專利名稱：一種檢測(cè)ⅱ型志賀毒素的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ELISA試劑盒，具體而言涉及檢測(cè)II型志賀毒素(StxII)的ELISA試劑盒，還涉及該ELISA試劑盒中單克隆抗體S2D8和S2C6的制備和試劑盒的使用方法。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)感染是一種重要的人畜共患病，在世界各地包括發(fā)達(dá)及發(fā)展中國(guó)家都有流行，其感染具有暴發(fā)性、強(qiáng)烈的致病性與致死性等特點(diǎn)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅。EHEC感染可使人患腹灣(Diarrhea)、出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic Colitis, HC),還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)、血栓性血小板減少性紫癒(ThromboricThromobocytopenic Porpura, TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥,特別是HUS可對(duì)患者腎臟造成不可恢復(fù)性的功能損傷，病死率較高。我國(guó)江蘇、安徽及河南三省交界部分地區(qū)于1999-2000年多次暴發(fā)了 EHEC0157:H7感染性腹瀉病并發(fā)急性腎衰，先后共有230例患者發(fā)展成HUS，死亡205人，恢復(fù)者也造成了腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷等后遺癥。另外我國(guó)西部、中原、東北、華北也多次散在發(fā)生過(guò)EHEC疫情，且每年均有流行的報(bào)道。美國(guó)2006年夏季也發(fā)生了由于食用污染的菠菜而導(dǎo)致EHEC 0157:H7感染事件，先后波及26個(gè)州，共有183人發(fā)病，29人引發(fā)HUS，3人死亡，引起世界廣泛關(guān)注。目前對(duì)EHEC感染臨床上缺乏有效的治療和預(yù)防措施，臨床研究表明:抗生素可 促使EHEC釋放致死性志賀毒素，從而使患者并發(fā)HUS的危險(xiǎn)性增加。研究表明，EHEC感染的主要致病機(jī)理可分為兩個(gè)方面，一是由菌體基因組毒力島LEE(Locus of Enterocyte Effacement)編碼的多種致病因子所介導(dǎo)的粘附抹平機(jī)制(Attaching and Effacing, A/E),通過(guò)A/E機(jī)制,細(xì)菌可破壞腸上皮細(xì)胞,粘附并定植于腸道；二是分泌志賀毒素(Shiga toxin, Stx), Stx可以穿越破損的腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，與其受體-丙糖?；拾贝糋b3或丁糖?；拾贝糋b4結(jié)合，造成腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官的損傷，特別是Gb3受體含量較高的腎臟，受損后易引發(fā)HUS，危及生命；該毒素分為StxI和StxII兩個(gè)亞型，臨床引起HUS的大多為StxII。臨床對(duì)EHEC引起的前期腹瀉和其他病原體所引起的腹瀉在癥狀上不易區(qū)分，抗生素的武斷使用一方面殺死大量的菌體，患者腹瀉癥狀減輕，造成表觀“康復(fù)”的假象，這就使得通過(guò)分離病原體進(jìn)行診斷大多以結(jié)果陰性告終，貽誤了治療的最佳時(shí)機(jī)，另一方面，由于Stx是由整合到EHEC基因組中λ噬菌體基因編碼，抗生素的使用容易使殘存的細(xì)菌進(jìn)入SOS應(yīng)激狀態(tài)，噬菌體從靜止的溶源狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)，在腸道內(nèi)產(chǎn)生大量的Stx毒素，并進(jìn)入血液循環(huán)，使患者發(fā)生HUS。因此，如能在患者的血清、或腹瀉的血便中檢出毒素，則能及時(shí)采取免疫干預(yù)措施。所以對(duì)于EHEC感染的診斷，與其說(shuō)是對(duì)病原體的分離，不如說(shuō)對(duì)毒素的檢出。與發(fā)達(dá)國(guó)家不同，我國(guó)疫情主要集中在衛(wèi)生保健條件較差的農(nóng)村地區(qū)，患者主要是農(nóng)民，就醫(yī)觀念薄弱，大多具有群發(fā)性特點(diǎn)，等到衛(wèi)生機(jī)構(gòu)介入時(shí)，疫情已比較嚴(yán)重；目前，與人居住環(huán)境關(guān)系密切的家畜、家禽帶菌情況較為普遍，并且菌群的毒力基因改變明顯，從Stx1、StxII并存為主逐步演變?yōu)镾txII為主，提示EHEC疫情不可能短期內(nèi)消失。并且我國(guó)農(nóng)村基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)不同程度存在抗生素濫用的現(xiàn)象，也迫切需要一種以毒素分子為靶向的快速、易操作的診斷方法，作為傳統(tǒng)依靠病原體分離進(jìn)行確診的補(bǔ)充。
