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用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法
【專利摘要】一種用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法，其特征在于：包括以下步驟：1）配制實(shí)驗(yàn)試劑，2）細(xì)胞接種，3）電子煙煙液體染毒，4）中性紅染色，5）結(jié)果與分析。本發(fā)明針對(duì)大多數(shù)電子煙煙液樣本密度大的特點(diǎn)，確立了采用質(zhì)量稱重配制電子煙染毒溶液的方法。通過細(xì)胞接種密度的優(yōu)化步驟，篩查了最佳接種密度下最適用于電子煙煙液毒性評(píng)價(jià)的細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞。并通過電子煙煙液染毒濃度的優(yōu)化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應(yīng)曲線。本測(cè)定方法還具有快速簡(jiǎn)便、靈敏性高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電子煙煙液體外細(xì)胞毒性的測(cè)定，具體說是基于中性紅染料分析電子煙煙液染毒后細(xì)胞存活率的定量測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對(duì)“吸煙有害健康”的了解，各國政府均在現(xiàn)行法律規(guī)定范圍內(nèi)積極采取和實(shí)行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共場(chǎng)所吸煙。2005年，中國簽署了世界衛(wèi)生組織《煙草控制框架公約》。2012年，中國政府發(fā)布《中國煙草控制規(guī)劃(2012-2015年)》，提出創(chuàng)造無煙環(huán)境，實(shí)施公共場(chǎng)所全面禁煙。室內(nèi)禁煙措施導(dǎo)致電子煙等新型產(chǎn)品在各國市場(chǎng)上得到迅速增長(zhǎng)，消費(fèi)群體不斷擴(kuò)大。電子煙又名電子尼古丁傳送系統(tǒng)。世界衛(wèi)生組織對(duì)電子尼古丁傳送系統(tǒng)的官方定義為:電子尼古丁傳送系統(tǒng)是一種消費(fèi)產(chǎn)品，能夠向肺傳輸尼古丁。電子煙一般都由三部分構(gòu)成:煙桿、霧化器、煙液。近年來，電子煙以“保健”，“戒煙”，“清肺”等為宣傳口號(hào)，以網(wǎng)絡(luò)為主要營(yíng)銷途徑，在中國地區(qū)銷量大增。某些電子煙產(chǎn)品還宣稱其比傳統(tǒng)卷煙的危害性更小。然而目前對(duì)電子煙的毒性評(píng)價(jià)研究較少，相關(guān)研究?jī)H使用3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽法(MTT法)對(duì)電子煙煙液或煙霧的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明不同電子煙煙液的細(xì)胞毒性相差很大。
[0003]檢測(cè)化合物細(xì)胞毒性可通過多種生物學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行，例如通過測(cè)定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來計(jì)算細(xì)胞數(shù)量、測(cè)定細(xì)胞代謝活性(例如MTT法)以及檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性等生物學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)不同檢測(cè)原理開展細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，可從不同角度揭示化合物細(xì)胞毒性的作用機(jī)理。
[0004]中性紅吸收試驗(yàn)是廣泛接受的用來評(píng)價(jià)藥物、化妝品、工業(yè)化工原料及環(huán)境污染物對(duì)不同細(xì)胞的毒性的體外細(xì)胞毒性測(cè)試方法。在眾多細(xì)胞毒性測(cè)試方法中，中性紅試驗(yàn)是最為靈敏的評(píng)價(jià)卷煙煙氣冷凝物細(xì)胞毒性的方法。然而，該方法是否可用于評(píng)價(jià)電子煙煙液細(xì)胞毒性還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)的原理，根據(jù)電子煙煙液細(xì)胞毒性的特點(diǎn)，通過篩選適用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的細(xì)胞系，優(yōu)化染毒濃度，建立的一種電子煙煙液體外細(xì)胞毒性的測(cè)定方法，該方法具有檢測(cè)通量高，靈敏度高，定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
一種用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法，包括以下步驟:
O溶液的制備:
(1)中性紅染液:0.2 g中性紅加雙蒸水至100 ml，過濾除菌并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至50μ g/ml ；
(2)中性紅萃取液:冰醋酸:無水乙醇:水=1: 50: 49 ;
(3)陽性對(duì)照:十二烷基硫酸鈉(SDS)(200 μ g/ml, 100%細(xì)胞致死率濃度)； (4)電子煙煙液染毒溶液:由于電子煙煙液的主要組成成分包括丙二醇、丙三醇等保潤(rùn)齊U，導(dǎo)致電子煙煙液溶液密度較大，無法準(zhǔn)確移取體積進(jìn)行染毒溶液的配制。因此，本發(fā)明中使用精度不小于萬分之一的分析天平對(duì)電子煙煙彈液進(jìn)行準(zhǔn)確稱量，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)基溶液稀釋配制。
[0007]2)細(xì)胞樣本的處理:
