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Rna聚合酶ii第五亞基調(diào)節(jié)蛋白在制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌預(yù)后或輔助性tace預(yù)后的試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白(RMP)在制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌預(yù)后或輔助性TACE預(yù)后的試劑中的應(yīng)用。首次揭示了肝細(xì)胞癌中RMP高表達(dá)預(yù)示肝癌切除手術(shù)后預(yù)后較不理想；同時(shí)，其高表達(dá)預(yù)示術(shù)后輔助性TACE具有有效性。因此，本發(fā)明建立了一種基于RMP的肝細(xì)胞癌的術(shù)后預(yù)后方法。
【專利說(shuō)明】RNA聚合酶I I第五亞基調(diào)節(jié)蛋白在制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌預(yù)后或輔助性TACE預(yù)后的試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】；具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白(RMP)用于評(píng)估原發(fā)性肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后不良及輔助性TACE療效的標(biāo)記應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)地區(qū)，每年約有全球一半的新發(fā)病例發(fā)生在中國(guó)。肝細(xì)胞癌(HepatoCellular Carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌中常見(jiàn)的病理類型，所占比例約為70-85%。目前手術(shù)切除是原發(fā)性肝癌治療的首選治療方式。但是原發(fā)性肝癌手術(shù)切除后的高復(fù)發(fā)率仍然是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不佳的主要因素。肝癌術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞(Adjuvant transcatheterarterial chemoembolization, Adjuvant TACE)是臨床上常用的預(yù)防肝癌手術(shù)切除術(shù)后的復(fù)發(fā)的方法之一。但因?yàn)槠淇赡苡绊懶g(shù)后殘余肝臟的功能，所以其療效尚存爭(zhēng)議。目前臨床上認(rèn)為存在肝癌復(fù)發(fā)高危因素的患者(例如，腫瘤直徑大于5厘米，有門(mén)靜脈癌栓形成等)應(yīng)該接受輔助性TACE，并且可以獲益。但是這種分類方法存在一定弊端，有一些患者可能存在肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，但是尚未達(dá)到應(yīng)用輔助性TACE的標(biāo)準(zhǔn)，就可能造成遺漏。因此需要更加細(xì)致的分子分型，來(lái)建立多種指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)的體系，來(lái)彌補(bǔ)單一指標(biāo)的不足(Wang Z, Li Z, Ji Y.Postoperative transcatheter arterialchemoembolization should be recommended in the hepatocellular carcinomatreatment guidelines of the American Association for the Study of LiverDiseases.Hepatology2011;54:1489-149)。
[0003]RMP (RPB5-mediating protein)是 RNA 聚合酶 II (RNA polymerase 11, RNAP II)第5亞基的調(diào)節(jié)蛋白，又名C19orf2或URI。最早由Cheong等采用Far-Western印跡方法，以32P標(biāo)記的重組人RPB5探針從肝癌細(xì)胞株cDNA文庫(kù)中篩查得到。已有研究表明，RMP是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，并且在卵巢癌(Theurillat JP,MetzlerSC, et al.URI is an oncogene amplified in ovarian cancer cells and is requiredfor their survival.Cancer Cell2011 ;19:317_332)等癌組織中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)。
[0004]然而，本領(lǐng)域目前不清楚RMP與肝癌術(shù)后輔助性TACE的相關(guān)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白在制備肝細(xì)胞癌預(yù)后評(píng)估或輔助性TACE預(yù)后評(píng)估的試劑中的應(yīng)用。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，提供RNA聚合酶11第五亞基調(diào)節(jié)蛋白的用途，用于制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估或進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效(預(yù)后)評(píng)估的診斷試劑。
[0007]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估或進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的試劑盒，所述試劑盒中包括:特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑。
[0008]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，所述的特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白的抗體。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，所述的抗體是多克隆抗體。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括:攜帶有可檢測(cè)信號(hào)分子的檢測(cè)抗體(二抗)。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)信號(hào)分子選自(但不限于):生物素、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括:免疫組化試劑。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的免疫組化試劑包括:顯色試劑，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修復(fù)液，封閉液，PBS,中性樹(shù)脂。
