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一種降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法及應(yīng)用其的傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法及應(yīng)用其的傳感器，屬于生物分析【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過(guò)在傳感器構(gòu)建或檢測(cè)過(guò)程中形成類似于自然界中常見(jiàn)的“荷葉效應(yīng)”，將尺寸較小的分子信號(hào)探針固定到納米金顆粒表面合成尺寸較大的納米探針，從而在傳感過(guò)程中形成與荷葉表面類似的納米結(jié)構(gòu)，有效防止了信號(hào)探針插入電極表面上的DNA單分子層的分子間隙而引起的吸附，使得電化學(xué)傳感器背景信號(hào)基本清除。結(jié)果表明，在檢測(cè)可卡因和三磷酸腺苷時(shí)，采用納米探針后兩者的背景信號(hào)幾乎完全清除，相應(yīng)地大大提高了檢測(cè)的靈敏度，兩者的檢測(cè)靈敏度分別為6nM和5nM，分別提高了2000倍和1000倍；而在檢測(cè)Hg2+時(shí)，其信號(hào)殘留也從原來(lái)的30％下降到了6％以下。
【專利說(shuō)明】一種降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法及應(yīng)用其的傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法及其應(yīng)用，屬于生物分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]基于固相基質(zhì)的傳感器，如微陣列，試紙條，平面波導(dǎo)系統(tǒng)和電極等因具有高通量，測(cè)量簡(jiǎn)單，便攜和自動(dòng)化、微型化兼容性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和實(shí)際檢測(cè)。但此類傳感器也存在不少技術(shù)上的難題而限制了它們的應(yīng)用。最普遍和嚴(yán)重的問(wèn)題是在固相基質(zhì)表面信號(hào)探針的非特異性吸附引起強(qiáng)的背景信號(hào)而造成傳感器的檢測(cè)靈敏度下降。自組裝分子層鈍化表面(Sens Actuators B Chem.2008,129 (I), 225-230.)高分子聚合物(Anal.Chem.2005，77 (23)，7758-7762.)，DNA 探針(Ahal.Chem.2011,83(17),6464-6467.)和其他封閉試劑是常用的減少傳感器表面吸附的方法。但在很多情況下這些方法并不能有效降低背景信號(hào)。因此發(fā)展一種通用而又十分簡(jiǎn)單有效地清除電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法仍是對(duì)廣大科研人員的挑戰(zhàn)。
[0003]納米金顆粒是一種直徑在I?lOOnm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性的納米材料。因?yàn)榫哂懈叩谋缺砻娣e，良好的生物相容性和電催化活性等獨(dú)特性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于生物傳感器中進(jìn)行分子識(shí)別和信號(hào)放大等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]荷葉具有自清潔的效果，研究表明這種“荷葉效應(yīng)”是由于荷葉表面具有納米結(jié)構(gòu)，納米柱之間的距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于水珠的直徑，使得水珠無(wú)法進(jìn)入納米柱間從而無(wú)法沾污荷葉的表面。本發(fā)明將小尺寸的分子信號(hào)探針通過(guò)Au-S鍵固定到納米金顆粒表面合成納米探針，這樣就可以在傳感過(guò)程中形成與荷葉表面類似的納米結(jié)構(gòu)，達(dá)到清除(降低)電化學(xué)背景信號(hào)的目的。具體地說(shuō):分子探針固定到納米金表面后其直徑將超過(guò)13nm以上，而按常規(guī)方法組裝的電化學(xué)傳感器自組裝單分子層探針間距離為4?8nm。此時(shí)納米探針的尺寸超過(guò)單分子層探針間距離，在組裝或傳感過(guò)程中將形成與荷葉相似的仿生納米結(jié)構(gòu)，達(dá)至IJ類似“荷葉效應(yīng)”的自清潔效應(yīng)，以清除電極表面的非特異性吸附而大幅提高傳感器檢測(cè)性能。
