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一種利用離子液膠束提取和檢測山楂中活性成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用離子液膠束提取和檢測山楂中活性成分的方法，利用長鏈離子液的膠束體系同時提取山楂中水溶性成分和脂溶性成分，并且用快速液相-四級桿/飛行時間質(zhì)譜作為檢測器檢測，跟對照品的標準曲線對比得到山楂中各成分的含量。本發(fā)明所用方法提取效率高，可以更為全面地提取山楂中的活性成分，能夠更為快速靈敏地檢測山楂中的活性成分。
【專利說明】一種利用離子液膠束提取和檢測山楂中活性成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥提取和質(zhì)量檢測方法，具體地涉及由離子液膠束提取山楂中水溶性成分和脂溶性成分，并應用快速液相-四級桿/飛行時間質(zhì)譜作為一種檢測手段的質(zhì)量檢測方法，屬于天然藥物提取制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的中藥提取方法包括溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、升華法、壓榨法，每種方法都有其一定的優(yōu)越性，但仍有需要改進的地方。在上述提取方法中，溶劑提取法是最為常見、最簡便易行的方法。
[0003]所謂溶劑提取法，就是依靠中藥中的各類有效成分在不同溶劑中的溶解度不同而進行分離。若選擇的溶劑對藥物的活性成分溶解度較大且對雜質(zhì)成分溶解度較小，則可將藥物中的有效成分提取出來。常見的溶劑可以分成三種:水、水溶性有機溶劑、脂溶性有機溶劑。中藥中所包含的活性成分亦可分為水溶性成分和脂溶性成分。
[0004]山楂為薔薇科山楂屬植物，落葉稀半常綠灌木或小喬木。根據(jù)中藥記載，山楂性溫，味酸、甘，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有活血化瘀、消食化積之功效。臨床主要將其干燥果實用于小兒乳積、食積、婦女產(chǎn) 后瘀阻腹痛、胸痹、疝氣、小兒痘疹、心痛、便血、吐血等。近年來，山楂還在抗菌消炎以及治療心血管疾病領(lǐng)域有廣泛的應用。
[0005]對山楂化學成分的研究始于1921年，20世紀50年代以前的研究內(nèi)容，主要集中在鞣質(zhì)、纖維素、三萜類等成分，50年代以后，黃酮類化合物迅速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)山楂中含有的黃酮類成分對心血管系統(tǒng)的藥理作用非常明顯，于是研究重點轉(zhuǎn)向黃酮類成分。截至目前，從山楂(果肉、核及葉)中發(fā)現(xiàn)且分離得到的物質(zhì)有150多種，其中主要有黃酮類、有機酸類、低聚黃烷類，另外還含有三萜類、有機胺類和留體類等。
[0006]基于上述背景，能有效提取山楂中各類活性成分將有助于對山楂分析研究工作的開展。目前，較多文獻已有報導對山楂中活性成分的分析測定，但對于山楂樣品前處理及其后續(xù)質(zhì)量檢測這一方面，文獻報道較少且形式較為單一，基本是以水或者甲醇等有機溶劑作為提取溶劑，加入山楂樣品中超聲提取。鑒于山楂提取物中同時含有水溶性成分和脂溶性成分，甲醇等親水性有機溶劑雖然同時對脂溶性成分和水溶性成分有較好的提取效果，但考慮到有機溶劑對人體以及環(huán)境的危害和影響，在提倡可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境友好的今天，尋找一種對人體低毒、對環(huán)境污染小、提取效率高、同時兼顧脂溶性成分和水溶性成分的提取方法顯得尤為重要，而現(xiàn)有技術(shù)中，考慮到這種低毒對環(huán)境污染問題，人們通常想到的是用水作為提取溶劑，然而用水作為溶劑時，對脂溶性成分的提取效果就相對欠佳。在應用離子液對山楂進行前處理提取時，雖有文獻報道但是屬于短鏈離子液，提取的成分有限，效果欠佳。目前文獻報道的山楂檢測方法常見有液相-紫外、液相-電化學等，所用液相色譜均為常規(guī)液相，分析時間較長，靈敏度低，且檢測方法中并未涉及利用快速液相-四級桿/飛行時間質(zhì)譜作為檢測方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種以長鏈離子液形成膠束，作為提取溶劑，用于提取山楂中活性成分，并且應用快速液相-四級桿/飛行時間質(zhì)譜作為檢測手段的一種中藥質(zhì)量檢測方法。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0009]一種利用離子液膠束提取和檢測山楂中活性成分的方法，所述方法為:取山楂干品、粉碎、過一號篩、除雜，得到山楂粉末；取蒸餾水加入長鏈離子液體，使長鏈離子液體的濃度為100~250mmol/L，稱定溶液重量為M，充分混勻(可利用超聲混勻)使離子溶液透明澄清，稱重量，加水補足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的質(zhì)量濃度為20~30mg/mL，所得混合液用超聲處理40~80分鐘，所得提取液再稱重量，加水補足至重量M，然后離心，取上清液作為樣液進樣，用液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC-Q-T0F/MS )檢測，得到樣液的總離子流色譜圖和各成分的提取離子色譜圖；以原兒茶酸的對照品配制不同濃度的對照品溶液，按照樣液同樣條件用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，獲得原兒茶酸對照品的提取離子色譜圖，以原兒茶酸對照品溶液的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積為橫坐標，以原兒茶酸對照品的進樣量為縱坐標制作原兒茶酸標準曲線，按同樣方法制作綠原酸標準曲線、表兒茶酸標準曲線、金絲桃苷標準曲線、異槲皮苷標準曲線 、槲皮素標準曲線；根據(jù)樣液的各成分的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣液中原兒茶酸、綠原酸、表兒茶酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量，換算得到山楂中各成分的含量。
