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一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針及其制備方法和用途，該探針基于多個金納米顆粒聚集導(dǎo)致吸光值變化。該探針主要有兩大部分組成，其一為生物功能化的磁珠納米微球顆粒，其二為金納米顆粒復(fù)合溶液，其特征為含有檢測抗體(Ab2)或核酸適配體及具有生物酶活性物質(zhì)表面修飾的磁珠納米顆粒和可被上述酶催化的底物及金納米顆粒。該超高靈敏度探針能與疾病生物標(biāo)識物高效識別，附著于磁珠納米微球顆粒表面的具有生物酶活性物質(zhì)可以將其可催化的底物降解為帶正電的產(chǎn)物，引起多個金納米顆粒的聚集，從而導(dǎo)致金納米顆粒溶液吸光值的變化。本發(fā)明方法大大提高了疾病生物標(biāo)識物的檢測靈敏度，并同時具有設(shè)備簡易、操作簡單、且能批量檢測的優(yōu)點。
【專利說明】一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超局靈敏度?米針及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其制備方法及所屬納米材料用于腫瘤等疾病生物標(biāo)識物、或其他疾病病原體檢測應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)工程以及納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在疾病體外診斷方面，高特異性、高靈敏度和高通量特性的檢測技術(shù)是人們一直追求的目標(biāo)。新的快速檢測方法的建立，簡化了操作流程，降低檢測成本，提高了檢測的時效性和準(zhǔn)確性。人們利用病原體的快速檢出技術(shù)可以掌握傳染病的流行狀況，這對及早做出正確的臨床決策意義重大，然而目前在臨床生物標(biāo)志物檢測上廣泛應(yīng)用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法(以下簡稱ELISA)，由于其中等程度的敏感性，只有生物標(biāo)志物的水平已經(jīng)達(dá)到臨界閾值濃度后才能檢測，限制了其用于疾病早期檢測應(yīng)用。再者，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的檢測技術(shù)在近幾年層出不窮，雖然PCR技術(shù)有著超高的靈敏度，然而同時，該技術(shù)需要昂貴的實驗設(shè)備、試劑和技術(shù)工人，這些因素大大限制了其廣泛應(yīng)用，尤其是在偏遠(yuǎn)地區(qū)如發(fā)展中國家。因此臨床上對于可替代PCR技術(shù)的超高靈敏檢測方法的需求尤為緊迫。正如20世紀(jì)70年代的微米技術(shù)一樣，納米技術(shù)將成為21世紀(jì)的主導(dǎo)技術(shù)，為生物診療領(lǐng)域的發(fā)展提供了很大空間。目前光、磁和電響應(yīng)納米粒子已經(jīng)廣泛應(yīng)用于納米醫(yī)學(xué)、分子影像學(xué)等領(lǐng)域。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針；
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針的制備方法；
[0005]本發(fā)明的再一目的是提供一種利用所述的超高靈敏度探針作為疾病標(biāo)識物或病原體檢測系統(tǒng)的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]—種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征為含有檢測抗體或核酸適配體及具有生物酶活性物質(zhì)表面修飾的磁珠納米粒子(0.lmg/ml-5mg/ml,更優(yōu)選的較窄范圍為0.lmg/ml-1.2mg/ml)，和可被上述酶催化的底物(0.1 μ M-100 μ M，更優(yōu)選的較窄范圍為10μΜ-50μΜ)，及金納米顆粒溶液(ΙηΜ-ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選的較窄范圍為InM-1OnM)。
[0008]其中，所述的磁珠納米微球顆粒包括磁性納米顆粒、碳納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、乳膠體納米顆粒、陶瓷納米顆粒、聚合物納米顆粒。本發(fā)明優(yōu)選采用磁珠納米微球顆粒。
[0009]其中，所述的金納米顆粒包括金納米粒子、金納米棒、金納米星、金納米囊,金納米籠或金納米殼中的至少一種。[0010]其中，所述的抗體或核酸適配體，為一種或多種檢測抗體或核酸適配體，其根據(jù)檢測靶標(biāo)物質(zhì)而定。所述的抗體，其為鼠源或人源或羊源或其它動物來源，或為基因工程抗體，如人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體等。本發(fā)明優(yōu)選鼠源單克隆抗體。