[0005]本發(fā)明的主要內(nèi)容是通過(guò)將分子探針固定到納米金表面合成為納米探針，構(gòu)建對(duì)電化學(xué)傳感器電極表面非特異性吸附進(jìn)行自清潔的方法及展示其應(yīng)用，本發(fā)明提供一種降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法，其中，該方法包括如下步驟:步驟一:將化學(xué)修飾的捕獲探針固定到金電極的表面；步驟二:將分子信號(hào)探針通過(guò)化學(xué)自組裝固定到納米金顆粒表面合成納米探針。
[0006]進(jìn)一步，根據(jù)所述的方法，其中，所述捕獲探針或所述分子信號(hào)探針為較短鏈的探針。[0007]進(jìn)一步，根據(jù)所述的方法，其中，步驟一如下:1 μ M的末端巰基修飾的捕獲探針在含有IOOyM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的緩沖溶液中(IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PB)，1.0MNaCl, pH = 7.0)室溫下還原lh，將干凈的裸金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝，組裝后的電極用超純水沖洗三遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用超純水沖洗三遍，吹干后放置于緩沖溶液中(IOmM PB, 1.0M NaCl,pH = 7.0)備用。
[0008]進(jìn)一步，根據(jù)所述的方法，其中，步驟二如下:將標(biāo)記電化學(xué)氧化還原基團(tuán)的分子信號(hào)探針，溶入到50mM 二硫蘇糖醇(DTT)，體積比2%三乙胺(TEA)的水溶液中，室溫下反應(yīng)20min。使用NAP_5column過(guò)柱純化,然后通過(guò)在260nm處紫外可見(jiàn)吸收峰值對(duì)分子信號(hào)探針定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液(分子信號(hào)探針與納米金摩爾比例為100: I)，在室溫下靜置老化16小時(shí)，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入氯化鈉緩沖溶液(IOmM PB, IM NaCl，pH = 7.4)，使 NaCl 終濃度為 0.3M，振蕩 16h 后，9000rpm 離心20min，用IOmM PB (pH = 7.4)洗滌三次，置于4°C下備用。
[0009]進(jìn)一步，根據(jù)所述的方法，其中，所述捕獲探針為探針5:HS- (CH2) 6-AGACAAGGAAAA ;所述分子信號(hào)探針為探針 6:HS- (CH2) 6-A5TCCTTCAATGAAGTGGGTCG- (CH2) 6-MB。
[0010]進(jìn)一步，根據(jù)所述的方法，其中，所述捕獲探針為探針7:HS- (CH2) 6-A5ACCTGGGGGAGTAT ;所述分子信號(hào)探針為探針 8:HS_ (CH2) 6_A5TGCGGAGGAAGGT_ (CH2) 6-MB。
[0011]進(jìn)一步，根據(jù)所述的方法，其中，所述捕獲探針為探針9 =T15-(CH2)6-SH;所述分子信號(hào)探針為探針 10:Fc-(CH2)6-A2tl-(CH2) 6-SH。
[0012]本發(fā)明還提供一種電化學(xué)傳感器，其中，將所述的納米探針溶于IOmM PB,0.2MNaCl, pH7.0的緩沖溶液中為電解液，納米金的終濃度為5nM，以所述的固定捕獲探針的金電極作為工作電極組成三電極體系。
[0013]本發(fā)明還提供一種電化學(xué)傳感器，其中，將包被了所述的探針10的納米金用雜交液(1/15M PB, 0.3M NaCl,pH7.4)稀釋成2nM，與組裝了所述探針9的金電極在25°C下?lián)嵊?h，再用雜交液沖洗三次，即制得傳感器。
[0014]本發(fā)明中利用納米探針清除電極表面非特異性吸附來(lái)降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法如下:
[0015](I)將化學(xué)修飾的捕獲探針固定到金電極的表面；
[0016]I μ M的末端巰基修飾的捕獲探針在含有100 μ M三[2_羧乙基]膦(TCEP)的緩沖溶液中(IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PB)，1.0M NaCl, pH = 7.0)室溫下還原lh，將干凈的裸金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝。組裝后的電極用超純水沖洗三遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用超純水沖洗三遍，吹干后放置于緩沖溶液中(IOmM PB, 1.0M NaCl，pH = 7.0)備用。