發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明制備了多株針對(duì)StxII的單克隆抗體，并從中篩選出非競(jìng)爭(zhēng)性的兩株單抗，分別為S2D8和S2C6，制備雙抗體夾心法ELISA試劑盒，用于EHEC感染的毒素診斷。本發(fā)明還公開(kāi)了上述ELISA試劑盒的使用方法，所述試劑盒能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中StxII的含量。本發(fā)明公開(kāi)了上述抗StxII的單克隆抗體S2D8，所述單克隆抗體包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。本發(fā)明所述的單克隆抗體S2D8的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。所述單克隆抗體S2D8的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 所示。本發(fā)明公開(kāi)了上述抗StxII的單克隆抗體S2C6，所述單克隆抗體S2C6包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQ ID N0:1U SEQ ID N0:12所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ ID NO:13, SEQ ID N0:14所示。本發(fā)明所述的單克隆抗體S2C6的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列，分別如序列表中 SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示。所述單克隆抗體S2C6的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ I D NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20所示。本發(fā)明還公開(kāi)了上述單克隆抗體S2D8和S2C6的制備及釣取其基因的方法，主要包括如下步驟:1.抗StxII單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建首先，原核表達(dá)StxII蛋白A亞單位，免疫Balb/c小鼠，首次免疫，StxII蛋白與等體積的福氏完全佐劑混合，腹腔注射；第3周后用等量StxII蛋白與不完全佐劑混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐劑。取免疫后小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，用PEG融合上述細(xì)胞，用HAT選擇培養(yǎng)基重懸，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用間接ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100%陽(yáng)性。2.雜交瘤細(xì)胞輕、重鏈基因的釣取提取分泌單克隆抗體S2D8和S2C6細(xì)胞的RNA，經(jīng)RT-PCR，用特異性引物釣取抗體的輕重鏈基因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序。3.單克隆抗體S2D8和S2C6可變區(qū)氨基酸序列和互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列的分析用www.expasy.0rg在線軟件將單克隆抗體S2D8和S2C6的輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體S2D8的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；單克隆抗體S2C6的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO:12 所示；根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定單克隆抗體S2D8輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示；根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定單克隆抗體S2C6輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和 SEQID NO:20 所示?；诒景l(fā)明上述單克隆抗體S2D8和S2C6輕、重鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活性分子，制備用于StxII表達(dá)水平檢測(cè)、診斷和治療StxII所導(dǎo)致疾病的診斷或治療藥物。本發(fā)明通過(guò)雜交瘤技術(shù)共獲得5株針對(duì)StxII A亞單位的單克隆抗體:S2D8，S2C6，4F5，1G7和11H5，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法，讓上述5株抗體彼此配對(duì)，選出最佳組合以利于StxII毒素檢出，從表I結(jié)果可以看出，只有S2D8/S2C6組合，并且只有當(dāng)S2D8作為包被抗體，而S2C6作為檢測(cè)抗體時(shí)，其檢測(cè)毒素的OD值最高，達(dá)到1.764，而其它組合的OD值均較低。由于上述獲得的5株單抗的表位均位于毒素的A亞單位，當(dāng)兩個(gè)抗體同時(shí)與該抗原結(jié)合時(shí)，存在著空間位阻。而只有當(dāng)S2D8作為捕獲毒素的抗體、且S2C6作為檢測(cè)抗體時(shí)，由于其彼此之間的阻礙最小，因此顯示的OD值也最高，檢測(cè)StxII效果最好。