[0014]在本發(fā)明的另一方面，提供特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑的用途，用于制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估或進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的試劑盒。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白的抗體。
[0016]在本發(fā)明的另一方面，提供一種進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估的方法，所述方法包括:
[0017](I)應(yīng)用所述的試劑盒檢測(cè)受試者離體肝癌組織中測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平；
[0018](2)分析蛋白表達(dá)水平；
[0019]若測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平高表達(dá)，則該受試者預(yù)后不理想。
[0020]在本發(fā)明的另一方面，提供一種進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的方法，所述方法包括:
[0021](I)應(yīng)用所述的試劑盒檢測(cè)受試者離體肝癌組織中測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平；
[0022](2)分析蛋白表達(dá)水平；
[0023]若測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平高表達(dá)，則該受試者適合進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞。
[0024]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1、肝癌臨床樣本中RMP免疫組化結(jié)果對(duì)比圖。
[0026]圖1A是利用免疫組化方法，檢測(cè)在肝癌臨床樣本(278例)中癌旁組織，癌組織及門(mén)靜脈癌栓(20例)中RMP的表達(dá)情況。
[0027]圖1B是各組樣本中免疫組化評(píng)分情況。[0028]圖2、RMP與肝癌術(shù)后生存期的關(guān)系。圖為根據(jù)免疫組化評(píng)分結(jié)果，肝癌組織中高低表達(dá)RMP患者的手術(shù)切除后生存曲線。
[0029]圖3、RMP可以判斷肝癌術(shù)后輔助性TACE的療效。
[0030]其中圖3A在RMP高表達(dá)的患者中肝癌術(shù)后輔助性TACE的療效；圖3B是在RMP低表達(dá)的患者中肝癌術(shù)后輔助性TACE的療效。
【具體實(shí)施方式】
[0031]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌中RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白(RMP)高表達(dá)預(yù)示肝癌切除手術(shù)后預(yù)后較不理想；同時(shí)，其高表達(dá)預(yù)示術(shù)后輔助性TACE具有有效性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明建立了一種基于RMP的肝細(xì)胞癌的術(shù)后預(yù)后方法。
[0032]本發(fā)明的首要目的在于提供一種RMP可以用于評(píng)估原發(fā)性肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后不良及輔助性TACE療效的標(biāo)記，以解決目前對(duì)肝細(xì)胞癌的生物學(xué)診斷和術(shù)后輔助性TACE療效缺少合適的生物學(xué)標(biāo)記的問(wèn)題。
[0033]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，建立一種檢測(cè)試劑盒，所述的試劑盒中含有特異性檢測(cè)RMP表達(dá)水平的試劑。
[0034]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的特異性檢測(cè)RMP表達(dá)水平的試劑是抗RMP的抗體。
[0035]制備抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。本發(fā)明的抗體可以是對(duì)RMP具有特異性的單克隆抗體。單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人,Nature256;495, 1975;Kohler 等人,Eur.J.1mmunol.6:511, 1976;Kohler 等人,Eur.J.1mmunol.6:292, 1976;Hammerling 等 人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas, Elsevier, N.Y.，1981)。所述單克隆抗體可以利用RMP蛋白或蛋白片段或功能區(qū)，通過(guò)免疫技術(shù)獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。
[0036]本發(fā)明的抗體也可以是對(duì)RMP蛋白具有特異性的多克隆抗體。所述的多克隆抗體可通過(guò)常規(guī)的方法來(lái)制備,例如,可通過(guò)將所述的RMP蛋白導(dǎo)入動(dòng)物中來(lái)獲得,例如,將RMP蛋白與弗氏佐劑按照適當(dāng)比例(如1:1)混合后免疫動(dòng)物。免疫方法可使用動(dòng)物皮下注射。所述動(dòng)物可選自兔、羊、牛等。也可以是商品化的抗體，例如所述的多克隆抗體是Proteintech 的產(chǎn)品。
[0037]在獲得了特異性檢測(cè)RMP蛋白表達(dá)水平的試劑后，可以方便地制備出用于特異性檢測(cè)RMP蛋白的檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒中除了含有所述抗體以外，還可以包含:攜帶有可檢測(cè)信號(hào)分子的檢測(cè)抗體(用于與抗RMP抗體結(jié)合)，以及疫組化試劑。所述的免疫組化試劑包括但不限于:顯色試劑，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修復(fù)液，封閉液，PBS,中性樹(shù)月旨等。
