一種elisa用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，包括制備抗體標(biāo)被；對(duì)BDNF板和Prolaction板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再保存起來(lái)待用；配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；配制樣本稀釋液；將BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中孵育抗體；加入檢測(cè)抗體后加入試劑盒SA-HRP中；放在酶標(biāo)儀下讀取光密度OD值；繪制BDNF和prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)算稀釋樣品的回收率。本發(fā)明有效解決了背景值偏高，信噪比低，靈敏度低，并且具有降低基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的干擾，使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋 液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]ELISA 是酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)的簡(jiǎn)稱， 是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。由于ELISA的實(shí)驗(yàn)方法 具有敏感、特異、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、安全等特點(diǎn)，因此是目前免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種檢測(cè)方 法。
[0003]ELISA操作過(guò)程中選用優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的儀器以及正確的操作是保證ELISA檢 測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件，ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)檢 驗(yàn)一般均采用板式點(diǎn)。
[0004]無(wú)論ELISA技術(shù)如何發(fā)展，更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，更高的數(shù)據(jù)可重復(fù)性始終是 廣大科研工作者追求的目標(biāo)。建立一個(gè)好的ELISA方法的基礎(chǔ)是首先要找到好的抗原與抗 體，然而目如該技術(shù)仍然面臨許多問(wèn)題和挑戰(zhàn):(I)靈敏度有待提聞，ELISA方法在醫(yī)院，藥 企和科研院所被應(yīng)用于與疾病相關(guān)的各種因子的檢測(cè)，這些因子往往都是一些內(nèi)源性的細(xì) 胞因子、趨化分子、粘附分子等等，然而有些內(nèi)源性分子表達(dá)風(fēng)度低，難于被檢測(cè)，高靈敏度 的試劑盒有利于解決這個(gè)問(wèn)題。(2)基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題，ELISA所檢測(cè)的樣本的基質(zhì)種類多種多 樣，不同基質(zhì)成分、物理性質(zhì)不同，會(huì)對(duì)樣本檢測(cè)產(chǎn)生干擾，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確或不穩(wěn)定；并 且在內(nèi)源性因子的定量檢測(cè)中，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖液和待測(cè)樣本真實(shí)基質(zhì)間的客觀差異 也會(huì)影響到最后的檢測(cè)結(jié)果。(3)非特異性吸附，非特異性吸附的原因復(fù)雜，其中一個(gè)結(jié)果 就是導(dǎo)致空白的背景值偏高，信噪比偏低，從而影響了整個(gè)試劑盒的定量靈敏度。
[0005]酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清、血漿或其它基質(zhì)樣本不稀釋， 不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此，由于待測(cè)樣本機(jī)制的復(fù)雜性也可 能造成基質(zhì)效應(yīng)，干擾檢測(cè)結(jié)果。
[0006]因此，免疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】急需一種降低背景值偏高，提高信噪比，增加靈敏度，消 除基質(zhì)效應(yīng)所產(chǎn)生的干擾，使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠的ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋 液的制備方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明提供了一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，技術(shù)方案如 下:
[0008]一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，其特征在于，包含如下步 驟:
[0009]第一步，制備抗體包被；
[0010]將捕獲的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF抗體加入碳酸鹽緩沖液中，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)記為BNDF板，置于2_8°C的溫度下包被16-24小時(shí)；
[0011]進(jìn)一步地，將催乳素Prolactin抗體加入另一組碳酸鹽緩沖液中，并且將其加ELISA板的孔中，標(biāo)記為Prolaction板,置于2_8°C的溫度下包被16-24個(gè)小時(shí)；
[0012]第二步，對(duì)第一步中BDNF板和Prolaction板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再保存起來(lái)待用；
[0013]將PH值為7.4±0.2的含有5%牛血清白蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液PBS向第一步中的BNDF板和Prolaction板分別澆注；或者將PH值為7.4±0.2的含有5-10%脫脂奶粉向第一步中的BNDF板和Prolaction板分別燒注I ;
[0014]進(jìn)一步地,將該燒注好的BDNF板和Prolaction板分別放在2_8°C的溫度下封閉放置16-24小時(shí)；
[0015]進(jìn)一步地，用含有非離子型表面活性劑Tween20的PBS溶液對(duì)封閉好的BDNF板和Prolaction板進(jìn)行洗滌、晾干后，置于2_8°C的溫度下保存待用；
[0016]第三步，配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；
[0017]首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；
[0018]進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑Proclin，攪拌均勻后作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，即空白液；
