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氯化醋酸as-d萘酚酯酶（as-dnce）染色液（化學染色法）的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學體外診斷領(lǐng)域，公開了一種緩沖液組分含有皂素的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒。采用本發(fā)明所述試劑盒染色時含皂素的緩沖液孵育血細胞，使色素能通過皂素在細胞膜上形成的空洞進入血細胞與氯化醋酸AS-D萘酚酯酶結(jié)合顯色，然后在洗滌后細胞重新封閉，色素沉淀顆粒被封閉在血細胞內(nèi)，使氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色后能夠持久不褪色，有利于染色基團的保護。本發(fā)明試劑盒具有染色效果持久、不易脫色，且組成簡單，使用方便，易做到標準化操作，廣泛適用于血細胞內(nèi)氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色。
【專利說明】氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)染色液(化學染色法)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學體外診斷領(lǐng)域，具體涉及氯化醋酸AS-D萘酚酯酶的染色試劑盒，尤其涉及一種化學染色法檢測血細胞內(nèi)特異性酯酶氯化醋酸AS-D萘酚酯酶的染色試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]氯化醋酸AS-D 萘酌.酯酶(naphthol AS-D chloroacetate esterase, AS-DNCE)是一種粒細胞特異性酯酶，通常存在于粒細胞系中。目前對特異性酯酶檢測常采用化學染色方法，其檢測原理為血細胞內(nèi)AS-DNCE將氯化醋酸AS-D萘酚水解，產(chǎn)生萘酚AS-D，后者與重氮劑偶聯(lián)形成有色沉淀物，沉淀物的顯色深淺與AS-DNCE活性成正比。
[0003]AS-DNCE幾乎都存在于粒細胞系中，而單核系細胞進行AS-DNCE染色多數(shù)為陰性，僅少數(shù)呈弱陽性。對正常人血細胞進行AS-DNCE染色,原始粒細胞為陰性反應(yīng)或陽性反應(yīng)，自早幼粒細胞至成熟中性粒細胞均為陽性反應(yīng)，酶活性并不隨細胞的成熟而增強；嗜酸性粒細胞為陰性反應(yīng)或弱陽性反應(yīng)，嗜堿性粒細胞為陽性反應(yīng)；其他血細胞、單核細胞為陰性反應(yīng)，個別可呈弱陽性反應(yīng)；淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞和血小板均呈陰性反應(yīng)。
[0004]對白血病血細胞AS-DNCE化學染色，可以鑒別出粒細胞和單核細胞、淋巴細胞等，在急性粒細胞白血病診斷中可作為粒細胞的標志，對白血病細胞的分型具有重要的診斷價值。對白血病血細胞染色,急性粒細胞白血病時，白血病性原始粒細胞可出現(xiàn)陽性反應(yīng)；急性單核細胞白血病及急性淋巴細胞白血病時，白血病細胞均呈陰性反應(yīng)；急性粒-單核細胞白血病時，部分白血病細胞可呈陽性反應(yīng)，其陽性強度取決于原粒細胞的數(shù)量和分化程度，分化程度較好的原粒細胞呈陽性反應(yīng)，但原始和幼稚單核細胞多數(shù)呈陰性反應(yīng)。
[0005]目前，傳統(tǒng)使用的AS-DNCE染色方法，染色后的涂片不能長時間保存，必須染色后及時觀察，否則色素沉淀顆粒變淡甚至褪色，不利于粒細胞系陽性細胞的觀察，從而影響白血病疾病的診斷分型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對目前現(xiàn)有AS-DNCE染色方法存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種染色效果持久的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒，該試劑盒染色后涂片可以長時間保存。
[0007]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008]一種氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒，包括含皂素的緩沖液。