[0011]其中，所述的將具有酶活性功能的物質(zhì)與納米微球顆粒通過化學(xué)偶聯(lián)的方式進行結(jié)合，所述偶聯(lián)可以是炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法等。本發(fā)明優(yōu)選采用活潑酯法。
[0012]其中，所述的具有酶活性物質(zhì)包括羧酸酯酶類、硫酯酶類、磷酸單酯酶類磷、磷酸二酯酶類、硫磷酸酯酶等。本發(fā)明優(yōu)選采用乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,以下稱AChE)。
[0013]其中，所述的可以被具有酶活性物質(zhì)所催化的底物包括羧酸酯類、硫酯類、磷酸單酯類、磷酸二酯類、硫磷酸酯類等。本發(fā)明優(yōu)選采用硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine)。
[0014]其中，將抗體或核酸適配體與具有酶活性物質(zhì)通過化學(xué)偶聯(lián)的方式進行結(jié)合，所述偶聯(lián)可以是炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法等，本發(fā)明優(yōu)選采用炔烴-疊氮法、活潑酯法。
[0015]用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針制備方法，包括
[0016]I)磁珠納米微球顆粒溶液中加入過量的酶活性物質(zhì)，反應(yīng)0.5-3小時后，分離去除過量的酶活性物質(zhì)。后加入可發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)的基團。
[0017]2)將檢測抗體或核酸適配體加入化學(xué)偶聯(lián)基團，該基團可與I)中的基團反應(yīng)。室溫下反應(yīng)0.5-3小時,利用離心方法去除未結(jié)合的基團。
[0018]3)將I)與2)分別得到的產(chǎn)物混合，得到生物功能化的磁珠納米微球顆粒。
[0019]4)混有可被酶活性物質(zhì)催化的相關(guān)底物和金納米顆粒溶液混合，即得到金納米顆粒復(fù)合溶液。
[0020]5)生物功能化的磁珠納米微球顆粒和金納米顆粒復(fù)合溶液即組成了用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針。
[0021]更佳地，該用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針的制備方法，包括以下步驟:
[0022]I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠納米顆粒(10mg/mL)于小離心管中，借助于磁力架，用鹽酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的乙酰膽堿酯酶(lmg/mL)，渦旋混勻30秒。后將該混合物置于振蕩器中反應(yīng)2小時，反應(yīng)條件為室溫。在開始的30分鐘，每隔5分鐘將小離心管渦旋振蕩15秒。剩余的90分鐘，每15分鐘將小離心管渦旋振蕩15秒，從而得到結(jié)合了乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒。后加入5 μ LNHS活化的疊氮基團(ImM)，室溫反應(yīng)30分鐘，從而得到偶聯(lián)了疊氮基和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒。
[0023]2)取ImL檢測抗體(lmg/mL)，抗體緩沖環(huán)境為PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DBCO(dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗體中，DBCO與抗體的摩爾比為50:1。室溫反應(yīng)30分鐘后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以終止反應(yīng)，Tris終濃度為50mM，終止反應(yīng)持續(xù)5分鐘。即得到偶聯(lián)了 DBCO的抗體溶液。
[0024]3)取10 μ L偶聯(lián)了 DBCO的抗體溶液(lmg/mL)加入到ImL偶聯(lián)了疊氮基和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒(lmg/mL)中，室溫反應(yīng)2小時，即得到了偶聯(lián)了抗體和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒。
