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一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的cic抗原緩沖液解離劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，公開了一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑，包括CIC抗原緩沖液解離劑；每1L的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分：甘氨酸、35%-37%的濃鹽酸、氯化鈉、液體生物防腐劑、蒸餾水。本發(fā)明利用該種免疫復(fù)合物緩沖解離劑檢測CIC的方法，建立了特異性檢測CIC中抗原的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，這是現(xiàn)有CIC檢測方法都無法解決的問題。本發(fā)明同時(shí)具備特異、靈敏、批量高效、重復(fù)性好、不受干擾、可定量或定性檢測的技術(shù)特征。該種免疫復(fù)合物緩沖解離劑應(yīng)用于患有感染性疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、部分腫瘤疾病患者的體液標(biāo)本中CIC的檢測。
【專利說明】一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的Cic抗原緩沖液解離劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌、病毒等病原體侵入機(jī)體后或致敏物質(zhì)(抗原，含自身抗原)刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而產(chǎn)生特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞或抗體，并與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，所得到的復(fù)合物稱為免疫復(fù)合物(又稱抗原抗體復(fù)合物，immune complex, IC),主要有IgG, IgM, IgA, IgE型免疫復(fù)合物，其中以IgG和IgM最常見。由于抗原與抗體比例不同，所形成的IC分子大小各異，通常有三種形式:一是抗原抗體比例適當(dāng)時(shí)，形成大分子的不溶性IC(大于19S)，易被吞噬細(xì)胞捕獲、吞噬和清除。二是抗原量過剩時(shí)，形成小分子的可溶性IC (小于6.6S)，易透過腎小球?yàn)V過隨尿排出體外。三是抗原量稍過剩時(shí)，形成中等大小的可溶性IC(8.8-19S)，它既不被吞噬細(xì)胞清除，又不能通過腎小球?yàn)V過排出，可較長時(shí)間游離于血液和其他體液中，又稱循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immuno complex, CIC)。
[0003]正常情況下，機(jī)體內(nèi)的游離抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合形成1C，可被機(jī)體的防御系統(tǒng)清除，作為清除異物抗原的一種方式，對機(jī)體有利。但在某些病理情況下，體內(nèi)形成的IC不能被及時(shí)清除，可在局部沉積，通過激活補(bǔ)體，并在血小板、中性粒細(xì)胞等參與下，引起一系列連鎖反應(yīng)而導(dǎo)致組織損傷，出現(xiàn)臨床癥狀，稱為免疫復(fù)合物病(immuno complex disease,I⑶)。檢查組織內(nèi)或循環(huán)體液中IC的存在有助于某些疾病的診斷、發(fā)病機(jī)制的研究、預(yù)后評估、病情活動觀察和療效判斷等。因此，準(zhǔn)確、特異、靈敏檢測免疫復(fù)合物對疾病的診斷、治療和預(yù)后評估具有重要的臨床意義，CIC的檢測日益受到重視。
[0004]世界衛(wèi)生組織(WHO)曾組織進(jìn)行CIC檢測方法學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)尚無任何一種技術(shù)同時(shí)具備特異、靈敏、批量高效、重復(fù)性好的所有特點(diǎn)。由于方法的復(fù)雜性、敏感性和所檢測CIC類型的局限性，目前的常用CIC檢測技術(shù)均受到免疫復(fù)合物內(nèi)免疫球蛋白種類及亞類、復(fù)合物大小、抗原與抗體比例、固定補(bǔ)體的能力等因素影響，在臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用受到很大限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有CIC檢測技術(shù)及檢測過程中，不能同時(shí)具備特異、靈敏、批量高效、重復(fù)性好、不受干擾的技術(shù)問題，公開了一種解決了以上技術(shù)問題的用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的Cic抗原緩沖液解離劑。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決。
[0007]一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑，以如下體積比例配比計(jì)，各組分及含量為，135μ 1-165μ I的CIC分離劑、290μ 1-315μ I的CIC洗滌劑、5 μ 1-16 μ I的CIC復(fù)溶劑、65 μ 1-76 μ I的CIC抗原緩沖液解離劑和65 μ 1-76 μ I的CIC抗原緩沖液解離中和劑。以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物為例，本發(fā)明的試劑配方可以使CIC中的抗原解離率達(dá)到76.5%-83.8%(抗原解離率:指CIC解離后檢測到的抗原量與實(shí)際CIC中抗原量的百分比)。而蛋白酶類消化法、強(qiáng)酸解離法、表面活性劑解離法的抗原解離率均在10%-20%以下。