[0010]所述長鏈離子液為1-十二烷基-3-甲基咪唑鹽，所述的鹽可以是有機酸鹽，也可以是無機酸鹽，優(yōu)選地，所述1-十二烷基-3-甲基咪唑鹽為溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、1-十二烷基-3-甲基咪唑硝酸鹽或1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽。更為優(yōu)選地，所述的長鏈離子液為體氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。
[0011]所述長鏈離子液體的濃度優(yōu)選為150mmol/L。
[0012]所述山楂粉末的質(zhì)量濃度優(yōu)選為25mg/mL。
[0013]所述超聲處理的時間優(yōu)選為40分鐘。
[0014]所述超聲的條件優(yōu)選為40k Hz、功率100~200W。
[0015]所述離心優(yōu)選I3OOOrpm,離心5min。
[0016]較為具體的，所述方法優(yōu)選按以下步驟進行:取山楂干品、粉碎、過一號篩、除雜，得到山楂粉末；取蒸餾水加入長鏈離子液體，使長鏈離子液體的濃度為150mmol/L，稱定溶液重量為M，超聲混勻至透明澄清，稱重量，加水補足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的質(zhì)量濃度為25mg/mL，所得混合液用超聲處理40分鐘，所得提取液再稱重量，加水補足至重量M，然后離心，取上清液作為樣液進樣，用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，得到樣液的總離子流色譜圖和各成分的提取離子色譜圖；以原兒茶酸的對照品配制不同濃度的對照品溶液，按照樣液同樣條件用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，獲得原兒茶酸對照品的提取離子色譜圖，以原兒茶酸對照品溶液的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積為橫坐標，以原兒茶酸對照品的進樣量為縱坐標制作原兒茶酸標準曲線，按同樣方法制作綠原酸標準曲線、表兒茶酸標準曲線、金絲桃苷標準曲線、異槲皮苷標準曲線、槲皮素標準曲線；根據(jù)樣液的各成分的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣液中原兒茶酸、綠原酸、表兒茶酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量，換算得到山楂中各成分的含量。[0017] 所述液質(zhì)聯(lián)用儀上的檢測條件通常為:
[0018]色譜柱:AgilentSB-C18 柱(1.8 μ m，4.6 X 50mm)，左右柱溫:40 °C，流速:0.4mL/min ;流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；進樣量0.2uL ;梯度洗脫:0-2.5min:10-15v%B ；2.5-3.0min:15-15v% 流動相 B ；3.0-6.0min:15_40v%流動相 B ；6.0-8.0min:40-100v% 流動相 B ；8.0-12.0min: 100-100v% 流動相 B ;12.0-13.0min: 100-10v% 流動相 B。
[0019]質(zhì)譜條件:電噴霧電離；負離子模式；全掃描模式監(jiān)測(TIC);干燥氣溫度:350°C ；干燥氣流量:12L/min ;噴霧器壓力:45Psig;碰撞電壓:175V;電離電壓:3.5KV ;碰撞能:15V;質(zhì)量數(shù)掃描范圍:100-1100m/z。
[0020]本發(fā)明中，在用長鏈離子液作為提取溶劑提取山楂活性成分時，同時對比了以水及甲醇作為提取溶劑的提取效果對比，結(jié)果表明，長鏈離子液提取劑在提取山楂或活性成分時，與水作為提取劑相比，起主要作用的活性成分金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等黃酮類成分，提取效果要明顯強于水，與甲醇提取效果相當，長鏈離子液中，尤其是氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑，對山楂中水溶性和脂溶性成分都有較好的提取作用，優(yōu)于甲醇或水作為提取溶劑。該提取體系具備一系列優(yōu)異突出的特性:對人體無毒、不污染環(huán)境；熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性良好，不易燃，操作環(huán)境安全可靠。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0022]提供了一套新穎的山楂質(zhì)量檢測方法，借助離子液膠束體系用于樣品前處理的提取環(huán)節(jié)，借助高分辨的快速液相-四級桿/飛行時間質(zhì)譜作為檢測器用于質(zhì)量檢測的分析環(huán)節(jié)，靈敏度高，效果顯著。