[0009]皂素即皂角苷，又稱皂苷，英文名為Saponin，是由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有機酸組成的能形成水溶液或膠體溶液并能形成肥皂狀泡沫的植物糖苷統(tǒng)稱。皂素是一種溫和的穿膜劑，它可以在細胞膜上形成孔洞讓色素或其他分子自由通過，并且在洗滌去除皂素后細胞膜上的孔洞消失，細胞重新封閉。本發(fā)明所述氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒緩沖液組分含有皂素，采用本發(fā)明所述試劑盒染色時，含皂素的緩沖液孵育血細胞后，使色素能通過皂素在細胞膜上形成的空洞進入血細胞與氯化醋酸AS-D萘酚酯酶結(jié)合顯色，然后在洗滌后細胞重新封閉，色素沉淀顆粒被封閉在血細胞內(nèi)，使氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色后能夠持久不褪色，有利于染色基團的保護。
[0010]按照本發(fā)明，上述染色試劑盒中，所述含皂素的緩沖液中皂素工作濃度優(yōu)選為50mg/L ?200mg/L,更優(yōu)選為 90mg/L-100mg/L。在一些實施例中為 96.7mg/L。
[0011]按照本發(fā)明，上述染色試劑盒中，所述含皂素的緩沖液的pH值范圍為7.0?8.0。
[0012]進一步的，上述染色試劑盒中，所述含皂素的緩沖液中的緩沖液選自醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的一種。作為優(yōu)選，緩沖液為磷酸鹽緩沖液，更優(yōu)選為磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液。
[0013]進一步的，本發(fā)明所述氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒還包括固定液、氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液、重氮劑和復(fù)染液。
[0014]上述試劑盒中，所述固定液優(yōu)選為含甲醛的緩沖液。其中，所述含甲醛的緩沖液中所述甲醛的體積百分比濃度優(yōu)選為2%?5%。而所述含甲醛的緩沖液中的緩沖液選自醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中的一種。作為優(yōu)選，緩沖液為磷酸鹽緩沖液，更優(yōu)選為磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液。而緩沖液的PH值范圍為6.0-8.0。
[0015]按照本發(fā)明，上述試劑盒中，所述氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液的溶劑為N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)。按g/mL計，所述氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液中所述氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽的質(zhì)量體積百分比濃度為0.5%?1.5%，優(yōu)選為1%。
[0016]上述試劑盒中，所述重氮劑為堅牢紅B (Fast Red B Salt)。堅牢紅B又稱固紅B鹽，別名標準重氮色鹽玫瑰紅、B紅鹽、堅牢紅B，英文名為Fast Red B Salt，分子式為C17H13N3O9S2, CAS:49735-71-9。堅牢紅B為含重氮的鹽，可與萘酚AS-D反應(yīng)生成紅色沉淀，用于氯化醋酸AS-D萘酚酯酶的染色。
[0017]上述試劑盒中，所述復(fù)染液優(yōu)選為蘇木素染液。在一些實施方案中，所述蘇木素染液的制備方法為將蘇木素溶解于異丙醇-乙醇(體積比為1:1)的混合液中，并與含有硫酸鋁、疊氮鈉、冰醋酸的溶液混合均勻，敞口振蕩一周后，加入碘酸鈉和甘油；其中，所述蘇木素染液中所述蘇木素的濃度為0.2mg/mL-0.5mg/mL,所述硫酸招的濃度為2.0mg/mL-4.0mg/mL,所述碘酸鈉的濃度為0.05mg/mL-0.lmg/mL,所述甘油體積百分比濃度為35%-40%。
[0018]本發(fā)明還提供了使用上述氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒進行血細胞染色的方法。
[0019]一種氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色法，
[0020]將氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液、重氮劑與含皂素的緩沖液混合制得染色孵育液；