[0008]其中，每IL的CIC分離劑包括以下組分:5.2g-7.7g的硼砂、4.lg-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC分離劑的作用如下:當(dāng)每IL的CIC分離劑中包括5.2g-7.7g的硼砂、4.lg-6.1g的硼酸、70g-90g的聚乙二醇、6.2g-9.2g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水時(shí)，被分離的CIC達(dá)到最大量，同時(shí)改用氯化鈉也可避免了傳統(tǒng)沉淀方法中氟化鈉殘留對后續(xù)檢測抗原的干擾。本發(fā)明采用的聚乙二醇，作為優(yōu)選選用聚乙二醇6000。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0009]每IL的CIC洗滌劑包括以下組分:5.2g-7.7g的硼砂、4.lg-6.1g的硼酸、35g_45g的聚乙二醇、8.0g-11.7g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。以上配方的CIC洗滌劑主要針對CIC分離劑的配方進(jìn)行設(shè)計(jì)，其作用是洗去體液標(biāo)本中多余的雜蛋白。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0010]每IL的CIC復(fù)溶劑包括以下組分:8.0g-9.5g的氯化鈉、(λ Olg-0.03g的氫氧化鈉、50 μ 1-500 μ I的聚乙二醇辛基苯基醚、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC復(fù)溶劑針對解離時(shí)的緩沖量大小而設(shè)計(jì)，以上配方的CIC復(fù)溶劑對分離CIC的損傷程度最??；采用等滲的聚乙二醇辛基苯基醚，低濃度的聚乙二醇辛基苯基醚協(xié)助溶解CIC。本發(fā)明所采用的聚乙二醇辛基苯基醚又叫Triton X-100，本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為 Proclin-300。
[0011]每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:3.5g-5.5g的甘氨酸、9.0ml-15.0ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%_37%的濃鹽酸、0.35g-0.51g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC抗原緩沖液解離劑使CIC中抗原解離的效果較為理想。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物為參照，抗原解離率達(dá)到76.5%_83.8%。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0012]作為優(yōu)選，每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:4.0g-5.0g的甘氨酸、9.5ml-14.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%_37%的濃鹽酸、0.40g-0.5g的氯化鈉、120 μ 1-480 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC抗原緩沖液解離劑使CIC中抗原解離的效果最為理想。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0013]作為優(yōu)選，每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g-5.0g的甘氨酸、12ml-14.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%_37%的濃鹽酸、0.43g-0.5g的氯化鈉、200 μ 1-480 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC抗原緩沖液解離劑使CIC中抗原解離的效果最為理想。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物為參照，抗原解離率達(dá)到80%-83.8%。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0014]作為優(yōu)選，每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g的甘氨酸、12ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%的濃鹽酸、0.43g的氯化鈉、200 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。該組分的CIC抗原緩沖液解離劑使CIC中抗原達(dá)到最大程度的解離。如以制備的HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物為參照，抗原解離率達(dá)到83.8%。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為 Procl in-300 ο[0015]每IL的CIC抗原緩沖液解離中和劑包括以下組分:16g-24g的氨基丁三醇、