[0038]如本文所用，所述的“可檢測(cè)信號(hào)分子”是指用于確定待檢測(cè)樣品中RMP蛋白的存在與否以及存在的量的標(biāo)志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的特異性抗體和檢測(cè)抗體后，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)用于與檢測(cè)抗體結(jié)合來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的各種可檢測(cè)信號(hào)分子。例如，可檢測(cè)信號(hào)分子可以選自:辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶或葡萄糖淀粉酶。
[0039]當(dāng)采用如上所示的一些酶作為可檢測(cè)信號(hào)分子時(shí)，還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物，從而可通過(guò)顯色等方式來(lái)報(bào)導(dǎo)可檢測(cè)信號(hào)分子的存在情況或者存在量。所述的底物例如:用于辣根過(guò)氧化物酶的鄰苯二胺(oro)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP);等等。本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的可檢測(cè)信號(hào)分子的種類和特性，選擇適宜的底物。
[0040]基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，可以利用多種免疫學(xué)相關(guān)方法來(lái)檢測(cè)樣品中RMP蛋白的表達(dá)量，這些方法均被包含在本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括步驟:通過(guò)免疫組化檢測(cè)切除的肝細(xì)胞癌患者術(shù)后石蠟包埋的肝癌及癌旁正常肝組織中RMP表達(dá)水平并對(duì)染色結(jié)果評(píng)分，根據(jù)其免疫組化評(píng)分結(jié)果，判斷該患者預(yù)后及肝切除術(shù)后輔助性TACE的療效，指導(dǎo)肝癌患者術(shù)后的個(gè)體化治療。
[0041]綜上，根據(jù)RMP的表達(dá)水平，對(duì)肝癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明首次提出利用RMP的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)并預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等事件，并判斷預(yù)后，對(duì)于肝細(xì)胞癌病人術(shù)后監(jiān)控和序貫治療也具有重要的指導(dǎo)意義。
[0042]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0043]實(shí)施例1、RMP在肝癌組織樣品中的表達(dá)
[0044]在東方肝膽外科醫(yī)院選取278例肝細(xì)胞癌手術(shù)切除樣本和20例門(mén)靜脈癌栓樣本。278例樣本的特征參數(shù)如表I所示。
[0045]表1、試驗(yàn)組患者的特征參數(shù)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白的用途，用于制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估或進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的診斷試劑。
2.一種用于進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估或進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括:特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白的抗體。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗體是多克隆抗體。
5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括:攜帶有可檢測(cè)信號(hào)分子的檢測(cè)抗體。
6.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括:免疫組化試劑。
7.特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑的用途，用于制備進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估或進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的試劑盒。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的特異性檢測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白的抗體。
9.一種進(jìn)行肝細(xì)胞癌術(shù)后預(yù)后評(píng)估的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)應(yīng)用權(quán)利要求2-6任一所述的試劑盒檢測(cè)受試者離體肝癌組織中測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平； (2)分析蛋白表達(dá)水平； 若測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平高表達(dá)，則該受試者預(yù)后不理想。
10.一種進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞療效評(píng)估的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)應(yīng)用權(quán)利要求2-6任一所述的試劑盒檢測(cè)受試者離體肝癌組織中測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平； (2)分析蛋白表達(dá)水平； 若測(cè)RNA聚合酶II第五亞基調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平高表達(dá)，則該受試者適合進(jìn)行術(shù)后輔助性經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103852585SQ201410125868
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】王紅陽(yáng), 董立巍, 張建, 談冶雄 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)