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專利名稱：耐熱菌的elisa快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐熱菌的檢測(cè)方法，具體是耐熱菌的ELISA快速 檢測(cè)方法，屬于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)為酶聯(lián)免疫分析技術(shù) 的縮寫，該方法是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與 酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的分析技術(shù)。其 基本原理是①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫 活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原 或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，被檢樣品(含 有受檢的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體 結(jié)合。通過洗滌除去未結(jié)合的游離反應(yīng)物，最后，結(jié)合在固相載體上的 酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物
被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，使 用酶標(biāo)儀即可定性或定量分析。
旨i:5f月旨;^ffilf， (y4//qyc/o6ac///us ac/cfoferra^r&)， iJ^^月旨l&自 芽孢桿菌屬(^//c;^/o6""7/"s)的一員，是一種耐熱、嗜酸的細(xì)菌，俗稱 耐熱菌。蘋果濃縮汁中的耐熱菌芽孢能經(jīng)受酸性條件下的巴氏殺菌過程 而存活，在適宜條件下，在果汁中大量繁殖時(shí)，產(chǎn)生不良?xì)馕痘衔铮?同時(shí)使果汁產(chǎn)生輕微沉淀或霧狀渾濁，對(duì)果汁感官品質(zhì)有很大影響。盡 管耐熱菌并不致病，也不產(chǎn)生毒素，但其引起的果汁感官性狀劣變，甚至引起果汁腐敗，完全破壞了果汁的食用性和商品價(jià)值。所以，國際貿(mào) 易中對(duì)耐熱菌含量要求很嚴(yán)，是蘋果濃縮汁產(chǎn)品的必檢項(xiàng)目，常常成為 蘋果濃縮汁貿(mào)易中的技術(shù)壁壘，從而為蘋果濃縮汁的生產(chǎn)、貿(mào)易和商檢 提出了新的挑戰(zhàn)。
我國鮮蘋果出口量和出口額分別位居世界第一位和第五位，蘋果濃
縮汁出口量居世界第一位，占60%的國際市場(chǎng)份額。然而耐熱菌的超標(biāo) 是蘋果濃縮汁質(zhì)量安全的一個(gè)常見問題，解決這一問題的關(guān)鍵之一是要 有快速、特異、靈敏的檢測(cè)技術(shù)手段，以便及時(shí)反饋到生產(chǎn)線，實(shí)施有 效的控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量與安全。
目前，國內(nèi)外對(duì)蘋果濃縮汁中耐熱菌檢測(cè)的通用方法是細(xì)菌平皿培 養(yǎng)記數(shù)法，檢測(cè)周期為4-5天，不能及時(shí)有效控制產(chǎn)品質(zhì)量安全。關(guān)于 耐熱菌快速檢測(cè)方法，有日本學(xué)者建立的RT-PCR檢測(cè)方法，國內(nèi)有陜 西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院建立的PCR及QC-PCR檢測(cè)方法。 基于PCR的耐熱菌檢測(cè)方法，雖達(dá)到了快速、特異，但對(duì)設(shè)備和實(shí)驗(yàn) 條件要求高，步驟較繁鎖，推廣應(yīng)用較困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種耐熱菌的ELISA快速檢測(cè)方法，解決目前 耐熱菌檢測(cè)方法存在的缺陷。 本發(fā)明的操作步驟如下
耐熱菌的捕集一耐熱菌預(yù)增菌一耐熱菌包被酶標(biāo)板一封閉酶標(biāo)板一 加耐熱菌多克隆抗體一加酶標(biāo)抗體一加底物工作液一酶標(biāo)儀測(cè)定。
本發(fā)明將樣品中捕集到的耐熱菌抗原包被在固相載體上，形成固相 抗原，加入封閉液，封閉沒有包被到的酶標(biāo)板空隙部分，從而降低非特 異性吸附。加入耐熱菌多克隆抗體，其中抗體與固相抗原形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)抗體，與上述復(fù)合物結(jié)合，此時(shí)加入底物工作液， 復(fù)合物上的酶則催化底物而顯色，由于每步之間均有沖洗步驟，因此， 若樣品中不含耐熱菌，則耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體將被洗掉，底物
不顯色而呈陰性反應(yīng)；若樣品中含有耐熱菌，經(jīng)過預(yù)增菌則可以達(dá)到所 需檢測(cè)濃度，最終使底物顯色而呈陽性反應(yīng)。本發(fā)明簡便、易行，適合 于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)國際標(biāo)準(zhǔn)，可滿足蘋果濃縮汁中耐熱菌不得超 過1個(gè)/10mL的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求，整個(gè)操作過程可以在24小時(shí)內(nèi)完成，可 成功用于果汁中耐熱菌的快速檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明按以下具體步驟進(jìn)行
a.耐熱菌的捕集
a.l取10-20g待檢蘋果濃縮汁，以無菌水適度稀釋， a.2用溶劑過濾器過濾捕集耐熱菌，濾膜孔徑0.45pm，
a. 3耐熱菌被截留于濾膜表面；
b. 耐熱菌預(yù)增菌
b.l采用402培養(yǎng)基預(yù)增菌14-15h，使培養(yǎng)液中耐熱菌濃度達(dá)到5xl04 個(gè)/mL以上，
b, 2將增菌后的培養(yǎng)液以10000-12000rpm/min，離心10-15min;
c. 耐熱菌包被酶標(biāo)板
c.l用0.05mol/L、 pH9.6的碳酸緩沖液制成菌懸液作為包被液，
c2將包被液均勻加到酶標(biāo)板中，每孔100-150pL,
c.3酶標(biāo)板在55-6(TC烘箱中2-3 h烘干，
c.4用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐溫20洗板，