[0023]本發(fā)明采用了新型綠色提取體系一離子液膠束表面活性劑體系，長鏈離子液提取劑在提取山楂或活性成分時，與水作為提取劑相比，起主要作用的活性成分金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等黃酮類成分，提取效果要明顯強于水，與甲醇提取效果相當，長鏈離子液中，尤其是氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑，對山楂中水溶性和脂溶性成分都有較好的提取作用，優(yōu)于甲醇或水作為提取溶劑。該提取體系具備一系列優(yōu)異突出的特性:對人體無毒、不污染環(huán)境；熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性良好，不易燃，操作環(huán)境安全可靠。
[0024]本發(fā)明提供的長鏈離子液表面活性劑體系同時提取山楂中水溶性成分和脂溶性成分的方法，既克服了傳統(tǒng)提取方法利用水作為提取劑的不能同時提取水溶性成分和脂溶性成分的缺點，也避免了傳統(tǒng)提取方法利用甲醇作為提取劑對人體的毒害以及環(huán)境的污染。本發(fā)明具有提取效率高、操作環(huán)境安全，操作步驟簡單等優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1本發(fā)明利用離子液膠束提取檢測山楂中活性成分的工藝流程示意圖。
[0026]圖2為水、甲醇、長鏈離子液提取效果柱狀圖，其中圖中的字母A-E代表不同的離子液，F(xiàn)代表水、G代表甲醇；數(shù)字1-6代表山楂中不同的活性成分，分別為:
[0027]A:溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑
[0028]B:1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽
[0029]C:1-十二烷基-3-甲基咪唑硝酸鹽
[0030]D: 1-十二烷基-3-甲基咪唑硫氫酸鹽[0031]E:氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑
[0032]1:原兒茶酸
[0033]2:綠原酸
[0034]3:表兒茶酸
[0035]4:金絲桃苷
[0036]5:異槲皮苷
[0037]6:槲皮素
[0038]圖3為甲醇提取的總離子流色譜圖(以下簡稱TIC)圖。
[0039]圖4為甲醇提取的原兒茶酸的提取離子色譜圖(以下簡稱EIC)圖。
[0040]圖5為甲醇提取的綠原酸EIC圖。
[0041]圖6為甲醇提取的表兒茶酸EIC圖。
[0042]圖7為甲醇提取的金絲桃苷和異槲皮苷EIC圖。
[0043]圖8為甲醇提取的槲皮素EIC圖。
[0044]圖9為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的TIC圖。
[0045]圖10為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的原兒茶酸EIC圖。
[0046]圖11為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的綠原酸EIC圖。
[0047]圖12為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的表兒茶酸EIC圖。
[0048]圖13為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的金絲桃苷和異槲皮苷EIC圖，
[0049]圖14為氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的槲皮素EIC圖。
[0050]圖3~14中不同的色譜峰所標注的1-6數(shù)字代表山楂中不同的活性成分，分別為:
[0051]1:原兒茶酸
[0052]2:綠原酸
[0053]3:表兒茶酸
[0054]4:金絲桃苷
[0055]5:異槲皮苷
[0056]6:槲皮素
【具體實施方式】
[0057]通過以下實例來對本發(fā)明進行更為詳細的描述。所述的提取分離工藝流程和萃取劑制備方法僅僅是為了更好地說明本發(fā)明，但不意味著對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所公開的信息，可以做出多種變更替換，如在提取時間、提取劑的濃度、提取劑與藥材的比例、溫度等方面。
[0058]以下實施例中的制備離子液溶液時采用靜置、攪拌或超聲法將各組分混合均勻即可。實施中未注明具體條件和步驟的粉碎、分離、過濾、超聲振蕩等方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)。
[0059]實施實例:
[0060]實施例1不同提取溶劑對山楂活性成分的提取效果
[0061]1.將山楂藥材粉末粉碎,并用一號篩過篩；[0062]2.平行稱取7份相同質(zhì)量山楂粉末，每份0.5000g。
[0063]3.平行稱取5份不同種類的離子液加入到5個規(guī)格均為50mL的錐形瓶并編號3、4、5、6、7，其中3號瓶中加入溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑0.9940g、4號瓶中加入1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽1.0396g、5號瓶中加入1-十二烷基_3_甲基咪唑硝酸鹽0.9403g、6號瓶中加入1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽1.0455g、7號瓶中加入氯化
1-十二烷基-3-甲基咪唑0.8606g，并統(tǒng)一加入體積均為20mL的水，稱定重量，置于超聲儀中混合，再稱定重量，用水補足減失的重量，配制成濃度均為150mmol/L的離子液溶液。另取2個規(guī)格均為50mL的錐形瓶編號1、2，分別加入20mL的純水和20mL的純甲醇。
[0064]4.往1-7號錐形瓶中加入先前稱取的山楂粉末,稱定重量后,置于超聲儀中超聲萃取。超聲的條件為40k Hz，功率100W。