[0019]第四步，配制樣本稀釋液；
[0020]樣本稀釋液1:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%表面活性劑3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0021]樣本稀釋液2:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步的，向該溶液中加入5mmol/l的螯合劑乙二胺四乙酸EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0022]樣本稀釋液3:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.05%牛血清Y -球蛋白BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0023]樣本稀釋液4:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.10%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0024]樣本稀釋液5:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.15%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0025]樣本稀釋液6:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.20%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0026]樣本稀釋液7:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.25%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0027]第五步，將BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中孵育抗體；
[0028]分別將第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，重復(fù)的分別加入第二步中晾干后待用的BDNF板和Prolaction板的孔中，再向各個(gè)反應(yīng)孔中加入處理酶；
[0029]進(jìn)一步地，將加好溶液的BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中，在18_25°C的室溫條件下反應(yīng)；
[0030]第六步，加入檢測(cè)抗體；
[0031 ] 用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第五步中反應(yīng)后的BDNF板和Prolaction板分別洗滌，再相應(yīng)的向BDNF板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入BDNF檢測(cè)抗體，并且相應(yīng)的向Pr ο I ac t i on板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入Prolaction檢測(cè)抗體；
[0032]第七步，將稀釋液加入試劑盒中；
[0033]用含有Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的BDNF板和Prolaction板分別洗滌后對(duì)其進(jìn)行稀釋，再分別向試劑盒SA-HRP中的每個(gè)孔中加入稀釋后的溶液；
[0034]第八步，放在酶標(biāo)儀下讀取光密度OD值；
[0035]用含有TWeen20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的試劑盒SA-HRP分別洗滌，再向該洗滌好的試劑盒SA-HRP中加入四甲基聯(lián)苯胺TMB底物；
[0036]進(jìn)一步地，將加好TMB的試劑盒SA-HRP放在酶標(biāo)儀下讀取OD值；
[0037]第九步，根據(jù)OD值計(jì)算出非特異性吸附數(shù)據(jù)，通過(guò)比較非特異性吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定出牛血清Y球蛋白BGG作為抗原對(duì)降低背景噪音具有直接并且積極的作用。
[0038]首先，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7和一份正常人血清樣本，在BDNF板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；
[0039]進(jìn)一步地，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7和一份正常人血清樣本，在Prolactin板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；
[0040]進(jìn)一步地，發(fā)現(xiàn)在稀釋液中加入牛血清Y球蛋白BGG的樣本稀釋液3-7，在兩種包被不同抗體的ELISA板，即BNDF板、Prolactin板中的非特異性吸附NSB都很小，從而說(shuō)明所產(chǎn)生的背景值都非常低；
[0041]進(jìn)一步地，由于樣本稀釋液3-7中的BGG濃度不同，但是都降低了 ELISA反應(yīng)中的背景信號(hào)；
[0042]進(jìn)一步地，說(shuō)明任意濃度的牛血清Y球蛋白BGG抗原對(duì)降低背景噪音具有直接且積極的作用。
[0043]如上所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液的制備方法，還包含:第十步，將第四步中的樣本稀釋液6作為新的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，僅將CHAPS的含量分別調(diào)整為0.1%、
0.15%、0.25%,0.3%、0.45%,0.5%、0.6%，從而形成7種新的樣本稀釋液8_14，其它步驟完全按照第一步至八步進(jìn)行處理，讀取OD值，進(jìn)一步計(jì)算出非特異性吸附系數(shù)；并對(duì)測(cè)得的非特異性吸附系數(shù)進(jìn)行分析，得出在牛血清Y球蛋白BGG含量一定的情況下，CHAPS濃度位于0.2%-0.45%之間時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附NSB都會(huì)降低，從而使背景信號(hào)降低。
[0044]如上所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液的制備方法，還包含--第十一步，從第四步和第十步中選取出三種信噪比高，非特異性信號(hào)低的三種樣本稀釋液來(lái)繪制BDNF和prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)算稀釋樣品的回收率；根據(jù)測(cè)試結(jié)果證明了向含有 5%BSA 的 PBS 中分別加入 0.05%Tween20、0.2-0.45%CHAPS、5mmol/l 的 EDTA、任意濃度的牛血清Y球蛋白BGG、百萬(wàn)分之十五的Proclin作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液，具體步驟為:
[0045]首先，分別將BDNF和Prolactin標(biāo)準(zhǔn)抗原加入BDNF和prolactin陰性血清中；
[0046]進(jìn)一步地，向該陰性血清樣本中分別加入樣本稀釋液3、樣本稀釋液10、樣本稀釋液12中其他步驟與第五步至第八步完全一致，讀出光密度OD值和回收率；
