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一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條的制作方法
【專利摘要】一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，涉及一種生產(chǎn)食用菌檢測(cè)的改進(jìn)，其特征是：在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標(biāo)記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標(biāo)墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質(zhì)控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體包被在檢測(cè)線上，在質(zhì)控線和檢測(cè)線外表包被有NC膜。有益效果是：具有檢測(cè)周期短（1小時(shí)內(nèi)出結(jié)果）；操作簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)人員及儀器設(shè)備檢測(cè)；成本低（每個(gè)檢樣花費(fèi)需要幾元至十幾元）；定性檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。本方法可解決羊肚菌人工栽培中菌種是否是羊肚菌菌種，以及栽培后培養(yǎng)料中生長(zhǎng)的菌絲是否是羊肚菌菌絲的監(jiān)測(cè)，可以減少損失。
【專利說明】
一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種生產(chǎn)食用菌檢測(cè)的改進(jìn)。

【背景技術(shù)】
[0002]羊肚菌是一種珍稀的食用菌，其以美味著稱。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)其具有豐富的保健價(jià)值。由于人工栽培技術(shù)還不成熟，產(chǎn)品基本靠野生資源的采集，價(jià)格居高不下。實(shí)現(xiàn)羊肚菌的人工栽培具有巨大的商業(yè)價(jià)值。我們知道，在羊肚菌人工栽培時(shí)，如果栽培的菌種不是羊肚菌或是在栽培過程中培養(yǎng)基被雜菌污染，這種情況是栽培不出羊肚菌的。在羊肚菌的人工栽培實(shí)踐過程中，從菌種培養(yǎng)到子實(shí)體(菇體)的採(cǎi)收大約需要4至6個(gè)月時(shí)間，一般情況下，只有出菇才能證明接種的菌種是羊肚菌菌種，這也是傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢定方法，這種鑒定方法的好處是直接、客觀；最大的缺陷是周期過長(zhǎng)，而且由于羊肚菌栽培、出菇受多種因素影響而不易出菇，這種方法羊?qū)Χ蔷娜斯ぴ耘噙^程的早期及期中檢測(cè)上受到限制。另外一種檢定羊肚菌的方法是在實(shí)驗(yàn)室條件下的提取羊肚菌的DNA，通過核酸序列檢測(cè)比對(duì)來(lái)鑒定，該方法的優(yōu)勢(shì)是精準(zhǔn)，缺點(diǎn)是需要專業(yè)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)周期長(zhǎng)(數(shù)天)，費(fèi)用昂貴。
[0003]參考文獻(xiàn):
(1)孟盟，曹池，陳漢忠，等.水牛伊氏錐蟲病免疫膠體金試紙條的研制及初步應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42 (7):988-933.(2)王一東，劉建.一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法:中國(guó)，200910218152.8[P],2010-06-09.(3)馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對(duì)羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與分析[J].菌物研究，2014，12 (2):115-118.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是:提供一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，它可簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)羊肚菌。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標(biāo)記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標(biāo)墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質(zhì)控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體包被在檢測(cè)線上，在質(zhì)控線和檢測(cè)線外表包被有NC膜。
[0006]山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀釋包被質(zhì)控線。