[0017](2)將分子信號(hào)探針通過(guò)化學(xué)自組裝固定到納米金顆粒表面合成納米探針；
[0018]將標(biāo)記電化學(xué)氧化還原基團(tuán)的分子信號(hào)探針，溶入到50mM 二硫蘇糖醇(DTT)，體積比2%三乙胺(TEA)的水溶液中，室溫下反應(yīng)20min。使用NAP-5column過(guò)柱純化，然后通過(guò)在260nm處紫外可見(jiàn)吸收峰值對(duì)分子信號(hào)探針定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液(分子信號(hào)探針與納米金摩爾比例為100: I)，在室溫下靜置老化16小時(shí)。老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入氯化鈉緩沖溶液(IOmM PB, IM NaCl，pH = 7.4)，使NaCl終濃度為0.3M，振蕩16h后，9000rpm離心20min，用IOmM PB (pH = 7.4)洗滌三次，置于4°C
下備用。
[0019](3)傳感器的構(gòu)建與靶標(biāo)的電化學(xué)檢測(cè)。
[0020]本發(fā)明中清除(降低)電化學(xué)傳感器背景信號(hào)方法分別在信號(hào)增加檢測(cè)平臺(tái)(A)和信號(hào)減小檢測(cè)平臺(tái)(B)上應(yīng)用，具體操作分別包括如下步驟:
[0021](A)可卡因和三磷酸腺苷的檢測(cè):將納米探針溶于緩沖溶液中(IOmM PB,0.2MNaCl, pH7.0)為電解液，納米金的終濃度為5nM，以固定捕獲探針的金電極作為工作電極組成三電極體系，往電解液加入一定濃度的可卡因或者三磷酸腺苷，待體系平衡5分鐘后，進(jìn)行方波伏安(SWV)分析。根據(jù)SWV的電信號(hào)強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因或者三磷酸腺苷的檢測(cè)。
[0022](B)Hg2+的檢測(cè):將包被了標(biāo)記二茂鐵的全A鏈的納米金用雜交液(1/15M PB,0.3MNaCl，pH7.4)稀釋成2nM，與組裝好全T寡核苷酸鏈的金電極在25°C下?lián)嵊?h，再用雜交液沖洗三次，即制得傳感器。檢測(cè)Hg2+時(shí)，將一定濃度的Hg2+配置在雜交液中，將組裝好的傳感器浸泡于其中，于25°C下?lián)嵊?0min，再用雜交液沖洗三次。進(jìn)行方波伏安(SWV)分析。根據(jù)SWV的電信號(hào)強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)。
[0023]本發(fā)明的基于納米探針來(lái)減小電化學(xué)傳感器電極表面非特異性吸附，從而降低背景信號(hào)的方法具有如下的技術(shù)效果:
[0024]1、本發(fā)明基于納米探針來(lái)降低背景信號(hào)的方法簡(jiǎn)單、易行。
[0025]2、本發(fā)明的方法可以基本清除電化學(xué)信號(hào)增加檢測(cè)平臺(tái)的背景信號(hào)，大幅提高檢測(cè)的靈敏度。
[0026]3、本發(fā)明的方法可以大幅清除電化學(xué)信號(hào)減小檢測(cè)平臺(tái)的背景信號(hào)，提高檢測(cè)的相對(duì)信號(hào)變化。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1A—圖1S，是利用納米探針清除傳感器電極表面非特異性吸附的原理圖。
[0028]圖2A-圖22，是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中組裝不同長(zhǎng)度探針和組裝不同密度的探針電極表面非特異性吸附前后的阻抗表征圖。圖2A中a，b，c分別是探針1，2和3組裝到電極上之后的阻抗譜圖；a'，b' ’c'是上述申極分別與探針4撫育后的陽(yáng)抗譜圖。圖2S中a，b，c分別是組裝了低密度，中等密度，高密度的探針I(yè)的金電極的阻抗譜圖；上述電極分別與探針4撫育后的阻抗譜圖。
[0029]圖3A-圖32，是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用納米探針的方法清除可卡因電化學(xué)傳感器的背景信號(hào)以優(yōu)化其檢測(cè)性能的原理圖和SWV圖及工作曲線。
[0030]圖4A-圖42，是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用納米探針的方法清除三磷酸腺苷電化學(xué)傳感器的背景信號(hào)以優(yōu)化其檢測(cè)性能的原理圖和SWV圖及工作曲線。
