方式中，NPR優(yōu)選通過電子束平版印刷術(shù)在基底上圖案化。
[0059] 其上NPR圖案化的基底可由石英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光譜 的任意其它材料組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，為了防止電子束平版印刷術(shù)期間的帶電效應(yīng)，所 述基底進(jìn)一步涂布有層例如氧化銦錫。所述層可濺射、沉積、涂布或使用任意其它方法添加 到所述基底上以形成薄膜。在另一實(shí)施方式中，然后用聚合物旋涂所述基底以在曝光以產(chǎn) 生圖案之前產(chǎn)生正性光刻膠。在一個(gè)實(shí)施方式中，在曝光之后，使用溶劑混合物顯影圖案， 隨后進(jìn)行多層電子束蒸發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)的剝離過程。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方式中，如實(shí)施例1所述制備NPR。在另一實(shí)施方式中，如以下所述制 備 NPR :Κ· H. Su, Q. H. Wei 和 X. Zhang, ''Tunable and augmented plasmon resonances of Au/Si02/Au nanodisks"，Appl. Phys. Lett. 88, 063118, 2006 ;以及 Kai-Hung Su，St6phane Durant, Jennifer M. Steele, Yi Xiong, Cheng Sun 和 Xiang Zhang, Raman Enhancement Factor of a Single Tunable Nanoplasmonic Resonator, Journal of Physical Chemistry B，110 (9)，3964 (2006)，這兩者的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
[0061] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述納米等離子體激元共振器由層疊或堆疊有交替屏蔽層 的納米盤組成。例如，可在兩個(gè)金納米盤之間夾入Si0 2屏蔽層制備NPR。在另一實(shí)施方式 中，其間夾有Si02屏蔽層的兩個(gè)金納米盤在一端用另一 Si02屏蔽層覆蓋，從而產(chǎn)生Si02/ Au/Si02/Au納米等離子體激元共振器。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在圖案化基底上蒸發(fā)納米級層以形成NPR的納米盤層。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中，各納米盤在其最寬點(diǎn)處為50?500nm。所述納米盤可由金屬薄層、半導(dǎo)體 材料、金屬多層、金屬氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料組成。在一些實(shí)施方式中，納米月 牙狀物（nanocrescent)包括選自 Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、 V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo 的金屬、及其氧化物、和 /或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結(jié)基質(zhì)。
[0063] 屏蔽層材料可為具有恒定拉曼光譜的任意材料。所述屏蔽層起到NPR的等離子體 激元共振頻率的調(diào)節(jié)參數(shù)的作用。與單層金屬納米盤相比，多層納米盤呈現(xiàn)出若干獨(dú)特的 性質(zhì)，包括顯著增強(qiáng)的等離子體激元共振和可調(diào)的共振波長，所述共振波長可通過簡單地 改變電介質(zhì)層厚度而修整到所需值同時(shí)保持顆粒直徑恒定。數(shù)值計(jì)算表明將一個(gè)金屬層分 為金屬多層導(dǎo)致較高的散射強(qiáng)度和更多的"熱點(diǎn)"或者強(qiáng)場增強(qiáng)區(qū)域。圖6顯示具有各個(gè) 金屬層的納米盤的顏色模擬散射光譜。
[0064] 因此，在另一實(shí)施方式中，NPR中各納米盤層可具有相同或不同的厚度。通過選擇 不同的層厚度，可以調(diào)節(jié)等離子體激元共振波長和表面增強(qiáng)因子以匹配各種應(yīng)用。例如，在 實(shí)施例1中，短軸150nm和長軸200nm的NPR由厚度分別為25nm和5nm的銀和Si02層的多 重疊層制成。而且，通過選擇性地屏蔽金屬結(jié)構(gòu)的外表面，可通過將分子集合體（assembly) 導(dǎo)向呈現(xiàn)出強(qiáng)電磁場的位置來進(jìn)一步增強(qiáng)效率。因此，在另一實(shí)施方式中，所述外層為包括 具有恒定拉曼光譜的材料的屏蔽層。圖1A顯示優(yōu)選納米等離子體激元共振器（NPR)的示 意圖和透射電子顯微照片。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物分子是包括可通過蛋白酶特異性切割的特異性序列 的肽，其與拉曼活性標(biāo)記物連接。