c.5每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次，c. 6洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；
d. 封閉酶標(biāo)板
d.l封閉液為5% - 8%的脫脂奶粉，
d.2將封閉液均勻的加到酶標(biāo)板各孔中，每孔200-300^iL， d.3在37。C溫箱中孵育2-3 h， d.4洗板
d.4.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 d.4.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次
d. 4.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；
e. 加耐熱菌多克隆抗體
e.l耐熱菌多克隆抗體為免疫大白兔得到的多克隆抗體， e.2免疫程序?yàn)?br> e.2.1給大白兔耳靜脈注射耐熱菌，注射的耐熱菌濃度為1X108- 1 Xl(f個(gè)/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量為0.5 mL， 以后每次注射量比上一次增加0.5 mL
e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分離血清即為耐熱菌多 克隆抗血清
e.2.3將耐熱菌多克隆抗血清經(jīng)過鹽析、DEAE-纖維素層析純化即得 耐熱菌多克隆抗體，
e.3耐熱菌多克隆抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 1600，
e.4將稀釋的耐熱菌多克隆抗體加到酶標(biāo)板各孔中，每孔 跳150nL，
e.5在37。C溫箱中孵育1-2 h，
e.6洗板e(cuò).6.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 e.6.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次
e. 6.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；
f. 加酶標(biāo)抗體
f.l酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)山羊抗兔抗體，
f.2酶標(biāo)抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 20000,
[3將稀釋的酶標(biāo)抗體加到酶標(biāo)板各孔中，每孔加100-150^iL，
f.4 37。C溫箱中孵育1-2 h，
f.5洗板
f.5.1用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐溫20洗板 f.5.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次
f. 5.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；
g. 加底物工作液
g.l底物工作液配方如下
g.1.1取25.7mL 0.2mol/LNa2HP04和24.3mL O.lmol/L擰檬酸液放入 lOOmL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度即為底物緩沖液
g丄2精確稱取0.02g3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺粉末，溶于20mL無水 乙醇，即為3,3' ，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺母液
g丄3底物緩沖液與3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺母液按1:1的比例混合， 每毫升混合液再加入2mL 30%h2o2即為底物工作液，
&2將底物工作液加到酶標(biāo)板各孔中，每孔加100-150pL，
g.3反應(yīng)15-20 min，
g.4加終止液終止反應(yīng)
g.4.1終止液為2mol/L的硫酸g. 4.2酶標(biāo)板每孔各加50-75^L;
h. 酶標(biāo)儀測(cè)定
h.l將終止反應(yīng)的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀， h.2在波長為450nrn處測(cè)定OD值，
h.3以樣品孔OD值-陰性孔OD值順性孔OD值22.1為陽性判斷標(biāo)
準(zhǔn)
h.3.1樣品孔為加經(jīng)捕集并經(jīng)預(yù)增菌處理的樣品液，以及耐熱菌多克 隆抗體、酶標(biāo)抗體、底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔
h.3.2陽性樣為加耐熱菌抗原，以及耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、 底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔
h.3.3陰性孔為不加耐熱菌抗原，而加耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、 底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔。
權(quán)利要求
1.耐熱菌的ELISA快速檢測(cè)方法，其特征是按以下操作步驟進(jìn)行耐熱菌的捕集；耐熱菌預(yù)增菌；耐熱菌包被酶標(biāo)板；封閉酶標(biāo)板；加耐熱菌多克隆抗體；加酶標(biāo)抗體；加底物工作液；酶標(biāo)儀測(cè)定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐熱菌的ELISA快速檢測(cè)方法，其特 征是按以下具體操作步驟進(jìn)行2. a耐熱菌的捕集2. a.l取10-20g待檢蘋果濃縮汁，以無菌水適度稀釋， 2. a.2用溶劑過濾器過濾捕集耐熱菌，濾膜孔徑0.45Mm, 2. a.3耐熱菌被截留于濾膜表面； 2. b耐熱菌預(yù)增菌2. b.l采用402培養(yǎng)基預(yù)增菌14-15h，使培養(yǎng)液中耐熱菌濃度達(dá) 到5xl()4個(gè)/mL以上，2.b.2將增菌后的培養(yǎng)液以10000-12000 rpm/min，離心10-15min; 2. c耐熱菌包被酶標(biāo)板2.c.1用0.05mol/L、pH9.6的碳酸緩沖液制成菌懸液作為包被液，,2. c2將包被液均勻加到酶標(biāo)板中，每孔100-150nL，2. c.3酶標(biāo)板在55-6(TC烘箱中2-3 h烘干，2. c.4用0.01mol/L, pH7.4的PBS-吐溫20洗板，2. c.5每隔l分鐘洗板一次，共洗板5-6次，2. c.6洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；2. d封閉酶標(biāo)板2. d.l封閉液為5% - 8%的脫脂奶粉，2.