[0021]固定液固定血細胞涂片后用染色孵育液孵育，復(fù)染液復(fù)染后觀察。
[0022]在一些實施方案中，上述試劑盒染色法，具體包括:
[0023]步驟1:將氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液、重氮劑與含皂素的緩沖液混合均勻，制得染色孵育液，備用；
[0024]步驟2:血細胞涂片用固定液固定30秒，漂洗晾干；
[0025]步驟3:干燥后的涂片用染色孵育液在37°C下孵育30分鐘，漂洗晾干；
[0026]步驟4:干燥后的涂片用復(fù)染液復(fù)染I?2分鐘，漂洗晾干觀察。[0027]由于氯化醋酸AS-D萘酚鈉在水溶液中久置后會發(fā)生水解生成萘酚AS-D，與堅牢紅B生成有色沉淀，因此染色孵育液要現(xiàn)配現(xiàn)用。在染色前，將氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液、重氮劑與含皂素的緩沖液混合均勻，制備得到染色孵育液。本發(fā)明所述染色孵育液為一次性使用，配置后應(yīng)在2小時內(nèi)用完,使用后剩余液體應(yīng)廢棄不可留用。
[0028]其中，按照本發(fā)明，上述染色法中，步驟I中所述染色孵育液中所述氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液的體積百分比濃度優(yōu)選為2%-5% ;所述含皂素的緩沖液的體積百分比濃度為95%?98% ;所述重氮劑的濃度為0.5mg/mL-l.5mg/mL。
[0029]在一些實施例中為，所述染色孵育液中所述氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液的體積百分比濃度優(yōu)選為3.3% ;所述含皂素的緩沖液的體積百分比濃度為96.7% ;所述重氮劑的濃度為1.0mg/mL。
[0030]按照本發(fā)明，上述染色法中，步驟2中所述固定液優(yōu)選事先于4°C預(yù)冷。固定后漂洗優(yōu)選用水漂洗，漂洗2?4遍，優(yōu)選為用水漂洗3遍。漂洗后的涂片優(yōu)選自然晾干。
[0031]按照本發(fā)明，上述染色法中，步驟3中所述孵育具體為將步驟I所述染色孵育液倒入染缸，將涂片置于染色孵育液中，37°C下放置30分鐘。孵育后漂洗優(yōu)選為用水漂洗，在一些實施例中具體為孵育后連缸流水沖洗數(shù)分鐘。漂洗后的涂片優(yōu)選自然晾干。
[0032]按照本發(fā)明，上述染色法中，步驟4中所述復(fù)染具體為向干燥后的涂片滴加復(fù)染液覆蓋涂片，復(fù)染I?2分鐘。復(fù)染后漂洗優(yōu)選用水漂洗，漂洗2?4遍，優(yōu)選為用水漂洗3遍。漂洗后的涂片優(yōu)選自然晾干，于顯微鏡下觀察。
[0033]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒具有如下特點:
[0034]1、本發(fā)明試劑盒染色效果持久不易脫色。染色效果穩(wěn)定，不會因為超過觀察時間而造成假陰性的結(jié)果，大大減少大批量標本檢驗的情況下的人為誤差。
[0035]2、本發(fā)明試劑盒組成簡單，使用方便，易做到標準化操作，避免了因人為操作誤差造成的可重復(fù)性差。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1示使用本發(fā)明試劑盒染色的血涂片血象；
[0037]圖2示使用本發(fā)明試劑盒染色的血涂片24小時后血象；
[0038]圖3示使用普通染色試劑盒染色的血涂片血象；
[0039]圖4示使用普通染色試劑盒染色的血涂片24小時后血象。
【具體實施方式】
[0040]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0041]實施例1:本發(fā)明所述試劑盒的組成及制備方法
[0042]固定液:取40%甲醛10mL，稱量磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.65g,磷酸二氫鈉(NaH2PO4)
0.4g，加入蒸餾水90mL，pH值為7.3，每瓶2.5mL分裝，密封，置4°C冰箱中保存。
[0043]孵育液A (氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液):稱取50mg氯化醋酸AS-D萘酚鈉溶解于5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，每瓶ImL分裝，密封。