[0066] 現(xiàn)有技術(shù)中已知各種拉曼標(biāo)記（例如，美國專利No. 5, 306, 403 ;6, 002, 471 ; 6, 174, 677,其引入本文作為參考）并且可使用任意這種已知的拉曼標(biāo)記。所述標(biāo)記典型 地具有特有的（例如，獨(dú)特的）和高度可見/可檢測的光學(xué)標(biāo)志。合適的拉曼標(biāo)記包括， 但不限于，熒光團(tuán)、生色團(tuán)、量子點(diǎn)、熒光微球、生物素等。在一些實(shí)施方式中，所述拉曼標(biāo) 記包括若丹明、熒光素、或外源化學(xué)分子。在一些實(shí)施方式中，所述拉曼標(biāo)記包括作為拉曼 標(biāo)記物的部分。標(biāo)記物分子的非限制性實(shí)例包括TRIT(四甲基若丹明異硫醇）、NBC(7-硝 基苯-2-氧雜-1，3-二唑）、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲 酚固紫、甲酚藍(lán)紫、燦爛甲酚藍(lán)、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、異羥洋地黃毒苷、5-羧 基-4'，5' -二氯-2'，7'-二甲氧基突光素、5-羧基-2'，4'，5'，7'四氯突光素、5-羧基突 光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-10羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-若丹明、偶氮 甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨吖啶、和氰化物（CN)、硫醇（SH)、氯（el)、溴（Br)、甲 基、磷（P)、硫⑶、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有這些部分的化合物。在一些實(shí)施方式中，碳 納米管、量子點(diǎn)（參見，例如 Evident Technologies, Troy N.Y. ;Invitrogen/Molecular Probes, 15等）或者微球（例如突光微球（參見，例如來自InvitrogenIMolecular Probes 的Transfluosphres*)可用作拉曼標(biāo)記物。
[0067] 在各種實(shí)施方式中，一種或多種拉曼標(biāo)記（拉曼標(biāo)記物）可以與附著到NPR的生 物分子（例如，多肽）連接。這種拉曼標(biāo)記物的存在可以增強(qiáng)通過切割肽產(chǎn)生的拉曼信號 的變化。
[0068] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，這種拉曼標(biāo)記的生物分子結(jié)合的納米等離子體激元 共振器意圖用作特異性篩選工具以提供關(guān)于生物樣品中酶和其它癌生物標(biāo)記例如前列 腺-特異性抗原（PSA)的存在、濃度和酶活性的信息。在一些實(shí)施方式中，所述生物分子是 肽。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。所述 術(shù)語應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨 基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在一些實(shí)施方 式中，多個(gè)肽與納米月牙的表面結(jié)合，各自相同或不同。在各種實(shí)施方式中，約5?500,更 優(yōu)選約10?約400,還更優(yōu)選約20、30或40?約200、250或300,和最優(yōu)選約50?約150 個(gè)底物分子（例如肽）與納米月牙狀物連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，約100個(gè)肽以Au與肽上 的硫醇基團(tuán)之間的直接反應(yīng)15結(jié)合至納米月牙狀物。
[0069] 其活性受到監(jiān)測的酶可以包括，但不限于，酶、蛋白酶、激酶、肽酶或其它生物分 子。在各種實(shí)施方式中，所述生物分子是被待檢測的相應(yīng)酶特異性識別和修飾或切割的肽。 在另一實(shí)施方式中，所述生物分子是被待檢測的激酶特異性識別和磷酸化的肽。各種類型 的蛋白酶和通過這些蛋白酶特異性識別的肽也描述于名為"Detection of Protease and Protease Activity Using a Single Nanoscrescent SERS Probe" 的共審未決國際申請 No. PCT/US2007/010722中。使用納米月牙探針用于蛋白酶或其它生物分子的SERS檢測的 相關(guān)方法也描述于PCT/US2007/010722中，其全部內(nèi)容引入本文作為參考。