[0047]進(jìn)一步地，兩種樣本稀釋液3和樣本稀釋液12分別是CHAPS為0.2%和0.45%的 2個(gè)臨界點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明三種樣本稀釋液3、10、12配制的BDNF和Prolactin的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別互相平行，相關(guān)性很好，并且與陰性血清相比回收率提高；
[0048]進(jìn)一步地，證明向PH值為7.4±0.2的含有5%BSA的PBS中分別加入
0.05%Tween20、0.2-0.45%CHAPS、5mmol/l的EDTA、任意濃度的牛血清Y球蛋白BGG、百萬(wàn)分之十五的Proclin作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液。
[0049]本發(fā)明的有益效果是:
[0050]1.本發(fā)明用牛血清Y球蛋白BGG作為抗原，從而起到降低背景噪音的作用。
[0051]2.本發(fā)明確定了在牛血清Y球蛋白BGG含量一定的情況下，CHAPS濃度位于
0.2%-0.45%之間時(shí)，BDNF板和Prolactin板的非特異性吸附NSB都會(huì)降低，降低了背景信號(hào)。
[0052]3.本發(fā)明提供了一種非常好的適用于ELISA的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液，彌補(bǔ)了行業(yè)的空白，促進(jìn)科學(xué)進(jìn)步。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0053]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明:
[0054]圖1是本發(fā)明BDNF在三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0055]圖2是本發(fā)明Prolactin在三種稀釋液中的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0056]為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0057]本發(fā)明提供了一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，具體步驟如下:
[0058]第一步，制備抗體包被；
[0059]將捕獲的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF抗體加入PH值為9.6的0.05mol/l碳酸鹽緩沖液中，配制成濃度為2 μ g/ml的溶液，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)記為BNDF板，置于2-8°C的溫度下包被16-24小時(shí)；
[0060]進(jìn)一步地，將催乳素Prolactin抗體加入另一組PH值為9.6的0.05mol/l碳酸鹽緩沖液中，配制成濃度為2.5 μ g/ml的溶液，并且將其加ELISA板的孔中，標(biāo)記為Prolaction板,置于2_8°C的溫度下包被16-24個(gè)小時(shí)；
[0061]第二步，對(duì)第一步中BDNF板和Prolaction板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晾干后，再保存起來(lái)待用；
[0062]將PH值為7.4±0.2的含有5%牛血清白蛋白BSA的磷酸鹽緩沖液PBS向第一步中的BNDF板和Prolaction板分別澆注，每個(gè)孔中澆注300 μ I ;或者將PH值為7.4±0.2的含有5-10%脫脂奶粉向第一步中的BNDF板和Prolaction板分別澆注，每個(gè)孔中澆注300 μ I ;
[0063]進(jìn)一步地,將該燒注好的BDNF板和Prolaction板分別放在2_8°C的溫度下封閉放置16-24小時(shí)；
[0064]進(jìn)一步地，用含有0.05%非離子型表面活性劑Tween的PBS溶液對(duì)封閉好的BDNF板和Prolaction板進(jìn)行洗滌、晾干后，置于2_8°C的溫度下保存待用；
[0065]第三步，配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液；
[0066]首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；
[0067]進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑Proclin，攪拌均勻后作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，即空白液；
[0068]第四步，配制樣本稀釋液；
[0069]樣本稀釋液1:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%表面活性劑3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0070]樣本稀釋液2:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步的，向該溶液中加入5mmol/l的螯合劑乙二胺四乙酸EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0071]樣本稀釋液3:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.05%牛血清Y -球蛋白BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0072]樣本稀釋液4:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.10%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；
[0073]樣本稀釋液5:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.15%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的Proclin攪拌均勻；[0074]樣本稀釋液6:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn) 一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA 攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.20%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五 的Proclin攪拌均勻；
[0075]樣本稀釋液7:首先將0.05%Tween20加入含有5%BSA的PBS中，并且攪拌均勻；進(jìn) 一步地，向該溶液中加入0.2%CHAPS攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的EDTA 攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.25%BGG ;進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五 的Proclin攪拌均勻；
[0076]第五步，將BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中孵育抗體；
[0077]分別將第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣 本，以10個(gè)重復(fù)分別加入第二步中晾干后待用的BDNF板和Prolaction板的孔中，再向各 個(gè)反應(yīng)孔中加入IOOii I處理酶，