[0025]4)硫代乙酰膽堿(20 μ M)和金納米顆粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即為金納米顆粒
復(fù)合溶液。
[0026]本發(fā)明研制出一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針及其制備方法。該探針主要有兩大部分組成，其一為生物功能化的磁珠納米微球顆粒，其二為金納米顆粒復(fù)合溶液，其特征為含有檢測抗體或核酸適配體及具有生物酶活性物質(zhì)表面修飾的磁珠納米粒子和可被上述酶催化的底物及金納米顆粒。用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針能與疾病標(biāo)識物或病原體高效識別，附著于磁珠納米微球顆粒表面的具有生物酶活性物質(zhì)可以將其可催化的底物降解為帶正電的產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以引起金納米顆粒的聚集，從而導(dǎo)致金納米顆粒溶液吸光值的變化。吸光值變化的程度與樣品中的生物標(biāo)識物的濃度成比例。并且吸光值的變化肉眼可見。
[0027]磁珠納米顆粒具有較高的惰性，苛刻的環(huán)境對其影響小，同時其具有較強的人工可修飾性，在其表面修飾一定的化學(xué)基團，從而可以進一步偶聯(lián)生物活性物質(zhì)，對其進行功能性改造。磁珠納米顆粒還具有較大的體表面積，每個磁珠顆粒上可以附著巨大數(shù)量的生物活性物質(zhì)，從而起到信號放大的作用，實現(xiàn)對較低含量靶標(biāo)物質(zhì)的檢出。在金納米顆粒溶液中，金納米顆粒表面附著一層檸檬酸鹽，表面帶有均勻的負(fù)電荷，是金納米顆粒均勻地分布在溶液中。當(dāng)有打破這一電荷平衡的物質(zhì)(帶正電荷的物質(zhì)如巰基基團)出現(xiàn)時，電荷平衡被打破并導(dǎo)致金納米顆粒的聚集，這個過程可以使得金納米顆粒溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，同時溶液的吸收光譜發(fā)生變化。吸光值變化的程度與樣品中的生物標(biāo)識物的濃度成比例。本發(fā)明方法大大提高了疾病生物標(biāo)識物的檢測靈敏度，并同時具有設(shè)備簡易、操作簡單、且能批量檢測的優(yōu)點。
[0028]本發(fā)明的有益效果:
[0029]本發(fā)明在固相納米微球上進行生物功能化修飾，附著于其上的大量酶活性物質(zhì)催化其底物產(chǎn)生可以對金納米顆粒溶液造成吸光值變化的產(chǎn)物，具有極高的靈敏度，實驗證明，相比于ELISA試劑盒，靈敏度提高約IO3倍。
[0030]另外，簡單的檢測手段也是本發(fā)明的一大亮點，肉眼對金納米顆粒溶液顏色變化的觀察與儀器對金納米顆粒溶液吸光值變化的測量具有極高的符合度，即用肉眼即可觀測到極低濃度待檢物質(zhì)的檢出。
[0031]再者，該檢測探針的檢測方法簡單，所用試劑耗材成本低，反應(yīng)載體與ELISA試劑盒相同，微孔板即可滿足條件，從而實現(xiàn)對待檢物質(zhì)進行高通量檢測，也更利于在臨床檢測上的推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為生物功能化的磁珠納米微球顆粒構(gòu)建示意圖。
[0033]圖2為乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿示意圖(a)和利用該超高靈敏度探針檢測原理圖(b)。
[0034]圖3為20 μ M硫代乙酰膽堿加入到不同濃度超高靈敏度探針中引起的顏色變化(a)及吸光值的變化(b)及700nm(A700)和520nm(A520)光波長吸光值比值(c)
[0035]圖4為20 μ M硫代乙酰膽堿加入到該超高靈敏度檢測探針(1.0 X 104particles/mL(以磁珠納米微球計))引起的金納米顆粒聚集的透射電鏡照片
[0036]圖5為標(biāo)準(zhǔn)病原體用該超高靈敏度探針檢測的肉眼觀測(a)及用該超高靈敏度探針檢測的吸光值變化(b)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下簡稱RT-PCR)檢測(c)及ELISA試劑盒檢測(d)結(jié)果(以腸道病毒71型病毒(以下簡稱EV71)為例)
[0037]圖6為探針檢測能力結(jié)果圖；
[0038]圖7為臨床樣本(EV71感染者、流感患者、健康人群)用該超高靈敏度探針檢測(a)和ELISA試劑盒檢測結(jié)果(b)。
【具體實施方式】
[0039]以下通過具體的制備例和實施例可使本發(fā)明得到更清楚地說明:
[0040]一、制備例⑴:以下步驟中的所使用的化學(xué)物質(zhì)為市售商品。
[0041 ] 一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針的制備及用于疾病病原體(以EV71為例)的檢測方法，包括以下步驟:
[0042]I)取100 μ LNHS活化的磁珠納米顆粒(10mg/mL)于小離心管中，借助于磁力架，用鹽酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的乙酰膽堿酯酶(lmg/mL)，渦旋混勻30秒。后將該混合物置于振蕩器中反應(yīng)2小時，反應(yīng)條件為室溫。在開始的30分鐘，每隔5分鐘將小尚心管潤旋振蕩15秒。剩余的90分鐘，每15分鐘將小尚心管潤旋振蕩15秒，從而得到結(jié)合了乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒。后加入5 μ LNHS活化的疊氮基團(ImM)，室溫反應(yīng)30分鐘，從而得到偶聯(lián)了疊氮基和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒。
[0043]2)取ImL抗EV71的檢測抗體(lmg/mL)，抗體緩沖環(huán)境為PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DB⑶(IOmM)加入到抗體中，DBCO與抗體的摩爾比為50:1。室溫反應(yīng)30分鐘后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以終止反應(yīng)，Tris終濃度為50mM，終止反應(yīng)持續(xù)5分鐘。即得到偶聯(lián)了 DBCO的抗體溶液。
[0044]3)取10 μ L偶聯(lián)了 DBCO的抗體溶液(lmg/mL)加入到ImL偶聯(lián)了疊氮基和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒(lmg/mL)中，室溫反應(yīng)2小時，即得到了偶聯(lián)了抗體和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒(圖1)。
[0045]4)硫代乙酰膽堿(20 μ M)和金納米顆粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即為金納米顆粒
復(fù)合溶液。
[0046]5)將抗 EV71 的捕獲抗體(Abl)溶于 100mMNa2C03-NaHC03 (pH9.6)緩沖液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C過夜或常溫4小時后，加入PBS沖洗3次，加I %牛血清白蛋白(BSA)進行封閉(37°C，I小時)。
[0047]6)將標(biāo)準(zhǔn)EV71病原體用PBS或者健康人咽拭子樣本(以下簡稱HTS)稀釋不同濃度，用單獨PBS或HTS作為陰性對照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下溫育I小時。
[0048]7)PBS沖洗3次，每孔加入100 μ L抗體-乙酰膽堿酯酶-磁珠納米顆粒溶液(0.lmg/mL)，在37°C下溫育20分鐘。
[0049]8) PBST沖洗3次，每孔加入100 μ L硫代乙酰膽堿(20 μ Μ)和金納米顆粒(15nm，2.3nM)，用讀板儀讀取520nm和700nm光波長吸光值。
[0050]制備例(2)[0051]不含有磁珠納米顆粒微球探針的制備及用于疾病病原體(以EV71為例)的檢測方法，包括以下步驟:
[0052]I)取100 μ L溶解于PBS中的乙酰膽堿酯酶(lmg/mL)，加入5 μ LNHS活化的疊氮基團(ImM)，室溫反應(yīng)30分鐘。
[0053]2)取ImL抗EV71的檢測抗體(lmg/mL)，抗體緩沖環(huán)境為PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DB⑶(IOmM)加入到抗體中，DBCO與抗體的摩爾比為50:1。室溫反應(yīng)30分鐘后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以終止反應(yīng)。
[0054]3) Tris終濃度為50mM，終止反應(yīng)持續(xù)5分鐘。即得到偶聯(lián)了 DBCO的抗體溶液取
10μ L偶聯(lián)了 DBCO的抗體溶液(lmg/mL)加入到ImL偶聯(lián)了疊氮基和乙酰膽堿酯酶的磁珠納米顆粒(lmg/mL)中，室溫反應(yīng)2小時，即得到了偶聯(lián)了抗體和乙酰膽堿酯酶。
[0055]4)硫代乙酰膽堿(20 μ M)和金納米顆粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即為金納米顆粒
復(fù)合溶液。
[0056]5)將抗 EV71 的捕獲抗體(Abl)溶于 100mMNa2C03_NaHC03 (ρΗ9.6)緩沖液中(4 μ g/mL)，取到96孔板孔中(100 μ L/孔)，4°C過夜或常溫4小時后，加入PBS沖洗3次，加I %牛血清白蛋白(BSA)進行封閉(37°C，I小時)。