[0007]將濃度為4.22 ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體用PBS緩沖液做1、2、3、4、5和6倍稀釋包被檢測(cè)線。
[0008]本發(fā)明的制備方法是:
(I)膠體金標(biāo)記抗羊肚菌抗體(單克隆抗體、多克隆抗體)的制備經(jīng)硫酸銨沉淀法純化的單克隆抗體(C6A8細(xì)胞株)及兔多克隆抗體的蛋白濃度分別為2.91 ug/ul,4.22 ug/ul。C6A8單抗的效價(jià)為1: 1280，兔血清的效價(jià):1:2560。膠體金溶液pH在8.5左右，C6A8單抗加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58 ug/ml時(shí)，可以將膠體金較好的標(biāo)記在抗羊肚菌單克隆抗體C6A8上。將膠體金標(biāo)記的抗羊肚菌抗體或噴涂或浸泡金標(biāo)墊，將金標(biāo)墊37°C lh，烘干，備用。
(2)質(zhì)控線抗體與檢測(cè)線抗體包被濃度
檢測(cè)線包被抗體(使用的是純化的兔抗羊肚菌多抗)蛋白濃度為:62.lug/ml,質(zhì)控線包被抗體(山羊抗鼠IgG (H+L))蛋白濃度為:6.4ug/ml。將上述試劑用噴或涂或點(diǎn)樣的方式包被到硝酸纖維素膜(NC膜)對(duì)應(yīng)位置上，37°C lh，烘干。將包被好的硝酸纖維膜浸泡于1%的牛血清白蛋白(BSA)中封閉，37°C lh，烘干。備用。
(3)試紙條的裝配及試紙條檢驗(yàn)結(jié)果判定。
[0009]如圖1所示，依次將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙貼于塑料襯板上，切成
0.4cm寬的長(zhǎng)條；
吸取適量經(jīng)過研磨處理的待檢樣品，滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向前移行，在移行過程中NC膜上會(huì)出現(xiàn)肉眼町見的紅色條帶，于加樣后10 min觀察結(jié)果，T線和C線都顯色.結(jié)果為陽(yáng)性；C線顯色，T線不顯色，結(jié)果為陰性；若C線不顯色，則試紙條無(wú)效。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:具有檢測(cè)周期短(I小時(shí)內(nèi)出結(jié)果)；操作簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)人員及儀器設(shè)備檢測(cè)；成本低(每個(gè)檢樣花費(fèi)需要幾元至十幾元);定性檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。本方法可解決羊肚菌人工栽培中菌種是否是羊肚菌菌種，以及栽培后培養(yǎng)料中生長(zhǎng)的菌絲是否是羊肚菌菌絲的監(jiān)測(cè)，可以減少損失。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發(fā)明結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例1
如圖所示，I是VC底板P、2是樣品墊、3是膠體金墊、4是NC膜、5是吸水濾紙、6是質(zhì)控線、7是檢測(cè)線。
[0013]羊肚囷囷種，編號(hào):51589，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物囷種保減中心；
鼠源抗羊肚菌單克隆抗體(C6A8雜交瘤細(xì)胞株)、/兔源抗羊肚菌多克隆抗體，及由長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系實(shí)驗(yàn)室制備，抗羊肚菌單抗雜交瘤細(xì)胞株現(xiàn)保存于該實(shí)驗(yàn)室；
膠體金溶液，上海金標(biāo)生物科技有限公司；
金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙、硝酸纖維(NC)膜，上海金標(biāo)生物科技有限公司；
牛血清白蛋白(BSA)，sigma公司分裝；
HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG (H+L)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司； pH試紙，上海華美公司；
實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器、設(shè)備=Mill1-Q超純水系統(tǒng)制備，磁力攪拌器，恒溫培養(yǎng)箱，冷凍離心機(jī)，酶標(biāo)儀，等。
[0014]I 方法
1.1試劑配制及玻璃器皿的處理
(1)0.1%碳酸鉀溶液:準(zhǔn)確稱取0.1 g碳酸鉀+超純水100 ml配制成溶液；
(2)PBS緩沖液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液):準(zhǔn)確稱取氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸二氫鉀0.2 g，磷酸氫二鈉2.9 g，加蒸餾水定容至1000 ml;
(3)包被抗原稀釋液；0.01 mol/L PBS pH7.4;
(4)重懸液(含1%BSA的PB液):將0.2 mol/L的磷酸二氫鈉0.53 ml和0.2mol/L的磷酸氫二鈉9.47mL,混合后加入BSA至終濃度為1%。