本發(fā)明還對(duì)單克隆抗體S2D8和S2C6重、輕鏈同種型(Isotype)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示:單克隆抗體S2D8和S2C6的重、輕鏈同種型分別為:重鏈的同種型為G1，而輕鏈的同種型為K。本發(fā)明基于單克隆抗體S2D8和S2C6制備了檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒，所述ELISA試劑盒包括:單克隆抗體S2D8、HRP標(biāo)記的單克隆抗體S2C6、辣根過(guò)氧化物酶底物緩沖液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品StXII(100ug/ml，0.1ml)、陰性對(duì)照樣品BSA、洗液(PBS+0.05%Tween20)。本發(fā)明還公開(kāi)了上述檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒的使用方法，具體步驟如下:I)用 0.1M 的 NaHC03/Na2C03 緩沖液(ρΗ9.6)稀釋抗體 S2D8 至濃度為 10 μ g/ml，加入至96孔酶標(biāo)板，100 μ I/孔，4°C包被過(guò)夜，用PBST (在PBS中加入0.05 %的Tween-20)洗I次，加入5%的牛奶4°C封閉過(guò)夜；2)按合適的稀釋度(1: 2 1: 10)稀釋待測(cè)樣品，加入到包被有抗體S2D8的96孔酶標(biāo)板中，37°C孵育I小時(shí)，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS倍比稀釋純化的 StxII (1000，500，250，125,62.5,31.3，15.6,7.8,3.9,2.0, 1.0)ng/ml,每孔加入100μ 1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)稀釋度設(shè)復(fù)孔；3)用含有I % BSA的PBS按照1: 1000稀釋HRP酶標(biāo)抗體S2C6，于相應(yīng)孔中加入100 μ I酶標(biāo)抗體，于37°C水浴孵育I小時(shí)，用PBST洗滌5次后；
4)每孔中加入100 μ I ΤΜΒ+Η202底物，室溫孵育20分鐘，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸終止反應(yīng)，于450nm處測(cè)定OD值；5)結(jié)果判定:當(dāng)待測(cè)樣品的OD值大于空白孔OD值的2倍的視為陽(yáng)性，待測(cè)樣品中StxII的具體濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。本發(fā)明還對(duì)檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒的靈敏性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示本發(fā)明的試劑盒能夠靈敏的檢測(cè)樣品中StxII的含量，其靈敏度能夠達(dá)到4ng/ml。本發(fā)明檢測(cè)了上述試劑盒對(duì)StxII亞型的敏感性，結(jié)果顯示本發(fā)明所述的試劑盒對(duì)StxIIc和StxIIvha亞型也能進(jìn)行有效的識(shí)別。本發(fā)明試劑盒的有益效果:1、本發(fā)明的ELISA試劑盒，能有效的檢測(cè)出樣品中StxII的含量，其靈敏度達(dá)到4ng/ml。2、本發(fā)明的ELISA試劑盒，不僅能夠識(shí)別StxII毒素，還能有效識(shí)別StxII毒素的亞型 StxIIc 和 StxIIvha。3、本發(fā)明的試劑盒使用方便，質(zhì)量穩(wěn)定，準(zhǔn)確性高，特別有利于基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)快速對(duì)EHEC的診斷，及時(shí)采取措施遏制疫情的蔓延。
圖1從雜交瘤細(xì)胞中抽提的總 RNA ；圖2S2D8重鏈和輕鏈基因PCR擴(kuò)增的電泳圖；圖3S2C6重鏈和輕鏈基因PCR擴(kuò)增的電泳圖；圖4檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒的靈敏性檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式通過(guò)參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一抗StxII單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建1.材料融合蛋白StxIIA-GST, protein G親和層析柱,胎牛血清:北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；無(wú)血清RPMI 1640 =Gibco公司產(chǎn)品；0ΡΤΙ_ΜΕΜ培養(yǎng)基，福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑，顯色試劑TMB =Sigma公司產(chǎn)品；SP2/0細(xì)胞:ATCC引進(jìn)；Balb/c以及C57BL/6小鼠:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；其余試劑均為市購(gòu)。2.方法和結(jié)果(I)融合蛋白StxIIA-GST免疫5周齡雌性Balb/c小鼠，100 μ g/只，首次免疫，100μ g抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，腹腔注射；第3周后用等量抗原與不完全佐劑混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐劑。(2)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合:融合前一周，復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0至OPT1-MEM培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合前3天，將細(xì)胞傳代一次。融合當(dāng)天,收獲骨髓瘤細(xì)胞,并計(jì)數(shù),把5.0X IO7骨髓瘤細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次備用。小鼠經(jīng)第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、處死。