[0057]6)將標(biāo)準(zhǔn)EV71病原體用PBS或者健康人咽拭子樣本(以下簡稱HTS)稀釋不同濃度，用單獨PBS或HTS作為陰性對照，加入到96孔板孔中(100 μ L/孔)，在37°C下溫育I小時。
[0058]7) PBS沖洗3次，每孔加入100 μ L抗體-乙酰膽堿酯酶溶液，在37°C下溫育20分鐘。
[0059]8) PBST沖洗3次，每孔加入100 μ L硫代乙酰膽堿(20 μ Μ)和金納米顆粒(15nm，
2.3nM)，用讀板儀讀取520nm和700nm光波長吸光值。
[0060]二、實施例:
[0061]1、將20μΜ硫代乙酰膽堿加入一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針溶液中監(jiān)測其變化。由于在磁珠納米微球顆粒上偶聯(lián)了乙酰膽堿酯酶，加入的硫代乙酰膽堿可以被酶催化降解為硫代膽堿，硫代膽堿會與金納米表面殘留的檸檬酸鹽上的負(fù)電荷相互作用，電荷平衡被打破，會導(dǎo)致金納米顆粒的聚集，這個過程可以使得金納米顆粒溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)紫色(圖3a)，同時溶液的吸收光譜發(fā)生變化(圖3b)。在透射電鏡的觀察下，也可以明顯看到金納米顆粒的聚集(圖4)。
[0062]2、用該超高靈敏度探針檢測標(biāo)準(zhǔn)病原體，操作步驟見制備例。另與其他檢測手段比較?？梢钥吹紼LISA試劑盒檢測下限約為IO8-1O9拷貝/mL(圖5d)，RT-PCR的檢測下限約為IO3拷貝/mL(圖5c)，該超高靈敏度探針的檢測下限約為IO3-1O4拷貝/mL(圖5b)，該超高靈敏度探針檢測標(biāo)準(zhǔn)病原體結(jié)果用肉眼可以觀測的檢測下限與儀器測量吸光值的變化具有極高的符合度圖(5a)。使用該探針檢測，僅用肉眼觀測就可以達(dá)到接近于PCR的檢測水平。
[0063]3、用缺失磁珠納米微球顆粒部分的超高靈敏度探針檢測標(biāo)準(zhǔn)病原體，檢測步驟與實施例2相同，可以看到此時的探針檢測能力約為IO5-1O6拷貝/mL(圖6)。
[0064]4、一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針檢測臨床樣本(EV71感染者、流感患者、健康人群)，其中臨床樣本為咽拭子。操作步驟見制備例。所檢測的EV71感染者樣本為經(jīng)過RT-PCR確證過的陽性樣本，流感患者被確證為感染了甲型流感病毒。從用該探針和利用ELISA試劑盒檢測的結(jié)果可以明顯看出=ELISA試劑盒作為一種中等靈敏度的檢測方法，對所有陽性樣本均不能檢出，對流感患者和健康人群也有較高的特異性(圖7b);該用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針由于具有著接近于PCR的檢出能力，在34份陽性標(biāo)本中，檢測出28份為陽性，對于5份流感患者和5份健康人群咽拭子標(biāo)本均檢測為陰性，特異性高(圖7a)。
[0065]本發(fā)明人研制出的一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，該探針具有極高的靈敏度，靈敏度接近于RT-PCR，靈敏度比ELISA試劑盒高約IO3倍，結(jié)果判定簡單，肉眼即可判定，并且具有優(yōu)良的特異性。該檢測探針的檢測方法簡單，所用試劑耗材成本低，反應(yīng)載體與ELISA試劑盒相同，微孔板即可滿足條件，從而實現(xiàn)對待檢物質(zhì)進行高通量檢測，也更利于在臨床檢測上的推廣應(yīng)用。本發(fā)明所用的磁珠納米微球顆粒部分亦可缺失，從而使得檢測方法更為簡單，并具有比ELISA試劑盒靈敏度高約IO2倍的靈敏度。在磁珠納米微球顆粒部分缺失的情況下，可以將檢測抗體或核酸適配體直接標(biāo)記生物酶活性物質(zhì)(類似于ELISA試劑盒中的酶標(biāo)記抗體)，后續(xù)檢測步驟相同，同樣需要加入可以被酶活性物質(zhì)催化的底物和金納米顆粒，生成的帶正電荷的底物，可以高效的讓金納米顆粒聚集，使得金納米顆粒溶液吸光值發(fā)生變化，從而達(dá)到對待檢物質(zhì)的高效檢出。雖然缺失了磁珠納米微球?qū)贵w或核酸適配體的高效富集，損失了一定的靈敏度，但利用金納米顆粒的信號放大效果，仍然能夠達(dá)到比ELISA試劑盒靈敏度高約IO2的檢測效果。
[0066]本發(fā)明所用的磁珠納米微球顆粒部分包括并不限于磁性納米顆粒，其他更多可選納米顆粒包括但不限于碳納米顆粒、二氧化娃納米顆粒、乳膠體納米顆粒、陶瓷納米顆粒、聚合物納米顆粒等，制備方法類似。本發(fā)明所用的金納米顆粒包括金納米粒子、金納米棒、金納米星、金納米囊，金納米籠或金納米殼等。其他更多可選酶活性功能的物質(zhì)包括并不限于乙酰膽堿酯酶等，其他更多可選偶聯(lián)方法包括并不限于炔烴-疊氮法、活潑酯法等，制備方法類似。
【權(quán)利要求】
