久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

三疣梭子蟹血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種三疣梭子蟹血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法。所述檢測(cè)試劑盒包括酶標(biāo)板、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)記抗體、pNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細(xì)胞抗凝劑，其特征在于所述試劑盒還包括抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆抗體。其中所述的抗三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆隆抗體，所述單抗能與三疣梭子蟹血細(xì)胞特異性結(jié)合。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)，其敏感度高，特異性強(qiáng)，精確度高，能夠用于少量樣品、多個(gè)樣品的平行檢測(cè)，重復(fù)性穩(wěn)定性都大大提高。能夠?qū)⑷嗨笞有费?xì)胞的變化直觀的表現(xiàn)出來(lái)，起到監(jiān)測(cè)三疣梭子蟹健康狀況的作用。
【專利說(shuō)明】三疣梭子蟹血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種應(yīng)用單克隆抗體定量檢測(cè)三撫梭子蟹iPortunustrituberculatus)血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒及其制備方法,屬于甲殼類分子免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]蟹等甲殼動(dòng)物缺乏脊椎動(dòng)物那樣完整的特異性免疫防御系統(tǒng)，不具有免疫球蛋白，其免疫防御反應(yīng)機(jī)制主要依賴于血細(xì)胞(透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞)及血淋巴中體液因子，血細(xì)胞通過(guò)吞噬、包囊、凝集、胞吐、結(jié)節(jié)形成、傷口修復(fù)、細(xì)胞凝塊等完成細(xì)胞免疫過(guò)程，大量研究證明透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中都發(fā)揮重要作用，但功能不同，其中透明細(xì)胞主要參與血淋巴的凝集反應(yīng)，顆粒細(xì)胞含有酚氧化酶和水解酶，主要參與對(duì)外來(lái)異物的吞噬和包囊。當(dāng)機(jī)體受到重金屬、低溫、高溫、饑餓及病原侵害等脅迫時(shí)，血細(xì)胞會(huì)發(fā)生顯著變化。因此，血細(xì)胞是反應(yīng)蟹類免疫防御功能和健康狀況的重要指標(biāo)之一。
[0003]但目前有關(guān)三疣梭子蟹血細(xì)胞酶的功能、血細(xì)胞結(jié)構(gòu)、血細(xì)胞參與免疫防疫反應(yīng)的機(jī)理在國(guó)內(nèi)外研究較少，主要是由于沒(méi)有合適的分子標(biāo)記物研究其發(fā)生及反應(yīng)機(jī)理，而單克隆抗體由于具有高靈敏度、高特異性、重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)常被應(yīng)用于免疫細(xì)胞的定位和病原的定量研究中。目前已有中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞，扇貝血細(xì)胞單克隆抗體的研究報(bào)道，主要應(yīng)用于研究識(shí)別、鑒定、檢測(cè)血細(xì)胞變化等方面。因此，三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體的制備為進(jìn)一步研究三疣梭子蟹血細(xì)胞類型、不同血細(xì)胞之間的關(guān)系以及蟹類血細(xì)胞在三疣梭子蟹非特異性免疫系統(tǒng)中的作用提供了有力工具。此外，研究表明，蟹類受外來(lái)病原和環(huán)境刺激時(shí)，其血細(xì)胞總數(shù)會(huì)發(fā)生顯著變化，以三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體為基礎(chǔ)建立酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中蟹類血細(xì)胞數(shù)量的變化，進(jìn)而評(píng)估生產(chǎn)實(shí)踐中三疣梭子蟹體質(zhì)及抗逆狀況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種精確度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性強(qiáng)且成本低、效價(jià)高的應(yīng)用抗三疣梭子蟹血細(xì)胞單抗來(lái)檢測(cè)血細(xì)胞數(shù)量變化的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒，通過(guò)檢測(cè)三疣梭子蟹血細(xì)胞數(shù)量變化，來(lái)監(jiān)測(cè)三疣梭子蟹健康狀況。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述三疣梭子蟹血粒細(xì)胞ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法。
[0006]本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒包括:酶標(biāo)板、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)記抗體、pNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細(xì)胞抗凝劑，其特征在于所述試劑盒還包括抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆抗體。
[0007]其中所述的抗三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆隆抗體，所述單抗能與三疣梭子蟹血細(xì)胞特異性結(jié)合。
[0008]所述的封閉液為含2.0% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
[0009]所述的洗滌液為含0.1% (v/v)Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0010]所述的酶標(biāo)記抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體。
[0011]所述的血細(xì)胞抗凝劑為含0.02M EDTA的磷酸鹽緩沖液。
[0012]本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒的制備方法包括以下步驟:
1、制備三疣梭子蟹血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品:從健康的三疣梭子蟹游泳足基部軟膜處抽取血淋巴，離心后、得到的全血細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為106cells/mL,經(jīng)超聲破碎后，即為血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣,作為抗原使用；
2、制備單抗:以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品為抗原免疫小鼠，Balb/c免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合、克隆，制備三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體；用間接免疫熒光法選取I株免疫熒光反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性，且能與顆粒細(xì)胞特異性結(jié)合的單克隆抗體作為抗三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體；
3、優(yōu)化抗原與抗體的最佳使用比例:分別用PBS將上述血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品與上述血細(xì)胞單克隆抗體稀釋不同的濃度梯度，通過(guò)ELISA棋盤(pán)滴定法獲取抗原抗體的最適反應(yīng)比例，從而確定抗原抗體的最佳使用比例；