[0044]孵育液B (重氮劑-堅牢紅B):稱量30mg堅牢紅B粉末裝于試劑瓶中。[0045]孵育液C (含皂素的緩沖液):稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04)8.8g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.9g,阜素(Saponin, Sigma購買)0.1g,疊氮鈉lg，溶解于蒸懼水1000mL, pH值為7.6,每瓶29mL分裝，密封。
[0046]復(fù)染液:稱取蘇木素0.05g,溶解于5mL異丙醇和5mL乙醇的混合液中；稱取硫酸鋁0.5g，疊氮鈉0.1g溶解于80mL蒸餾水中，并加入IOmL冰醋酸，將蘇木素溶液也加入其中混合均勻。將混合試劑敞口振蕩一周后，稱取碘酸鈉0.01g和甘油60mL加入其中，每瓶
2.5mL分裝，密封。
[0047]實施例2:本發(fā)明所述試劑盒的染色方法
[0048]1、預(yù)制染色孵育液:取實施例1配制的孵育液A、孵育液B與孵育液C各I瓶混合，輕輕搖晃后混勻，即制成染色孵育液；
[0049]2、新鮮的骨髓細胞涂片或血液細胞涂片滴加4°C預(yù)冷的實施例1配制的固定液覆蓋涂片，30秒后,用水漂洗3遍，自然晾干涂片；
[0050]3、將步驟I染色孵育液倒入染缸，將涂片置于染色孵育液中，37°C下放置30分鐘，然后連缸流水沖洗數(shù)分鐘，自然晾干涂片；
[0051]4、向干燥后的涂片滴加實施例1配制的復(fù)染液覆蓋涂片，I~2分鐘后,用水漂洗3遍，自然晾干涂片，于顯微鏡下觀察。
[0052]實施例3:正常人血細胞涂片檢測
[0053]取正常人外周血制作血涂片，按照實施例2的方法使用本發(fā)明試劑盒對血涂片進行染色，染色后的血涂片用顯微鏡油鏡觀察血象并拍照，如圖1。
[0054]染色結(jié)果判斷:陰性結(jié)果為胞質(zhì)無色；陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色沉淀:胞質(zhì)呈淡紅色(+ )，鮮紅色沉淀布滿胞質(zhì)(++)，深紅色沉淀充滿胞質(zhì)(+++)。
[0055]染色結(jié)果:由圖1結(jié)果可見正常成熟中性粒細胞為陽性反應(yīng)，單核細胞為陰性反應(yīng)。
[0056]實施例4:與傳統(tǒng)染色方法比較
[0057]1、傳統(tǒng)AS-DNCE染色液配制及染色方法(血液學檢驗標準操作程序，2007，P318-319)
[0058]試劑配制:
[0059](1)甲醛-丙酮固定液(pH6.6)4°C保存
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色試劑盒，其特征在于，包括含皂素的緩沖液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述含皂素的緩沖液中皂素的工作濃度為 50mg/L ?200mg/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述含皂素的緩沖液的pH值為7.0?8.0。
4.如權(quán)利要求1-3任意一項所述的試劑盒，其特征在于，還包括固定液、氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液、重氮劑和復(fù)染液。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述固定液為含甲醛的緩沖液。
6.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液的溶劑為N，N-二甲基甲酰胺。
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述重氮劑為堅牢紅B。
8.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述復(fù)染液為蘇木素染液。
9.一種氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色法，其特征在于， 將氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液、重氮劑與含皂素的緩沖液混合制得染色孵育液； 固定液固定血細胞涂片后用染色孵育液孵育，復(fù)染液復(fù)染后觀察。
10.如權(quán)利要求9所述的染色法，其特征在于，所述染色孵育液中氯化醋酸AS-D萘酚鈉鹽溶液的體積百分比濃度優(yōu)選為2%-5% ;所述含皂素的緩沖液的體積百分比濃度為95%?98% ;所述重氮劑的濃度為0.5-1.5mg/mL。
【文檔編號】G01N1/30GK103884562SQ201410142880
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】謝永華, 朱美萍, 許付, 丁婧姝 申請人:上海太陽生物技術(shù)有限公司