1.一種用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，所述的探針包括檢測抗體或核酸適配體及0.5mg/ml-5mg/ml具有生物酶活性物質(zhì)表面修飾的磁珠納米顆粒,和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物,及InM-1OOnM金納米顆粒溶液；或所述的探針不包括磁珠納米顆粒，即該探針僅包括檢測抗體或核酸適配體及具有生物酶活性物質(zhì)，和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物，及InM-1OOnM金納米顆粒溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，所述的磁珠納米微球顆粒包括磁性納米顆粒、碳納米顆粒、二氧化娃納米顆粒、乳膠體納米顆粒、陶瓷納米顆?；蚓酆衔锛{米顆粒中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，所述的具有酶活性物質(zhì)包括羧酸酯酶類、硫酯酶類、磷酸單酯酶類磷、磷酸二酯酶類、硫磷酸酯酶、乙酰膽堿酯酶中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，所述的抗體或核酸適配體，為一種或多種檢測抗體或核酸適配體。
5.如權(quán)利要求3所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，可被權(quán)利要求3中酶活性物質(zhì)催化的底物，包括羧酸酯類、硫酯類、磷酸單酯類、磷酸二酷類或硫憐Ife酷。
6.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，將具有酶活性功能的物質(zhì)與納米微球顆粒通過化學(xué)偶聯(lián)的方式進行結(jié)合，所述偶聯(lián)包括炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法。
7.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針，其特征在于，將抗體或核酸適配體與具有酶活性物質(zhì)通過化學(xué)偶聯(lián)的方式進行結(jié)合，所述偶聯(lián)包括炔烴-疊氮法、MBS法、戊二醛法、活潑酯法、碳二亞胺法、鹵代硝基苯法及亞胺酸脂法。
8.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針制備方法，包括 1)磁珠納米微球顆粒溶液中加入過量的酶活性物質(zhì)，反應(yīng)0.5-3小時后，分離去除過量的酶活性物質(zhì)，后加入可發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)的基團； 2)將檢測抗體或核酸適配體加入可與I)中所述的基團反應(yīng)的基團，室溫下反應(yīng)0.5-3小時，利用離心方法去除未結(jié)合的基團； 3)將I)與2)分別得到的產(chǎn)物混合，得到生物功能化的磁珠納米微球顆粒； 4)混有可被酶活性物質(zhì)催化的相關(guān)底物和金納米顆粒溶液混合，即得到金納米顆粒復(fù)合溶液； 5)生物功能化的磁珠納米微球顆粒和金納米顆粒復(fù)合溶液即組成了用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針。
9.如權(quán)利要求8所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針制備方法，包括: DNHS活化的磁珠納米微球顆粒溶液中加入過量的乙酰膽堿酯酶，反應(yīng)0.5-3小時后，分離去除過量的乙酰膽堿酯酶，后加入NHS活化的疊氮基團； 2)將檢測抗體或核酸適配體與NHS活化的DBCO混合，室溫下反應(yīng)30分鐘，用三羥甲基氨基甲烷終止該反應(yīng)，終止反應(yīng)5分鐘；利用膜過濾技術(shù)將抗體或核酸適配體與未結(jié)合的DBCO分離； 3)磁珠納米微球顆粒-乙酰膽堿酯酶-疊氮基復(fù)合物溶液中加入結(jié)合了DBCO的檢測抗體或核酸適配體溶液，得到納米微球顆粒-乙酰膽堿酯酶-檢測抗體或核酸適配體復(fù)合物，即生物功能化的納米微球顆粒； 4)混有可被乙酰膽堿酯酶催化的硫代乙酰膽堿和金納米顆粒溶液混合，即得到金納米顆粒復(fù)合溶液； 5)生物功能化的磁珠納米微球顆粒和金納米顆粒復(fù)合溶液即組成了用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針。
10.如權(quán)利要求1所述的用于疾病標(biāo)志物或病原體檢測的超高靈敏度探針的用途，其用于疾病生物標(biāo)識物 或病原微體檢測或制備檢測試劑。
【文檔編號】G01N21/31GK103926246SQ201410171736
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】劉剛, 陳小元, 劉定斌, 王占通, 楊彩霞 申請人:廈門大學(xué)