所用玻璃器皿先用清潔劑清洗干凈，然后用鹽酸洗液浸泡24 h，再用蒸餾水浸泡24h、最后蒸餾水、雙蒸水洗3?4次，烘干后備用[1]。
1.2單克隆抗體的純化及效價(jià)和蛋白濃度的測(cè)定
用硫酸銨沉淀法[2]分別純化抗羊肚菌的單克隆抗體C6A8、以及多克隆抗體。純化后的抗體分別用ELISA方法測(cè)定其效價(jià)，將抗體稀釋20、40、80......5120倍分別加入1_9孔，
1Ul孔SP2/0作為陰性對(duì)照?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)其蛋白濃度。
1.3膠體金標(biāo)記最適pH的確定
用0.lmol/L的碳酸鉀和0.lmol/L的鹽酸將膠體金溶液調(diào)至不同的梯度，取pH為7、
8、8.5、9、10的膠體金溶液各10ul，分別加入Iul濃度為1.14 mg/mL的純化好的抗體，混合均勻，室溫下放置15 min,分別加入2ul濃度為10%的NaCl溶液，混合均勻，室溫下放置3h。不適合的pH值組溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，甚至變黑、無(wú)色，觀察顏色變化最小的組為穩(wěn)定組，該pH值為最適標(biāo)記酸堿度。
1.4膠體金標(biāo)記最適蛋白濃度的確定
用0.lmol/L的碳酸鉀和0.lmol/L的鹽酸溶液將膠體金溶液調(diào)節(jié)到最適pH，在每10ul膠體金溶液中分別加入1.2,0.9,0.6,0.3,0.1,0.05ul單抗，室溫作用5 min，分別加入10%的NaCl溶液5ul，混勻后靜置3h[4]。觀察顏色變化較小的小組，記錄加入單克隆抗體的量，該蛋白兩即為最適標(biāo)記濃度。
1.5膠體金標(biāo)記抗體的制備及檢測(cè)
取10uL膠體金溶液，勻速攪拌作用下，加入適量0.lmol/L的碳酸鉀，調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適pH,將單抗溶液逐滴加入膠體金溶液中，大約5 min加完,勻
速攪拌30 min ;室溫放置15 min，逐滴加入10% BSA至終濃度為1%，將標(biāo)記的膠體金溶液以3 000r/min離心20 min,棄去沉淀。12 000 r/min離心60 min,吸棄上清液；用含I %牛血清白蛋白的PB液充分溶解沉淀。4°C保存?zhèn)溆肹5]。
為了檢測(cè)單克隆抗體是否與膠體金結(jié)合上，我們采用直接法，即將有陽(yáng)性的抗原和山羊抗鼠IgG (二抗)分別包被于硝酸纖維膜上后浸泡于標(biāo)記抗體的膠體金溶液中，二十分鐘后去硝酸纖維膜并觀察其顯色結(jié)果。
1.6質(zhì)控線抗體與檢測(cè)線抗體包被濃度的確定
將實(shí)驗(yàn)室已有的山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀釋包被質(zhì)控線。浸泡于標(biāo)記抗體的膠體金溶液中，二十分鐘后觀察其顯色情況，選擇適合濃度包被NC膜。
確定二抗包被濃度后，將濃度為4.22 ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體用PBS緩沖液做1、2、3、4、5和6倍稀釋包被檢測(cè)線，組裝試紙條，做陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)，觀察顯色情況，選擇最佳濃度的抗體包被NC膜。
1.7檢測(cè)線與質(zhì)控線的封閉
用最適檢測(cè)線與質(zhì)控線包被濃度包被于硝酸纖維膜后，將包被好的硝酸纖維膜浸泡于1%的牛血清白蛋白中封閉，放置于37度恒溫箱中，一小時(shí)后取出，烘干。
1.8試紙條的裝配
依次將樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙貼于塑料襯板上，切成0.4cm
寬的長(zhǎng)條；在硝酸纖維素膜的指定位置用一定濃度的山羊抗鼠IgG(質(zhì)控線)和兔血清多克隆抗體(檢測(cè)線)點(diǎn)樣包被。
1.9試紙條檢驗(yàn)結(jié)果判定
吸取適量待檢樣品滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向前移行，在移行過程中NC膜上會(huì)出現(xiàn)肉眼町見的紅色條帶，于加樣后10 min觀察結(jié)果，T線和C線都顯色.結(jié)果為陽(yáng)性；C線顯色，T線不顯色，結(jié)果為陰性；若C線不顯色，則試紙條無(wú)效。
[0015]2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1純化后單抗和多抗效價(jià)及蛋白濃度的測(cè)定
純化后的抗羊肚菌單克隆抗體W8C9、C6A8及多克隆抗體兔血清用ELISA間接法測(cè)得W8C9的效價(jià)為320，C6A8的效價(jià)為1280，兔血清的效價(jià)為2560。
用考馬斯亮藍(lán)法牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得單克隆抗體W8C9、C6A8及多克隆抗體兔血清蛋白濃度分別為:2.28 ug/ul,2.91 ug/ul,4.22 ug/ul。
由于純化后C6A8的效價(jià)還是高于W8C9的效價(jià)，所以本實(shí)驗(yàn)選用C6A8單克隆抗體標(biāo)記膠體金。
2.2膠體金的最適標(biāo)記條件
經(jīng)觀察比較，膠體金溶液pH=8.0時(shí)，其顏色變化最小，所以確定膠體金標(biāo)記最適pH為
