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專利名稱：同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米功能材料、食品安全分析與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
瘦肉精是一類動物用藥，任何能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長的物質(zhì)都可以叫做“瘦肉精”。萊克多巴胺、沙丁胺醇及克倫特羅是三種常見的瘦肉精。此類藥物主要是腎上腺類β激動劑，因為能夠促進瘦肉生長、抑制動物脂肪生長，所以統(tǒng)稱“瘦肉精”。瘦肉精能讓豬的瘦肉率提高，帶來更多經(jīng)濟價值，但它有很危險的副作用。當用瘦肉精飼養(yǎng)家畜時，即有顯著的營養(yǎng)“再分配效應(yīng)”一促進動物體蛋白質(zhì)沉積、促進脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，因此曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。將瘦肉精添加于飼料中，可以增加動物的瘦肉量、減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本。瘦肉精能起到“瘦肉”作用，卻對人體健康危害過大，因而造成安全隱患。Ippm的克倫特羅添加于豬飼料中用于促生長，人食用豬肝或豬肺足夠引起中毒。其主要危害是:出現(xiàn)肌肉振顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀，特別是對高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴重的可導致死亡。2001年12月27日、2002年2月9日、2002年4月9日，農(nóng)業(yè)部分別下發(fā)文件禁止食品動物禁止使用β激動劑類藥物作為飼料添加劑(農(nóng)業(yè)部176號、193號公告、1519號條例)。目前國內(nèi)檢測瘦肉精的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和液相色譜一質(zhì)譜/質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。但由于其儀器價格昂貴，操作復雜，檢測周期長，所需試劑繁多等缺點已不能滿足現(xiàn)代檢測要求。因此，尋找一種簡單、快速、靈敏的檢測方法具有非常重要的意義。本發(fā)明采用絲網(wǎng)印刷電極，價格低廉，結(jié)合電化學技術(shù)，使之具有較高的靈敏度；結(jié)合免疫技術(shù)，提高了傳感器的選擇性，僅需簡單的樣品處理，節(jié)省了檢測時間，降低了檢測成本，是一種快速、廉價且靈敏度高的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是提供所制備的電化學傳感器用于同時檢測三種瘦肉精。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步
驟:
(I)銀鈀納米粒子水溶液的制備
將質(zhì)量比為(0.6~1.9): I的硝酸銀和六氯鈀酸鉀固體加入到1(T20 mL含有體積濃度為5%的曲拉通X-1OO水溶液中，室溫下攪拌1(T30 min，然后加熱到65 70°C保持3.5^5h，用水和乙醇清洗，離心分離，真空干燥，得到銀鈀納米粒子，銀與鈀的質(zhì)量比為(1.5
4.5): I，配成銀鈀納米粒子水溶液的濃度為f 2 mg/mL。(2)銀鈀納米粒子標記的三種瘦肉精抗體標記物溶液的制備
將0.Γ1 mL瘦肉精抗體溶液加入到f 2 mL制備的銀鈀納米粒子水溶液中，攪拌3 5h后離心分離，再重新分散到廣2 mL磷酸緩沖溶液中，得到瘦肉精抗體標記物溶液；所述瘦肉精抗體選自下列之一:萊克多巴胺抗體、沙丁胺醇抗體、克倫特羅抗體；所述瘦肉精抗體溶液濃度均為5 10 Pg/mL。(3)同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備
I)在多通道絲網(wǎng)印刷電極的3個工作電極的表面，分別滴加5 10 μ 、濃度為廣2 mg/mL的石墨烯溶液，自然晾干。2)在I)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加5 10 μ 的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)溶液，孵化f 3 h，然后用超純水清洗干凈。3)在2)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加5 10 μ 三種瘦肉精抗原溶液中的一種，潤濕狀態(tài)下放置廣3 h ;所述瘦肉精抗原選自下列之一:萊克多巴胺抗原、沙丁胺醇抗原、克倫特羅抗原；所述抗原溶液的濃度均為5 10 Pg/mL。4)在3)中得到的3個工作電極表面分別滴加5 PL、質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，待干燥后，用超純水清洗干凈，即制得同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器。2.以上所述制備的一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器，用于三種瘦肉精的同時檢測，步驟如 下:
(I)將上述制備的銀鈕納米粒子標記的抗體標記物溶液與對應(yīng)的三種瘦肉精的標準溶液等體積混合，孵化Ih，制得三種混合溶液。(2)在上述所得的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的3個工作電極表面上分別滴加5 10 μ (I)中得到的三種混合溶液，孵化I 3 h，然后用超純水清洗干凈。(3)將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入pH為5.(T9.0的磷酸鹽緩沖溶液，通過線性掃描伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與三種瘦肉精的標準溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測樣品制成的樣品溶液，代替三種瘦肉精的標準溶液，按照所述三種瘦肉精工作曲線的繪制方法進行檢測。以上所述的石墨烯溶液的制備，包括以下步驟:
將用經(jīng)典Hummers法合成的氧化石墨烯加入到0.5 mg/mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，超聲30 min，然后加熱到153°C保持I h。經(jīng)離心、洗滌、干燥，最后分散于超純水中得到濃度為廣2 mg/mL的石墨烯溶液。本發(fā)明具備以下優(yōu)勢:
(I)本發(fā)明快速、準確，僅需簡單處理，可用于復雜樣品中的三種瘦肉精的同時檢測。(2)本發(fā)明采用的銀鈀納米粒子和石墨烯均可增強電化學信號，從而提高了本發(fā)明傳感器的靈敏度。(3)本發(fā)明印刷電極制備簡單、成本低、便于攜帶、樣品消耗少，易于微型化和集成化，應(yīng)用范圍廣。(4)本發(fā)明與其它的絲網(wǎng)印刷電極傳感器相比，可以一次性同時檢測復雜樣品中三種瘦肉精，顯著提高了檢測效率，同時具有良好的準確性和精密度，檢測范圍為
0.01 1000 ppb，檢測限低于 0.002 ppb。


圖1本發(fā)明所采用的絲網(wǎng)印刷電極示意圖。在圖1中，(I)工作電極1，(2)工作電極2，(3)工作電極3，(4)參比電極，(5)輔助電極，(6)電解槽，(7)電極觸點，(8)印刷電極基板。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1
本發(fā)明提供的石墨烯溶液的制備方法，包括以下步驟:
將用經(jīng)典Hummers法合成的氧化石墨烯加入到0.5 mg/mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，超聲30 min,然后加熱到153°C保持I h。經(jīng)離心、洗漆、干燥,最后稱取1 2 mg石墨烯分散于I mL超純水中得到濃度為1 2 mg/mL的石墨烯溶液。實施例2
本發(fā)明提供的銀鈀納米粒子水溶液的制備方法，包括以下步驟:
將質(zhì)量比為0.6:1的硝酸銀和六氯鈀酸鉀固體加入到10 mL含有體積濃度為5%的曲拉通X-100水溶液中，室溫下攪拌10 min，然后加熱到65°C保持3.5h，用水和乙醇清洗，離心分離，真空干燥，得到銀鈀納米粒子，銀與鈀的質(zhì)量比為1.5: 1，配成銀鈀納米粒子水溶液的濃度為I mg/mL。實施例3
本發(fā)明提供的銀鈀納米粒子水溶液的制備方法，包括以下步驟:
將質(zhì)量比為1.3:1的硝酸銀和六氯鈀酸鉀固體加入到15 mL含有體積濃度為5%的曲拉通X-100水溶液中，室溫下攪拌20 min，然后加熱到68°C保持4.5 h，用水和乙醇清洗，離心分離，真空干燥，得到銀鈀納米粒子，銀與鈀的質(zhì)量比為3: 1，配成銀鈀納米粒子水溶液的濃度為1.5 mg/mL。實施例4
本發(fā)明提供的銀鈀納米粒子水溶液的制備方法，包括以下步驟:
將質(zhì)量比為1.9:1的硝酸銀和六氯鈀酸鉀固體加入到20 mL含有體積濃度為5%的曲拉通X-100水溶液中，室溫下攪拌30 min，然后加熱到70°C保持5 h，用水和乙醇清洗，離心分離，真空干燥，得到銀鈀納米粒子，銀與鈀的質(zhì)量比為4.5: 1，配成銀鈀納米粒子水溶液的濃度為2 mg/mL。實施例5
本發(fā)明提供的銀鈀納米粒子標記的三種瘦肉精抗體標記物溶液的制備方法，包括以下步驟:
將0.1 mL、濃度為5 Pg/mL三種瘦肉精抗體溶液中任意一種加入到I mL由實施例2 4任意一種方法制備的銀鈀納米粒子水溶液中，攪拌3 h后離心分離，再重新分散到I mL磷酸緩沖溶液中，得到相應(yīng)的瘦肉精抗體標記物溶液，即:萊克多巴胺抗體標記物溶液、沙丁胺醇抗體標記物溶液和克倫特羅抗體標記物溶液。實施例6
本發(fā)明提供的銀鈀納米粒子標記的三種瘦肉精抗體標記物溶液的制備方法，包括以下步驟:
將0.5 mL、濃度為7.5 Pg/mL三種瘦肉精抗體溶液中任意一種加入到1.5mL由實施例2^4任意一種方法制備的銀鈀納米粒子水溶液中，攪拌4h后離心分離，再重新分散到1.5mL磷酸緩沖溶液中，得到相應(yīng)的萊克多巴胺抗體標記物溶液、沙丁胺醇抗體標記物溶液和克倫特羅抗體標記物溶液。實施例7
本發(fā)明提供的銀鈀納米粒子標記的三種瘦肉精抗體標記物溶液的制備方法，包括以下步驟:
將I mL、濃度為10 Pg/mL三種瘦肉精抗體溶液中任意一種加入到2 mL由實施例2 4任意一種方法制備的銀鈀納米粒子水溶液中，攪拌5h后離心分離，再重新分散到2 mL磷酸緩沖溶液中，得到相應(yīng)的萊克多巴胺抗體標記物溶液、沙丁胺醇抗體標記物溶液和克倫特羅抗體標記物溶液。實施例8
本發(fā)明提供的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(I)在多通道絲網(wǎng)印刷電極(圖1)的3個工作電極的表面，分別滴加5 μ 、濃度為Img/mL的石墨烯溶液，自然晾干。(2)在(I)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加5PL的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化lh，然后用超純水清洗干凈。(3)在(2)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加5 PL三種瘦肉精抗原溶液中的一種，潤濕狀態(tài)下放置lh，所述抗原溶液的濃度均為5 Pg/mL。(4)在(3)中得到的3個工作電極表面分別滴加5 PL、質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，待干燥后，用超純水清洗干凈，即制得一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器。實施例9