(1.2將封閉液均勻的加到酶標(biāo)板各孔中，每孔200-300nL， 2. d.3在37t)溫箱中孵育2-3 h， 2. d,4洗板2. d.4.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 2. d.4.2每隔l分鐘洗板一次，共洗板5-6次 2. d.4.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠； 2. e加耐熱菌多克隆抗體2. e.l耐熱菌多克隆抗體為免疫大白兔得到的多克隆抗體， 2. e,2免疫程序?yàn)?. e.2.1給大白兔耳靜脈注射耐熱菌，注射的耐熱菌濃度為IX 108-lX109々/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量 為0.5mL，以后每次注射量比上一次增加0.5mL2. e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分離血清即為耐 熱菌多克隆抗血清2. e.2.3將耐熱菌多克隆抗血清經(jīng)過鹽析、DEAE-纖維素層析純 化即得耐熱菌多克隆抗體，2. e.3耐熱菌多克隆抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 1600，(2. e.4將稀釋的耐熱菌多克隆抗體加到酶標(biāo)板各孔中，每孔 跡150nL，2. e.5在37"C溫箱中孵育l-2h， 2. e.6洗板2. e.6.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 2. e.6.2每隔l分鐘洗板一次，共洗板5-6次 2. e.6.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠； 2. f加酶標(biāo)抗體;2. f.l酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)山羊抗兔抗體，2. f.2酶標(biāo)抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 20000，2. f3將稀釋的酶標(biāo)抗體加到酶標(biāo)板各孔中，每孔加100-150pL，2. f.4 37。C溫箱中孵育1-2 h，2. f.5洗板2. ￡5.1用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐溫20洗板;2. f.5.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次2. f.5.3洗完之后，倒扣酶標(biāo)板，輕輕拍掉懸浮液珠；2. g加底物工作;2. g.l底物工作液配方如下2. g丄1取25.7mL 0.2mol/L Na2HP04和24.3mL 0. lmol/L擰檬酸 液放入100mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度即為底物緩沖液2. g丄2精確稱取0.02g 3，3' ，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺粉末，溶于20mL 無水乙醇，即為3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺母液2.g丄3底物緩沖液與3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺母液按1:1的比例 混合，每毫升混合液再加入2pL 30%H2O2即為底物工作液，( 2. g,2將底物工作液加到酶標(biāo)板各孔中，每孔加100-150^L，2. g.3反應(yīng)15-20 min，2. g，4加終止液終止反應(yīng)2. g.4.1終止液為2mol/L的硫酸2. g.4.2酶標(biāo)板每孔各加50-75^L;2. h酶標(biāo)儀測(cè)定2. h.l將終止反應(yīng)的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀， 2. ^2在波長為45011111處測(cè)定00值，2.h.3以樣品孔OD值-陰性孔OD值/陰性孔OD值^2.1為陽性 判斷標(biāo)準(zhǔn)2. h.3.1樣品孔為加經(jīng)捕集并經(jīng)預(yù)增菌處理的樣品液，以及耐熱 菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔2. h.3.2陽性樣為加耐熱菌抗原，以及耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo) 抗體、底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔2. h.3.3陰性孔為不加耐熱菌抗原，而加耐熱菌多克隆抗體、酶 標(biāo)抗體、底物工作液及終止液的酶標(biāo)孔。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐熱菌的ELISA快速檢測(cè)方法，目前采用的細(xì)菌平皿培養(yǎng)記數(shù)法，檢測(cè)周期長，PCR及QC-PCR檢測(cè)方法步驟較繁鎖。本發(fā)明解決了目前耐熱菌檢測(cè)方法存在的缺陷。操作步驟為耐熱菌捕集→預(yù)增菌→包被酶標(biāo)板→封閉酶標(biāo)板→加耐熱菌多克隆抗體→加酶標(biāo)抗體→加底物工作液→酶標(biāo)儀測(cè)定。由于每步均有沖洗步驟，因此若樣品中不含耐熱菌，則耐熱菌多克隆抗體、酶標(biāo)抗體被洗掉；若樣品中含有耐熱菌，經(jīng)過預(yù)增菌可達(dá)到所需檢測(cè)濃度，最終使底物顯色而呈陽性反應(yīng)。本發(fā)明簡便易行，檢測(cè)限達(dá)國際標(biāo)準(zhǔn)，可滿足蘋果濃縮汁中耐熱菌不超過1個(gè)/10mL的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，操作過程可在24小時(shí)內(nèi)完成，達(dá)到快速檢測(cè)的效果。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101566632SQ20091002289
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者余朝舟, 李建科, 峰 王 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)