[0078]進(jìn)一步地，將加好溶液的BDNF板和Prolaction板放入孵育振蕩器中，以500轉(zhuǎn)/ 分的速度在18-25°C的室溫條件下反應(yīng)2小時(shí)。
[0079]第六步，加入檢測(cè)抗體；
[0080]用含有0.05%Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第五步中反應(yīng)后的BDNF板和 Prolaction板分別洗滌4次，再相應(yīng)的向BDNF板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入IOOyl的BDNF檢測(cè) 抗體，并且相應(yīng)的向Prolaction板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入IOOy I的Prolaction檢測(cè)抗體；
[0081]第七步，將稀釋液加入試劑盒中；
[0082]用含有0.05%Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的BDNF板和 Prolaction板分別洗滌4次，再以1:10000對(duì)其進(jìn)行稀釋后，分別向試劑盒SA-HRP中的每 個(gè)孔中加入100 ill的稀釋后的溶液；
[0083]第八步，放在酶標(biāo)儀下讀取光密度OD值；
[0084]用含有0.05%Tween20的PBS作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的試劑盒SA-HRP分別 洗滌4次，再向該洗滌好的試劑盒SA-HRP中加入四甲基聯(lián)苯胺TMB底物；
[0085]進(jìn)一步地，將加好TMB的試劑盒SA-HRP放在波長(zhǎng)為450nm的酶標(biāo)儀下讀取OD值；
[0086]第九步，根據(jù)OD值計(jì)算出非特異性吸附數(shù)據(jù)，通過(guò)比較非特異性吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一 步確定出牛血清Y球蛋白BGG作為抗原對(duì)降低背景噪音具有直接并且積極的作用；
[0087]首先，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本， 在BDNF板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果，如表一:
[0088]表一
【權(quán)利要求】
1.一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液的制備方法，其特征在于，包含如下步驟: 第一步，制備抗體包被； 將捕獲的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子抗體加入碳酸鹽緩沖液中，并且將其加入ELISA板的孔中，標(biāo)記為BNDF板,置于2-8°C的溫度下包被16-24小時(shí)； 進(jìn)一步地，將催乳素抗體加入另一組碳酸鹽緩沖液中，并且將其加ELISA板的孔中，標(biāo)記為催乳素板，置于2-8°C的溫度下包被16-24個(gè)小時(shí)； 第二步，對(duì)第一步中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板分別進(jìn)行澆注、封閉、洗滌、晚干后，再保存起來(lái)待用； 將PH值為7.4±0.2的含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液向第一步中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板分別澆注；或者將PH值為7.4±0.2的含有5-10%脫脂奶粉向第一步中的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板分別澆注； 進(jìn)一步地，將該澆注好的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板分別放在2-8°C的溫度下封閉放置16-24小時(shí)； 進(jìn)一步地，用含有非離子型表面活性劑的PBS溶液對(duì)封閉好的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板進(jìn)行洗滌、晾干后，置于2-8°C的溫度下保存待用； 第三步，配制標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，作為空白液； 首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻； 進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑，攪拌均勻后作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，即空白液；` 第四步，配制樣本稀釋液； 樣本稀釋液1:首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%表面活性劑3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻； 樣本稀釋液2:首先將0.05%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步的，向該溶液中加入5mmol/l的螯合劑乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻； 樣本稀釋液3:首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.05%牛血清Y球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻； 樣本稀釋液4:首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.10%牛血清Y球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻；樣本稀釋液5:首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.15%牛血清Y球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻；樣本稀釋液6:首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.20%牛血清Y球蛋白；進(jìn)一步 地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻；樣本稀釋液7:首先將0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂加入含有5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中，并且攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.2%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸攪拌均勻；進(jìn)一步地，向該溶液中加入0.25%牛血清Y球蛋白；進(jìn)一步地，向該溶液中加入百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑攪拌均勻；第五步，將腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板放入孵育振蕩器中孵育抗體；分別將第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，重復(fù)的分別加入第二步中晾干后待用的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板的孔中，再向各個(gè)反應(yīng)孔中加入處理酶，進(jìn)一步地，將加好溶液的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板放入孵育振蕩器中，在 