(I)細(xì)胞接種:本方法適用的細(xì)胞種類為人肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞。向96孔板的每孔中加入100 μ L的BEAS-2B細(xì)胞懸液。
[0008](2)電子煙煙液染毒:細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為陰性對(duì)照組、8個(gè)不同劑量的電子煙煙液染毒組和陽性對(duì)照組。陰性對(duì)照組每孔加入100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)基、電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I電子煙染毒溶液、陽性對(duì)照組每孔加入200 μ g/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100 μ I稀釋培養(yǎng)液作為溶劑背景對(duì)照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。
[0009](3)中性紅染色:電子煙煙液染毒24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μ I中性紅染液，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200 μ IPBS洗2次，加入IOOul中性紅提取液。室溫下快速振蕩15?20 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm波長(zhǎng)處的吸光值。
[0010](4)結(jié)果與分析:計(jì)算相對(duì)吸光值，相對(duì)吸光值代表細(xì)胞存活率。相對(duì)吸光值C=
A540/ A54ci陰性對(duì)照
注:所用SDS陽性對(duì)照為100%細(xì)胞致死濃度，故A54cihwm應(yīng)小于等于0.3。
[0011]由于電子煙煙液的細(xì)胞毒性較低，應(yīng)選擇對(duì)其染毒響應(yīng)更靈敏的細(xì)胞系作為測(cè)試細(xì)胞系，本發(fā)明中對(duì)CHO細(xì)胞，A549細(xì)胞，BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行篩選。圖1所示為CHO細(xì)胞，A549細(xì)胞，BEAS-2B細(xì)胞最佳接種密度條件優(yōu)化。如圖可知，當(dāng)CHO細(xì)胞，A549細(xì)胞的接種密度等于或大于20000個(gè)/孔時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，這表明細(xì)胞接種密度過高，已出現(xiàn)抑制作用，細(xì)胞無法繼續(xù)增殖和生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞接種密度為10000個(gè)/孔時(shí)，細(xì)胞處于指數(shù)增長(zhǎng)期且響應(yīng)信號(hào)最大，因此，CHO細(xì)胞和A549細(xì)胞的最佳接種密度為10000個(gè)/孔。對(duì)于BEAS-2B細(xì)胞，接種密度等于或大于40000個(gè)/孔時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，這表明細(xì)胞接種密度過高，已出現(xiàn)抑制作用，細(xì)胞無法繼續(xù)增殖和生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞接種密度為20000個(gè)/孔時(shí)，細(xì)胞處于指數(shù)增長(zhǎng)期且響應(yīng)信號(hào)最大，因此，BEAS-2B細(xì)胞的最佳接種密度為20000個(gè)/孔。
[0012]本發(fā)明采用最佳接種密度下的三種細(xì)胞系對(duì)電子煙產(chǎn)品I的煙液細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定。圖2所示為采用CHO細(xì)胞，A549細(xì)胞，BEAS-2B細(xì)胞三種細(xì)胞系進(jìn)行電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)時(shí)，電子煙煙液染毒濃度與中性紅吸收值的劑量效應(yīng)關(guān)系，根據(jù)公式計(jì)算得到其半數(shù)抑制率IC50值分別為15.2mg/ml, 31.4 mg/ml, 46.7 mg/ml,由此可知，BEAS-2B細(xì)胞對(duì)電子煙煙液細(xì)胞毒性測(cè)定更靈敏，本發(fā)明中選擇BEAS-2B細(xì)胞為電子煙煙液細(xì)胞毒性測(cè)定所用細(xì)胞株。
[0013]由圖2可知，當(dāng)選擇BEAS-2B細(xì)胞為測(cè)試細(xì)胞株時(shí)，當(dāng)染毒濃度為5mg/ml至60mg/ml時(shí)，電子煙煙液對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性由小變大，有很好的劑量效應(yīng)關(guān)系，因此考察電子煙煙液細(xì)胞毒性濃度的染毒區(qū)間應(yīng)包含5mg/ml至60 mg/ml范圍。
[0014]本發(fā)明根據(jù)電子煙煙液的特性，建立了一種基于中性紅試驗(yàn)分析電子煙煙液染毒后細(xì)胞存活率的定量測(cè)定方法，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):(1)針對(duì)大多數(shù)電子煙煙液樣本密度大的特點(diǎn)，確立了采用質(zhì)量稱重配制電子煙染毒溶液的方法。(2)通過不同細(xì)胞系的篩選，接種密度的優(yōu)化步驟，選擇更適用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的BEAS-2B細(xì)胞。(3)并通過電子煙煙液染毒濃度的優(yōu)化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應(yīng)曲線。此外，本測(cè)定方法還具有操作快速簡(jiǎn)便、靈敏性高、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1.細(xì)胞接種密度優(yōu)化。