[0031]圖5A-圖5S，是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中利用納米探針的方法清除Hg2+電化學(xué)傳感器的信號(hào)殘留以優(yōu)化其檢測(cè)性能的原理圖和SWV圖及工作曲線。
【具體實(shí)施方式】[0032]表1:本發(fā)明中使用的核酸探針序列。
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種降低電化學(xué)傳感器背景信號(hào)的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟:步驟一:將化學(xué)修飾的捕獲探針固定到金電極的表面；步驟二:將分子信號(hào)探針通過(guò)化學(xué)自組裝固定到納米金顆粒表面合成納米探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針或所述分子信號(hào)探針為較短鏈的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一如下:1μ M的末端巰基修飾的捕獲探針在含有IOOyM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的緩沖溶液中(IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PB)，1.0M NaCl, pH = 7.0)室溫下還原lh，將干凈的裸金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝，組裝后的電極用超純水沖洗三遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用超純水沖洗三遍，吹干后放置于緩沖溶液中(IOmM PB, 1.0M NaCl, pH = 7.0)備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二如下:將標(biāo)記電化學(xué)氧化還原基團(tuán)的分子信號(hào)探針，溶入到50mM 二硫蘇糖醇(DTT)，體積比2%三乙胺(TEA)的水溶液中，室溫下反應(yīng)20min。使用NAP-5column過(guò)柱純化,然后通過(guò)在260nm處紫外可見(jiàn)吸收峰值對(duì)分子信號(hào)探針定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液(分子信號(hào)探針與納米金摩爾比例為100: I)，在室溫下靜置老化16小時(shí)，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入氯化鈉緩沖溶液(IOmM PB, IM NaCl，pH = 7.4)，使 NaCl 終濃度為 0.3M,振蕩 16h 后，9000rpm 離心20min，用IOmM PB (pH = 7.4)洗滌三次，置于4°C下備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針為探針5:HS- (CH2) 6-AGACAAGGAAAA ;所述分子信號(hào)探針為探針 6:HS- (CH2) 6-A5TCCTTCAATGAAGTGGGTCG- (CH2) 6-MB。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針為探針7:HS- (CH2) 6-A5ACCTGGGGGAGTAT ;所述分子信號(hào)探針為探針 8:HS_ (CH2) 6_A5TGCGGAGGAAGGT_ (CH2) 6-MB。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針為探針9:T15-(CH2)6-SH ;所述分子信號(hào)探針為探針 10 =Fc-(CH2)6-A2tl-(CH2) 6-SH。
8.一種電化學(xué)傳感器，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的納米探針溶于IOmM PB, 0.2MNaCl，pH7.0的緩沖溶液中為電解液，納米金的終濃度為5nM，以權(quán)利要求1所述的固定捕獲探針的金電極作為工作電極組成三電極體系。
9.一種電化學(xué)傳感器，其特征在于，將包被了權(quán)利要求7中所述的探針10的納米金用雜交液(1/15M PB, 0.3M NaCl，pH7.4)稀釋成2nM，與組裝了權(quán)利要求7中所述探針9的金電極在25°C下?lián)嵊?h，再用雜交液沖洗三次，即制得傳感器。
【文檔編號(hào)】G01N27/416GK103983679SQ201410238990
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】婁新徽, 趙滔, 劉然, 何苗 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué), 清華大學(xué)