18-25°C的室溫條件下反應(yīng)；第六步，加入檢測(cè)抗體；用含有腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的磷酸鹽緩沖液作為洗液，對(duì)第五步中反應(yīng)后的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板分別洗滌，再相應(yīng)的向BDNF板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子檢測(cè)抗體，并且相應(yīng)的向催乳素板的每個(gè)反應(yīng)孔中加入催乳素檢測(cè)抗體；弟七步，將稀釋液加入試劑盒中；用含有腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的磷酸鹽緩沖液作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板分別洗滌后對(duì)其進(jìn)行稀釋，再分別向該試劑盒中的每個(gè)孔中加入稀釋后的溶液。第八步，放在酶標(biāo)儀下讀取光密度值；用含有腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的磷酸鹽緩沖液作為洗液，對(duì)第六步中反應(yīng)后的試劑盒分別洗滌，再向該洗滌好的試劑盒中加入四甲基聯(lián)苯胺底物；進(jìn)一步地，將加好TMB的試劑盒放在酶標(biāo)儀下讀取光密度值；第九步，根據(jù)光密度值計(jì)算出非特異性吸附數(shù)據(jù)，通過(guò)比較非特異性吸附數(shù)據(jù)，進(jìn)一步確定出牛血清Y球蛋白作為抗原對(duì)降低背景噪音具有直接并且積極的作用。首先，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本，在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；進(jìn)一步地，第三步中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、第四步中的樣本稀釋液1-7、一份正常人血清樣本， 在催乳素板上所測(cè)得的非特異性吸附NSB的信號(hào)結(jié)果；進(jìn)一步地，發(fā)現(xiàn)在稀釋液中加入牛血清Y球蛋白的樣本稀釋液3-7，在兩種包被不同抗體的ELISA板，即神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子板和催乳素板中的非特異性吸附NSB都很小，從而說(shuō)明所產(chǎn)生的背景值都非常低，為0.02-0.045之間； 進(jìn)一步地，由于樣本稀釋液3-7中的牛血清Y球蛋白濃度不同，但是都降低了 ELISA反應(yīng)中的背景信號(hào)； 進(jìn)一步地，說(shuō)明牛血清Y球蛋白抗原對(duì)降低背景噪音具有直接且積極的作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液的制備方法，還包含:第十步，將該第四步中的樣本稀釋液6作為新的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，僅將該3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽的含量分別調(diào)整為0.1%、0.15%、0.25%,0.3%、0.45%,0.5%、0.6%，從而形成7種新的樣本稀釋液8-14，其它步驟完全按照第一步至八步進(jìn)行處理，讀取光密度值，進(jìn)一步計(jì)算出非特異性吸附系數(shù)；并對(duì)測(cè)得的非特異性吸附系數(shù)進(jìn)行分析，得出在牛血清Y球蛋白含量一定的情況下，3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽濃度位于0.2%-0.45%之間時(shí)，腦源性神經(jīng)因子板和催乳素板的非特異性吸附都會(huì)降低，從而使背景信號(hào)降低。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種ELISA用的抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液的制備方法，還包含:第十一步，從第四步和第十步中選取出三種信噪比高，非特異性信號(hào)低的三種樣本稀釋液來(lái)繪制BDNF和prolactin的回收率標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)算稀釋樣品的回收率；根據(jù)測(cè)試結(jié)果證明了向含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中分別加入0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單月旨、0.2-0.45%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、5mmol/l的乙二胺四乙酸、任意濃度的牛血清Y球蛋白、百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液，具體步驟為: 首先，分別將腦源性神經(jīng)因子和催乳素標(biāo)準(zhǔn)抗原加入腦源性神經(jīng)因子和催乳素陰性血清中； 進(jìn)一步地，分別對(duì)配制好的陰性血清進(jìn)行稀釋，稀釋后分別加入樣本稀釋液3、樣本稀釋液10、樣本稀釋液12中，其他步驟與第五步至第八步完全一致，讀出光密度值和回收率； 進(jìn)一步地，兩種樣本稀釋液3和樣本稀釋液12分別是3- [3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽為0.2%和0.45%的2個(gè)臨界點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明三種樣本稀釋液3、10、12配制的腦源性神經(jīng)因子和催乳素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別互相平行，相關(guān)性很好，并且與陰性血清相比回收率提聞; 進(jìn)一步地，證明向PH值為7.4±0.2的含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中分別加入.0.05%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸單脂、0.2-0.45%的3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、5mmol/l的乙二胺四乙酸、任意濃度的牛血清、球蛋白、百萬(wàn)分之十五的液體防腐劑作為稀釋液，是一種效果非常好的適用于ELISA的樣本稀釋液。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103558372SQ201310555174
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】章登吉, 程禹, 段新偉, 張波 申請(qǐng)人:點(diǎn)亮生物科技無(wú)錫有限公司
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