4、建立檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):上述的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定其蛋白濃度，用PBS稀釋血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣為不同的濃度梯度，及不經(jīng)稀釋的血細(xì)胞單克隆抗體3F4作為第一抗體，用ELISA法測(cè)定各個(gè)稀釋度的OD值，來(lái)確定試劑盒的最低檢測(cè)限度。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)，其敏感度高，特異性強(qiáng)，精確度高，能夠用于少量樣品、多個(gè)樣品的平行檢測(cè)，重復(fù)性穩(wěn)定性都大大提高。能夠?qū)⑷嗨笞有费?xì)胞的變化直觀的表現(xiàn)出來(lái)，起到監(jiān)測(cè)三疣梭子蟹健康狀況的作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明的單抗3F4與三疣梭子蟹血細(xì)胞反應(yīng)的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。
[0015]圖2為本發(fā)明用于檢測(cè)三疣梭子蟹經(jīng)病原菌感染后血細(xì)胞數(shù)變化的結(jié)果。
[0016]圖1所示:(A)為原視野下血細(xì)胞的觀察圖；(B)為激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色；(C)血細(xì)胞與單抗MAb 3F4反應(yīng)后出現(xiàn)綠色熒光；(D)為B和C的Merge圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0018]實(shí)施例1:三疣梭子蟹血細(xì)胞ELISA檢測(cè)試劑盒的制備
1、制備血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣:取3-4只正常健康的三疣梭子蟹，無(wú)菌注射器從游泳足基部軟膜處抽取血淋巴，4 °C預(yù)冷抗凝劑(29.835g Nacl，18gC6H1206, 38.426gC6H807，
8.823gC6H5Na207, 3.7224g EDTA_2Na,調(diào)整 pH=7.3，雙蒸水定容至 1000ml)按體積比 1:2 混勻，4°C，1500rpm,離心6min，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為106cellS/mL，超聲破碎后，即為血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣，作為抗原使用，分裝，-80°C凍存。
[0019]2、制備抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆抗體
(I)Balb/c小鼠的免疫:取上述制備好的血細(xì)胞抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，完全乳化，取0.1ml腹腔注射4周齡雌性Balb/c小鼠；2周后加強(qiáng)免疫，腹腔注射抗原0.1ml(佐劑改為弗氏不完全佐劑);1周后二次加強(qiáng)免疫，尾靜脈注射抗原0.1ml ;1周后擴(kuò)增免疫，尾靜脈注射抗原0.1ml ;三天后，Balb/c免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合。
[0020](2)細(xì)胞融合并篩選血細(xì)胞的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞:Balb/c免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，培養(yǎng)；采用間接酶聯(lián)免疫吸附法初步篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株；采用有限稀釋法克隆陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株3-4次，培養(yǎng)8-10天后，采用間接免疫熒光抗體法再次檢測(cè)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株3F4 (圖1)。
[0021](3)血細(xì)胞單抗的收集與純化:收集細(xì)胞培養(yǎng)板中的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞上清液，2000rpm，離心10min，棄血細(xì)胞沉淀，收集上清即為三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體，過(guò)親和層析柱，濃縮、透析、凍干，PBS重懸，分裝，-80°C凍存。
[0022]3、確定抗原與抗體的最佳使用比例:血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品用PBS按照2°，2—1到2_6的梯度稀釋、包被4°C過(guò)夜；加以PBS配置的2%的牛血清蛋白溶液(封閉液)封閉Ih ;將血細(xì)胞單抗(一抗)按照到2_5的梯度稀釋，每孔10ul按棋盤(pán)滴定法加入相應(yīng)的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣中，37°C孵育1.5h ;加10ul酶標(biāo)記抗體作為AP 二抗，37°C孵育Ih ;加10ul pNPP底物顯色液37°C孵育30min，酶標(biāo)儀于405nm處讀數(shù)。最后為節(jié)約成本并結(jié)合實(shí)際用量確定稀釋度在抗原稀釋4倍，單抗稀釋4倍(即2_22_2)為最佳使用比例。
[0023]表1不同稀釋梯度的抗原和抗體結(jié)合的OD4(l5nm，粗體為0D405nm≥0.408

【權(quán)利要求】
1.一種三疣梭子蟹血細(xì)胞的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括:酶標(biāo)板、封閉液、洗滌液、酶標(biāo)記抗體、PNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細(xì)胞抗凝劑，其特征在于所述試劑盒還包括抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的抗三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血細(xì)胞的單克隆隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的封閉液為含2.0%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含0.1%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的血細(xì)胞抗凝劑為含0.02MEDTA的磷酸鹽緩沖液。
7.—種如權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備三疣梭子蟹血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品:從健康的三疣梭子蟹游泳足基部軟膜處抽取血淋巴，離心后、得到的全血細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為106cellS/mL，經(jīng)超聲破碎后，即為血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣，作為抗原使用； (2)制備單抗:以血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品為抗原免疫小鼠，Balb/c免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合、克隆，制備三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體；用間接免疫熒光法選取I株免疫熒光反應(yīng)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性，且能與顆粒細(xì)胞特異性結(jié)合的單克隆抗體作為抗三疣梭子蟹血細(xì)胞單克隆抗體； (3)優(yōu)化抗原與抗體的最佳使用比例:分別用PBS將上述血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品與上述血細(xì)胞單克隆抗體稀釋不同的濃度梯度，通過(guò)ELISA棋盤(pán)滴定法獲取抗原抗體的最適反應(yīng)比例，從而確定抗原抗體的最佳使用比例； (4)建立檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):上述的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定其蛋白濃度，用PBS稀釋血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣為不同的濃度梯度，及不經(jīng)稀釋的血細(xì)胞單克隆抗體3F4作為第一抗體，用ELISA法測(cè)定各個(gè)稀釋度的OD值，來(lái)確定試劑盒的最低檢測(cè)限度。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104198715SQ201410465242
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】王文琪, 馮玲倩, 王穎, 陳飛雄 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)