5.7g-8.6g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。CIC抗原緩沖液解離中和劑主要是對CIC解離后的抗原進(jìn)行中和，使?jié)B透壓、pH達(dá)到抗原的最適環(huán)境，以利于對抗原的檢測。本發(fā)明中提到的液體生物防腐劑為Proclin-300。
[0016]以上提到的一種免疫復(fù)合物緩沖解離劑應(yīng)用于患有感染性疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、部分腫瘤疾病患者的血清、胸腹水、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔液中CIC的檢測。感染性疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、部分腫瘤疾病等患者的血清、胸腹水、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔液等體液標(biāo)本中是否存在相應(yīng)CIC，我們可以通過分離CIC，從而推斷患者血清、胸腹水、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔液等體液中是否存在相應(yīng)特異性標(biāo)志物的CIC以及含量高低，以了解CIC在上述疾病發(fā)生發(fā)展過程中的病理生理作用及相關(guān)性；相關(guān)標(biāo)志物陰性體液標(biāo)本中若檢測到相應(yīng)Cic中的抗原或抗體(通常情況下，抗原解離率高于抗體解離率)，則能提高該標(biāo)志物的檢出率及對相應(yīng)疾病的診斷靈敏度。
[0017]一種利用以上提到的免疫復(fù)合物緩沖解離劑檢測CIC的方法，檢測CIC中抗原的方法，以HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物為例，由下述步驟組成，
[0018]A.分離:向2支Iml的離心管分別加入150 μ I含有CIC的待測樣本，再分別加入135 μ 1-165 μ I的CIC分離劑；混勻后，在37°C放置30min，進(jìn)行離心，離心結(jié)束后棄去上清液；
[0019]B.洗滌:向兩支離心管中，分別加入290μ 1_315μ I的CIC洗滌劑，離心后，棄去上清液，并將CIC沉淀物浙干；
[0020]C.復(fù)溶:分別向含有浙干的CIC沉淀物的離心管中，加入5μ 1_16μ I的CIC復(fù)溶劑，離心管安裝于振蕩器上，振蕩至溶液中無塊狀沉淀物；
[0021]D.空白樣品檢測:將一支離心管標(biāo)記為空白樣品管,并加入65 μ 1-76 μ I的抗原緩沖液解離劑和65 μ 1-76 μ I的抗原緩沖液解離中和劑，混勻后檢測HBsAg，將檢測結(jié)果作為空白值；
[0022]E.CIC抗原解離:將另一支離心管標(biāo)記為測定樣品管，并加入65 μ 1-76 μ I的抗原緩沖液解離劑，在56°C空氣孵育放置30min或在42°C水浴放置30min，得到解離液；
[0023]F.CIC抗原解離中和:向步驟E中得到的解離液中，加入65 μ 1-76 μ I抗原緩沖液解離中和劑，混勻后檢測HBsAg，將檢測結(jié)果作為測定值。
[0024]HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物解離后抗原檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，如下表所示:
[0025]表1HBsAg-抗-HBs免疫復(fù)合物解離后抗原檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:3.5g-5.5g的甘氨酸、9.0ml-15.0ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%-37%的濃鹽酸、0.35g-0.51g的氯化鈉、100 μ 1-500 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
2.權(quán)利要求1所述的一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:4.0g-5.0g的甘氨酸、9.5ml_14.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%-37%的濃鹽酸、0.40g-0.5g的氯化鈉、120 μ 1-480 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
3.權(quán)利要求1所述的一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g-5.0g的甘氨酸、12ml-14.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%-37%的濃鹽酸、0.43g-0.5g的氯化鈉、200 μ 1-480 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
4.權(quán)利要求1所述的一種用于免疫復(fù)合物緩沖解離劑的CIC抗原緩沖液解離劑，其特征在于:每IL的CIC抗原緩沖液解離劑包括以下組分:4.5g的甘氨酸、12ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%的濃鹽酸、0.43g的氯化鈉、200 μ I的液體生物防腐劑、余量為蒸餾水。
【文檔編號】G01N33/531GK103776999SQ201410033007
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】成軍, 陳達(dá)偉, 孫長貴, 戴玉柱, 王國政, 江曉肖, 馬炬明, 張益明 申請人:中國人民解放軍第一一七醫(yī)院