無(wú)菌操作取出小鼠脾臟，置滅菌平皿中，分離脾細(xì)胞，計(jì)數(shù)，備用。把等同于小鼠1/2脾臟的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合，1300rpm離心5min，盡可能去除上清液。在1.5分鐘內(nèi)加入1.5md的50%的PEG，邊加邊搖勻；然后在8.5分鐘內(nèi)加入20ml的無(wú)血清培養(yǎng)基，邊加邊搖勻。 把經(jīng)PEG融合的細(xì)胞IOOOrpm離心5分鐘，除去上清液，加150ml的HAT選擇培養(yǎng)基重懸，將融合細(xì)胞接種至無(wú)菌96孔板150 μ I/孔，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，每孔補(bǔ)加100 μ I選擇培養(yǎng)基。(3)雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆:融合后10天，從每孔中吸50 μ I上清，加到包被有StxIIA-GST的96孔ELISA板(用I %的BSA封閉)，室溫孵育1.5小時(shí)；洗2次。稀釋辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠1: 2000，每孔加50 μ I,室溫孵育1.5小時(shí)；洗滌4次。每孔加入100 μ IHRP底物(Η202+ΤΜΒ)，室溫孵育0.5小時(shí)，每孔加入100μ12Μ H2SO4，測(cè)A450nm值。對(duì)于陽(yáng)性克隆，按上述方法檢測(cè)其對(duì)GST標(biāo)簽蛋白的反應(yīng)性，只有與StxIIA-GST融合蛋白結(jié)合而與GST不結(jié)合的抗體克隆才被保留，繼續(xù)下面的實(shí)驗(yàn)。收集陽(yáng)性孔細(xì)胞，重懸于HT選擇培養(yǎng)基中，采用有限稀釋法稀釋細(xì)胞，并種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5天后觀察，對(duì)確定只有一個(gè)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的孔，作ELISA進(jìn)行鑒定。對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，經(jīng)過(guò)3-4次單細(xì)胞分離培養(yǎng)，直至獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞克隆。大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，收集含有抗體的培養(yǎng)上清,用protein G親和層析柱進(jìn)行純化，并透析到PBS中，測(cè)濃度，_20°C凍存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)上述雜交瘤技術(shù)共獲得5株針對(duì)StxII A亞單位的單克隆抗體，分別為S2D8，S2C6，4F5，1G7 和 11H5。實(shí)施例二應(yīng)用雙抗體夾心ELISA選擇最佳抗體配對(duì)通過(guò)雜交瘤技術(shù)實(shí)施例1共獲得5株針對(duì)StxII A亞單位的單克隆抗體:S2D8，S2C6，4F5，1G7和11H5，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法，讓上述5株抗體彼此配對(duì)，選出最佳組合以利于StxII毒素檢出。1.材料NaHC03/Na2C03緩沖液(pH9.6)，Tween-20,牛血清白蛋白，96孔酶標(biāo)板，活化辣根過(guò)氧化物酶:北京泰天和生物科技有限公司；其余試劑均為市購(gòu)。2.方法結(jié)果單抗的包被。用0.1M的NaHC03/Na2C03緩沖液(pH9.6)稀釋抗體濃度至10 μ g/ml,加入至96孔酶標(biāo)板，100 μ I/孔，4°C包被過(guò)夜，用PBST (在PBS中加入0.05 %的Tween-20)洗I次，加入5%的牛奶4°C封閉過(guò)夜，用PBST洗I次，-20°C凍存?zhèn)溆?。單抗與辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)的偶聯(lián)。把單抗透析至PBS中，調(diào)節(jié)濃度至lmg/ml。應(yīng)用北京泰天和生物科技有限公司的產(chǎn)品活化辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行偶聯(lián)，具體操作參照其公司說(shuō)明書(shū)。在HRP標(biāo)記抗體中加入50%的甘油，-20°C凍存?zhèn)溆?。不同抗體組合檢測(cè)StxII步驟如下:用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS稀釋純化的StxII至濃度為10 μ g/ml，每孔加入100 μ 1，于37°C水浴孵育I小時(shí)，用PBST洗滌5次。用含有I % BSA的PBS按照1: 1000稀釋HRP酶標(biāo)抗體，按照5株抗體彼此配對(duì)的原則，于相應(yīng)孔中加入100 μ I酶標(biāo)抗體，于37°C水浴孵育I小時(shí)，用PBST洗滌5次后，每孔中加入100 μ IΤΜΒ+Η202底物，室溫孵育20分鐘，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸終止反應(yīng)，于450nm處測(cè)定OD
值。具體結(jié)果如表1:表I不同抗體組合檢測(cè)StxII的效果
權(quán)利要求