[0070] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述生物分子是肽，其中所述肽是長度約10?12個(gè)氨基酸 殘基的寡肽。然而，所述肽可短至4個(gè)氨基酸殘基，和長至100個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述肽應(yīng)為被相應(yīng)酶特異性識別和修飾的序列。所述肽可合成和商業(yè)上得到，或者所述 肽可以根據(jù)實(shí)施例1中所述方法制備。拉曼活性分子例如生物素或若丹明6G(R19)(圖1B) 優(yōu)選通過短的聚乙二醇或氨基戊酸連接物接枝在所述肽的氨基末端。
[0071] 所述生物分子可直接地或者經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)連接劑"結(jié)合"（即連接）到所述納米 等離子體激元共振器。本文中使用的"連接劑"是指在NPR和生物分子之間形成鍵且包括例 如官能團(tuán)、親和劑、或穩(wěn)定化基團(tuán)的任意化合物。合適的鍵包括離子相互作用，共價(jià)化學(xué)鍵， 物理力例如范德華或疏水相互作用，包封作用，包埋，結(jié)合親和力，吸引或認(rèn)可，和各種類型 的一級、二級、三級連接，所述連接包括，但不限于，肽、醚、酯、丙烯?；╝cryl)、醛、酮、丙 烯酰基（acryloyl)、硫醇、羧基、輕基、巰基和胺連接等。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方式中，數(shù)百種肽通過NPR的金屬納米盤與所述肽上的硫醇基之間的 直接反應(yīng)與所述NPR結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，NPR金屬表面還可使用胺或羧基改性，從而 所述肽可以通過肽鍵經(jīng)由與異雙官能交聯(lián)劑的反應(yīng)束縛到NPR表面上，其中所述異雙官能 受聯(lián)劑可與胺基和硫醇基兩者反應(yīng)，或者與竣基和硫醇基兩者反應(yīng)。在【具體實(shí)施方式】中， Au/Si02/Au/Si02NPR可以使用胺或羧基官能團(tuán)官能化，和所述肽可經(jīng)由交聯(lián)劑與胺和羧基 官能團(tuán)交聯(lián)。各種交聯(lián)劑可用于硫醇活化的肽和NPR上表面官能團(tuán)例如胺、羧基和羥基的 結(jié)合。
[0073] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，依靠 Au_硫醇反應(yīng)以形成共價(jià)鍵，使用在肽羧基末端 的半胱氨酸基團(tuán)以將所述肽連接到Au表面將底物肽束縛到Au/Si02/Au NPR的表面上。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，類似地將多個(gè)肽結(jié)合到NPR的表面，各自相同或不同。
[0074] 本文中所述的NPR指示物可利用包括用于需要檢測的任意蛋白酶的一個(gè)或多個(gè) 識別位點(diǎn)的多肽序列。蛋白酶（蛋白水解活性）不僅對于維持正常的細(xì)胞功能是需要的， 而且對于各種人類疾病的發(fā)病也是重要的。寄生蟲感染（例如血吸蟲病和瘧疾）、真菌感染 (例如白念珠菌（C. albicans))和病毒感染（例如HIV、皰疹和肝炎）以及癌癥、炎癥疾病、 呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和包括阿爾茨海默病的神經(jīng)變性疾病需要蛋白水解活性用于進(jìn) 展。因此蛋白酶存在、量或活性的檢測作為用于疾病的存在或可能性的診斷/預(yù)示標(biāo)志是 有用的。另外，蛋白酶活性（或者其抑制）的檢測在篩選用于治療許多病狀的蛋白酶抑制 劑療法中是有用的。
[0075] 可根據(jù)本發(fā)明檢測和/或定量的"蛋白酶"是典型地使位于多肽鏈中一對氨基 20酸之間的肽鍵水解的酶，也稱作內(nèi)切蛋白酶。典型地參考酶催化中心的親核物質(zhì)來限 定蛋白酶。最通常的親核物質(zhì)來自絲氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸的側(cè)鏈，產(chǎn)生蛋白酶家族 例如絲氨酸蛋白酶（Paetzel等（1997)Trends Biochem. Sci.22:28_31)、天冬氨醜蛋白酶 (Spinelli 等（1991)Biochemie73:1391-251396)、和半胱氨酸蛋白酶（Altschuh 等（1994) Prot. Eng. 7:769-75, 1994)。金屬蛋白酶通常在催化位點(diǎn)含有鋅催化金屬離子（Klimpel等 (1994)Mol. Microbiol. 13:1093-1100)。