本發(fā)明提供的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(I)在多通道絲網(wǎng)印刷電極(圖1)的3個工作電極的表面，分別滴加8 μ 、濃度為1.5mg/mL的石墨烯溶液，自然晾干。(2)在(I)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加8 PL的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化2 h，然后用超純水清洗干凈。(3)在(2)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加8 PL三種瘦肉精抗原溶液中的一種，潤濕狀態(tài)下放置2 h，所述抗原溶液的濃度均為8Pg/mL。

(4)在(3)中得到的3個工作電極表面分別滴加5 PL、質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，待干燥后，用超純水清洗干凈，即制得一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器。
實施例10
本發(fā)明提供的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(I)在多通道絲網(wǎng)印刷電極(圖1)的3個工作電極的表面，分別滴加10 μ 、濃度為2mg/mL的石墨烯溶液，自然晾干。(2)在(I)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加10 μ 的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化3 h，然后用超純水清洗干凈。(3)在(2)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加10 PL三種瘦肉精抗原溶液中的一種，潤濕狀態(tài)下放置3 h，所述抗原溶液的濃度均為10 Pg/mL。

(4)在(3)中得到的3個工作電極表面分別滴加5 PL、質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，待干燥后，用超純水清洗干凈，即制得一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器。實施例11
本發(fā)明提供的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器，用于三種瘦肉精的同時檢測，步驟如下:
(I)將實施例5 7中任意一種方法制備的銀鈀納米粒子標記的抗體標記物溶液與對應(yīng)的三種瘦肉精的標準溶液等體積混合，孵化2 h，制得三種混合溶液。(2)在實施例8 10中任意一種方法制備的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的3個工作電極表面，分別滴加8 PL (I)中得到的混合溶液，孵化2h，然后用超純水清洗干凈。(3)將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，通過線性掃描伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與三種瘦肉精的標準溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測樣品制成的樣品溶液，代替三種瘦肉精的標準溶液，按照所述三種瘦肉精工作曲線的繪制方法進行檢測。實施例12
本發(fā)明采用一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器，用于三種瘦肉精的同時檢測，步驟如下:
(I)將實施例5 7中任意一種方法制備的銀鈀納米粒子標記的抗體標記物溶液與對應(yīng)的三種瘦肉精的標準溶液等體積混合，孵化I h，制得三種混合溶液。(2)在實施例8 10中任意一種方法制備的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的3個工作電極表面，分別滴加5 PL (I)中得到的混合溶液，孵化lh，然后用超純水清洗干凈。(3)將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液，通過線性掃描伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與三種瘦肉精的標準溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測樣品制成的樣品溶液，代替三種瘦肉精的標準溶液，按照所述三種瘦肉精工作曲線的繪制方法進行檢測。實施例13
本發(fā)明采用一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器，用于三種瘦肉精的同時檢測，步驟如下:
(I)將實施例5 7中任意一種方法制備的銀鈀納米粒子標記的抗體標記物溶液與對應(yīng)的三種瘦肉精的標準溶液等體積混合，孵化3 h，制得三種混合溶液。(2)在實施例8 10中任意一種方法制備的同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的3個工作電極表面，分別滴加10 μ (I)中得到的混合溶液，孵化3h，然后用超純水清洗干凈。(3)將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入pH為9.0的磷酸鹽緩沖溶液，通過線性掃描伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與三種瘦肉精的標準溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；用于萊克多巴胺、沙丁胺醇和克倫特羅三種瘦肉精的檢測范圍均為0.0flOOO ppb，檢測限均低于
0.002 ppb ο(4)將待測樣品制成的樣品溶液，代替三種瘦肉精的標準溶液，按照所述三種瘦肉精工作曲線的繪制方法進行檢測。實施例14
由實施例f 13任意一種方法制成的電化學傳感器，用于3種豬肉樣品中三種瘦肉精的同時檢測，均未檢出三種瘦肉精；采用加標回收法，每種樣品平行檢測7次，其相對標準偏差均低于5%，回收率為97.69Γ102%，表明該方法的精密度和準確度均令人滿意，同時說明該產(chǎn)品為合格產(chǎn) 品。
權(quán)利要求
1.一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)銀鈀納米粒子水溶液的制備 將質(zhì)量比為(0.6 ^1.9): I的硝酸銀和六氯鈀酸鉀固體加入到1(T20 mL含有體積濃度為5%的曲拉通X-1OO水溶液中，室溫下攪拌1(T30 min，然后加熱到65 70°C保持3.5^5h，用水和乙醇清洗，離心分離，真空干燥，得到銀鈀納米粒子，銀與鈀的質(zhì)量比為(1.5 4.5): I，配成銀鈀納米粒子水溶液的濃度為f 2 mg/mL ； (2)銀鈀納米粒子標記的三種瘦肉精抗體標記物溶液的制備 將0.Γ1 mL瘦肉精抗體溶液加入到f 2 mL制備的銀鈀納米粒子水溶液中，攪拌3 5h后離心分離，再重新分散到廣2 mL磷酸緩沖溶液中，得到瘦肉精抗體標記物溶液；所述瘦肉精抗體選自下列之一:萊克多巴胺抗體、沙丁胺醇抗體、克倫特羅抗體； (3)同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備 1)在多通道絲網(wǎng)印刷電極的3個工作電極的表面，分別滴加5 10μ 、濃度為廣2 mg/mL的石墨烯溶液，自然晾干； 2)在I)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加5 10PL的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀 酰亞胺溶液，孵化f 3 h，然后用超純水清洗干凈； 3)在2)中得到的3個工作電極的表面上分別滴加5 10μ 三種瘦肉精抗原溶液中的一種，潤濕狀態(tài)下放置廣3 h； 4)在3)中得到的3個工作電極表面分別滴加5PL、質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，待干燥后，用超純水清洗干凈，即制得一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，(2)中所述瘦肉精抗體溶液的濃度為5 10 Pg/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法，(3)中3)所述瘦肉精抗原溶液的濃度為5 10 Pg/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的制備的一種同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器，用于三種瘦肉精的同時檢測，步驟如下: (1)將銀鈀納米粒子標記的抗體標記物溶液與對應(yīng)的三種瘦肉精的標準溶液等體積混合，孵化Ih，制得三種混合溶液； (2)在同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的3個工作電極表面上分別滴加5 10μ (I)所述的三種混合溶液，孵化I 3 h，然后用超純水清洗干凈； (3)將參比電極、對電極和工作電極連接在電化學工作站上，在電解槽中加入pH為.5.0-9.0的磷酸鹽緩沖溶液，通過線性掃描伏安法檢測所述修飾好的工作電極的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與三種瘦肉精的標準溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線； (4)將待測樣品制成的樣品溶液，代替三種瘦肉精的標準溶液，按照所述三種瘦肉精工作曲線的繪制方法進行檢測。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米功能材料、食品安全分析和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，其提供了同時檢測三種瘦肉精的電化學傳感器的制備方法及應(yīng)用。所述傳感器集成3個工作電極，可同時檢測萊克多巴胺、沙丁胺醇及克倫特羅三種常見的瘦肉精，提高了檢測效率和準確性。其制作方案是在多通道絲網(wǎng)印刷電極的3個工作電極的表面，依次滴涂石墨烯溶液、EDC/NHS溶液、三種瘦肉精抗原溶液和牛血清白蛋白溶液，通過競爭法將混合有待測樣品的銀鈀納米粒子標記的三種瘦肉精的抗體標記物溶液滴加到電極表面，實現(xiàn)0.01~1000ppb范圍內(nèi)的萊克多巴胺、沙丁胺醇和克倫特羅三種瘦肉精的同時檢測。
文檔編號G01N27/30GK103163193SQ20131007035
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者魏琴, 于海琴, 王歡, 張勇, 李賀, 杜斌, 吳丹, 馬洪敏 申請人:濟南大學