1.一種抗StxII的單克隆抗體或其片段，包括輕鏈⑶R1-3和重鏈⑶R1-3，其特征在于，所述輕鏈⑶R1-3的氨基酸序列為: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:15所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:16所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:17所示； 所述重鏈⑶R1-3的氨基酸序列為: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:18所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:19所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:20所示。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
3.如權(quán)利要求1-2任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的編碼序列如序列表中SEQ ID NO:13的核甘酸序列所示，所述重鏈可變區(qū)的編碼序列如序列表中SEQ ID NO:14的核甘酸序列所示。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段在制備檢測(cè)StxII或其亞型StxIIc和StxIIvha中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段在制備治療StxII或其亞型StxIIc和StxIIvha所引起疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.—種檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒,所述試劑盒包括如權(quán)利要求1_3任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其片段。
7.如權(quán)利要求6所述的一種檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒還包括單克隆抗體S2D8，其中單克隆抗體S2D8的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
8.如權(quán)利要求6或7任意一項(xiàng)所述的一種檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒，還包括:辣根過(guò)氧化物酶底物緩沖液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品StxI1、陰性對(duì)照樣品BSA、洗液(PBS+0.05% Tween20)。
9.一種檢測(cè)StxII或其亞型StxIIc和StxIIvha的方法,包括以下步驟: 1)用0.1M的NaHC03/Na2C03緩沖液(ρΗ9.6)稀釋上述抗體S2D8至濃度為10 μ g/ml,加入至96孔酶標(biāo)板，100 μ l/孔，4。1:包被過(guò)夜，用PBST洗I次，加入5%的牛奶4?！悌柗忾]過(guò)夜； 2)按合適的稀釋度(1: 2 1: 10)稀釋待測(cè)樣品，加入到包被有抗體S2D8的96孔酶標(biāo)板中，37°C孵育I小時(shí)，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，用含有1%牛血清白蛋的PBS倍比稀釋純化的StxII，標(biāo)準(zhǔn)品StxII倍比稀釋后的濃為 1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、2.0ng/ml、1.0ng/ml，度每孔加入 100 μ I,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照,每個(gè)稀釋度設(shè)復(fù)孔； 3)用含有10ABSA的PBS按照1: 1000稀釋HRP酶標(biāo)記的上述單克隆抗體S2C6，于相應(yīng)孔中加入100 μ I酶標(biāo)抗體，于37°C水浴孵育I小時(shí)，用PBST洗滌5次后； 4)每孔中加入100μ l ΤΜΒ+Η202底物，室溫孵育20分鐘，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸終止反應(yīng)，于450nm處測(cè)定OD值； 5)結(jié)果判定:當(dāng)待測(cè)樣品的OD值大于空白孔OD值的2倍時(shí)視為陽(yáng)性，待測(cè)樣品中StxII的具體濃度根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)StxII的ELISA試劑盒，本發(fā)明還公開(kāi)了所述ELISA試劑盒中單克隆抗體S2D8和S2C6的序列信息及制備過(guò)程。本發(fā)明所述的ELISA試劑盒包括單克隆抗體S2D8、HRP標(biāo)記的單克隆抗體S2C6、辣根過(guò)氧化物酶底物緩沖液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品StxII(100ug/ml，0.1ml)、陰性對(duì)照樣品BSA、洗液液(PBS+0.05％Tween20)。本發(fā)明的試劑盒能夠靈敏的檢測(cè)樣品中StxII的含量，其靈敏度能夠達(dá)到4ng/ml，本發(fā)明所述的試劑盒還對(duì)StxII的亞型StxIIc和StxIIvha能進(jìn)行有效的識(shí)別。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103235140SQ20131013700
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者焦永軍, 曾曉燕, 郭喜玲, 史智揚(yáng), 汪華, 周明浩 申請(qǐng)人:江蘇省疾病預(yù)防控制中心
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