[0076] "蛋白酶識別位點(diǎn)"是通過肽鍵連接的鄰接氨基酸序列，其含有一對通過由特定 蛋白酶水解的肽鍵連接的氨基酸。任選地，蛋白酶識別位點(diǎn)可包括在待水解肽鍵任一側(cè) 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其也結(jié)合有所述蛋白酶的催化位點(diǎn)（Schecter and Berger, (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:157-62)，或者蛋白質(zhì)底物上的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)可 為通過一個(gè)或多個(gè)（例如2?4個(gè)）氨基酸分離的兩個(gè)不同位點(diǎn)。
[0077] 蛋白酶識別位點(diǎn)中的氨基酸的特異性序列典型地取決于蛋白酶的催化機(jī)理，其通 過蛋白酶活性位點(diǎn)處的官能團(tuán)性質(zhì)所限定。例如，胰蛋白酶水解其羰基官能由賴氨酸或精 氨酸殘基貢獻(xiàn)的肽鍵，而不管多肽鏈的長度或氨基酸序列。然而，因子Xa識別特異性序列 Ile-Glu-Gly-Arg并且水解在Arg的C末端側(cè)上的肽鍵。各種優(yōu)選的蛋白酶識別位點(diǎn)包括， 但不限于，對于來自絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶識別位點(diǎn)，或者對于金屬蛋白酶 的蛋白酶識別位點(diǎn)，或者對于來自半胱氨酸蛋白酶家族、和/或天冬氨酸蛋白酶家族、和/ 或谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶識別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的絲氨酸蛋白 酶識別位點(diǎn)包括，但不限于，對于類似糜蛋白酶的蛋白酶、和/或類似枯草桿菌蛋白酶的蛋 白酶、和/或α/β水解酶、和/或信號肽酶的識別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的金屬 蛋白酶識別位點(diǎn)包括，但不限于，對于金屬羧基肽酶或金屬內(nèi)肽酶的識別位點(diǎn)。說明性的蛋 白酶和蛋白酶識別位點(diǎn)如下表1所示。
[0078] 表1.說明性的蛋白酶和蛋白酶識別位點(diǎn)（*表示水解的肽鍵）
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 納米等離子體激元共振器，包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤，具有結(jié)合或束縛到 所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子。
2. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述標(biāo)記物是用于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)檢測的拉曼 活性標(biāo)記物。
3. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述標(biāo)記物是熒光或其它能檢測的標(biāo)記物。
4. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述納米盤包括金屬薄層、半導(dǎo)體材料、金屬多層、金屬 氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料。
5. 權(quán)利要求4的共振器，其中所述納米盤由金屬組成。
6. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述屏蔽層包括具有恒定拉曼光譜的材料。
7. 權(quán)利要求6的共振器，其中所述屏蔽層選自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
8. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
9. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID N0:1)。
【文檔編號】G01N33/68GK104155282SQ201410331906
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月2日
【發(fā)明者】陳帆青, 喬納森.A.埃爾曼, 張祥, 孫誠, 蘇凱宏, 韋齊和 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會