8.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將抗體加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58 ug/ml時(shí)效果最佳，所以本實(shí)驗(yàn)選用0.58 ug/ml為最佳抗體標(biāo)記濃度。
2.3 I父體金標(biāo)記的結(jié)果
包被有陽(yáng)性抗原的硝酸纖維膜浸泡于標(biāo)記了抗體的膠體金溶液中后，觀察到包被抗原的地方有明顯的紅色出現(xiàn)，說明單克隆抗體已經(jīng)于抗體結(jié)合上。
2.4最適質(zhì)控線包被濃度的確定
經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定質(zhì)控線山羊抗鼠二抗1/500稀釋時(shí)實(shí)驗(yàn)效果最佳。
2.5特異性結(jié)果
我們將上述以建立的ELISA夾心法檢測(cè)到的十種不同的陽(yáng)性菌絲抗原樣本包被于硝酸纖維膜(檢測(cè)線)，山羊抗鼠IgG (二抗)作為質(zhì)控線包被，然后浸泡于標(biāo)有抗體的膠體金溶液中，二十分鐘后觀察，結(jié)果如下表:
表2-1膠體金法特異性實(shí)驗(yàn)編號(hào) 12 3 4 5 6 7 8 9 10 樣品 4 "22 5—1 4 --4 3~1 3~2 4—3 5*?2 3?.3 5?~5 5-3 結(jié)果 + + ++++ + + ++
注:1.樣品為不同種及同種的不同培養(yǎng)(液體)批次的羊肚菌菌絲處理液。
2.樣品的處理方法是，去適量菌絲，加入適量無(wú)菌海沙，在研缽中研磨20分鐘，上清液既是。
[0016]可見，用雙抗體ELISA夾心法能檢測(cè)出來(lái)的羊肚菌菌絲抗原樣本用膠體金法也能檢測(cè)其陽(yáng)性，即膠體金免疫層析法與雙抗體ELISA夾心法檢測(cè)結(jié)果相符合。
[0017]而采用該法檢測(cè)不同濃度的木耳、金針菇、金頂側(cè)耳、香菇、平菇、滑子蘑、雙孢菇的食用菌菌絲處理液時(shí)，其結(jié)果與陰性對(duì)照值相同，表明該方法對(duì)羊肚菌菌絲抗原的檢測(cè)具有良好的特異性。
[0018]3試紙條使用方法
3.1檢樣的處理:取適量(Ig左右)的含有疑似羊肚菌菌絲的菌種或含有疑似羊肚菌菌絲的培養(yǎng)料樣本(可以混有培養(yǎng)基)，加入2g左右的無(wú)菌海沙和適量的純凈水(可以用干凈的市售礦泉水)，在研缽內(nèi)研磨1020分鐘，靜置5分鐘，液體的上部較清澈的部分即可作為檢樣。
3.2檢測(cè):將檢樣滴入試紙條的樣品墊上I至2滴(或是組裝的試紙條的樣品孔中)，室溫下靜置20分鐘，觀察檢測(cè)結(jié)果。
3.3結(jié)果的判斷:
如果檢測(cè)線(離加樣點(diǎn)近的)和質(zhì)控線(離加樣點(diǎn)遠(yuǎn)的)都出現(xiàn)紅色條線，判定樣品為陽(yáng)性，既樣品中含有羊肚菌；
如果只有質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條線，判定樣品為陰性，既樣品中不含有羊肚菌；
如果檢測(cè)線與質(zhì)控線均不出現(xiàn)或是只有檢測(cè)線出現(xiàn)紅色條線，判定為試紙條失效。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，其特征是:在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標(biāo)記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標(biāo)墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質(zhì)控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔多克隆抗體也包被在檢測(cè)線上，將包被有質(zhì)控線和檢測(cè)線的NC膜經(jīng)含有1%的牛血清白蛋白的PBS緩沖液中封閉。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條,其特征是:膠體金溶液PH在8.08.5，抗羊肚菌單克隆抗體C6A8加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58 ug/ml時(shí)，將膠體金標(biāo)記在抗羊肚菌單克隆抗體C6A8上。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，其特征是:山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液稀釋成蛋白濃度為6.4ug/ml包被質(zhì)控線。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，其特征是:將用PBS緩沖液稀釋成蛋白濃度為62.lug/ml的抗羊肚菌兔多克隆抗體包被檢測(cè)線。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK104165989SQ201410327203
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】王一東, 張強(qiáng) 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春理工大學(xué)