[0016]圖2.不同細(xì)胞系檢測(cè)電子煙樣品I煙液細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
[0017]圖3.BEAS-2B細(xì)胞檢測(cè)電子煙樣品2煙液細(xì)胞毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例做進(jìn)一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0019]為考察電子煙樣品2煙液染毒對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的毒性影響。經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化以后，制備細(xì)胞懸液(2X IO5個(gè)/ml)。96孔板(除最外周36個(gè)孔)中每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為陰性對(duì)照、8個(gè)不同劑量(5 mg/ml,10mg/ml, 15 mg/ml, 20mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml)的電子煙煙液染毒和陽性對(duì)照處理。96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100 μ I稀釋培養(yǎng)液作為溶液背景對(duì)照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。電子煙煙液染毒染毒24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加Λ100 μ I中性紅染液，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200 μ IPBS洗2次，加入I ml中性紅提取液。室溫下快速振蕩15?20 min,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm波長(zhǎng)處的吸光值。圖3所示為電子煙煙液染毒所得到的劑量效應(yīng)曲線，如圖3可知，電子煙煙液染毒濃度與中性紅檢測(cè)吸光度值有很好的劑量效應(yīng)關(guān)系，可通過公式計(jì)算IC50值。
【權(quán)利要求】
1.一種用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)溶液的制備: (1)中性紅染液:0.2 g中性紅加雙蒸水至100 ml，過濾除菌并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至50μ g/ml ； (2)中性紅萃取液:冰醋酸:無水乙醇:水=1: 50: 49 ; (3)陽性對(duì)照:十二烷基硫酸鈉(SDS)，200μ g/ml, 100%細(xì)胞致死率濃度； (4)電子煙煙液染毒溶液:使用分析天平對(duì)電子煙煙彈液進(jìn)行準(zhǔn)確稱量，然后使用細(xì)胞培養(yǎng)基溶液稀釋配制； 2)細(xì)胞樣本的處理: (1)細(xì)胞接種:選用人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞，向96孔板的每孔中加入100μ L的BEAS-2B細(xì)胞懸液； (2)電子煙煙液染毒:細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為陰性對(duì)照組、8個(gè)不同劑量的電子煙煙液染毒組和陽性對(duì)照組，陰性對(duì)照組每孔加入100 μ I細(xì)胞 培養(yǎng)基、電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I電子煙染毒溶液、陽性對(duì)照組每孔加入200 μ g/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36個(gè)孔中每孔加入100 μ I稀釋培養(yǎng)液作為溶劑背景對(duì)照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ； (3)中性紅染色:電子煙煙液染毒24h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μ I中性紅染液，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，3 h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200μ IPBS洗2次，加入IOOul中性紅萃取液，室溫下快速振蕩15-20 min,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)540nm波長(zhǎng)處的吸光煙液值； (4)結(jié)果與分析:計(jì)算相對(duì)吸光值，相對(duì)吸光值代表細(xì)胞存活率，相對(duì)吸光值C=A540/^540陰性對(duì)照； 此外，所用SDS陽性對(duì)照為100%細(xì)胞致死濃度，故A54cih1wm應(yīng)小于等于0.3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法，其特征在于:人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞最佳接種密度為20000個(gè)/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于電子煙煙液細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的中性紅吸收測(cè)定方法，其特征在于:電子煙煙液細(xì)胞毒性濃度的染毒區(qū)間應(yīng)包含5mg/ml至60 mg/ml范圍。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103808681SQ201410094933
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月16日
【發(fā)明者】劉彤, 陳歡, 韓書磊, 吳帥賓, 付立偉, 張小濤, 石龍凱, 侯宏衛(wèi), 胡清源 申請(qǐng)人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心