[0065]5.1-7號瓶均在超聲40min后，再稱定重量，1-6號瓶用水補足與超聲前相比減失的重量，7號瓶用甲醇補足減失的重量，取出。
[0066]6.分別從1-7號錐形瓶中吸取1000 μ L的提取液加入規(guī)格為1.5mL的離心管中，編號對應為1-7。
[0067]7.將1-7號離心管置于離心儀中離心。 [0068]8.分別取1-7號離心管中的上層清液于自動進樣器的進樣瓶中，進樣瓶對應編號為 1-7。
[0069]9.1-7號進樣瓶放入液質(zhì)聯(lián)用儀中進樣分析，進樣量均為0.2μ L。
[0070]液質(zhì)聯(lián)用儀型號為安捷倫1290超高效液相色譜-G6530四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀。，檢測條件為
[0071]色譜柱:AgilentSB-C18 柱(1.8 μ m, 4.6 X 50mm),左右柱溫:40 °C,流速:0.4mL/min ;流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；進樣量0.2uL。梯度洗脫:0-2.5min:10-15ν%Β ;2.5-3.0min:15-15v% 流動相 B ;3.0-6.0min:15_40v%流動相 B ；6.0-8.0min:40-100v% 流動相 B ；8.0-12.0min: 100-100v% 流動相 B ;12.0-13.0min: 100-10v% 流動相 B
[0072]質(zhì)譜條件:電噴霧電離；負離子模式；全掃描模式監(jiān)測(TIC);干燥氣溫度:350°C ；干燥氣流量:12L/min ;噴霧器壓力:45Psig;碰撞電壓:175V;電離電壓:3.5KV ;碰撞能:15V;質(zhì)量數(shù)掃描范圍:100-1100m/z。
[0073]甲醇提取的總離子流色譜(TIC)圖見圖3，甲醇提取的不同成分的提取離子色譜圖(EIC)圖分別見圖4~8。氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的TIC圖見圖9，氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑離子液提取的不同成分的EIC圖分別見圖10~14。
[0074]實驗結(jié)果如表1、表2所示:
[0075]表1水和甲醇的提取效率(表中數(shù)據(jù)為峰面積)
【權(quán)利要求】
1.一種利用離子液膠束提取和檢測山楂中活性成分的方法，其特征在于所述方法為:取山楂干品、粉碎、過一號篩、除雜，得到山楂粉末；取蒸餾水加入長鏈離子液體，使長鏈離子液體的濃度為100~250mmol/L，稱定溶液重量為M,充分混勻使離子溶液透明澄清，稱重量，加水補足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的質(zhì)量濃度為20~30mg/mL，所得混合液用超聲處理40~80分鐘，所得提取液再稱重量，加水補足至重量M，然后離心，取上清液作為樣液進樣，用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，得到樣液的總離子流色譜圖和各成分的提取離子色譜圖；以原兒茶酸的對照品配制不同濃度的對照品溶液，按照樣液同樣條件用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，獲得原兒茶酸對照品的提取離子色譜圖，以原兒茶酸對照品溶液的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積為橫坐標，以原兒茶酸對照品的進樣量為縱坐標制作原兒茶酸標準曲線，按同樣方法制作綠原酸標準曲線、表兒茶酸標準曲線、金絲桃苷標準曲線、異槲皮苷標準曲線、槲皮素標準曲線；根據(jù)樣液的各成分的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣液中原兒茶酸、綠原酸、表兒茶酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量，換算得到山楂中各成分的含量；所述長鏈離子液為1-十二烷基-3-甲基咪唑鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述1-十二烷基-3-甲基咪唑鹽為溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-十二烷基-3-甲基咪唑甲磺酸鹽、1-十二烷基 -3-甲基咪唑硝酸鹽或1-十二烷基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的長鏈離子液為體氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述長鏈離子液體的濃度為150mmol/L。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述山楂粉末的質(zhì)量濃度為25mg/mL。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述超聲處理的時間為40分鐘。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述超聲的條件為40kHz、功率100~200W。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述離心是在13000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步驟進行:取山楂干品、粉碎、過一號篩、除雜，得到山楂粉末；取蒸餾水加入長鏈離子液體，使長鏈離子液體的濃度為150mmol/L,稱定溶液重量為M，超聲混勻至透明澄清，稱重量，加水補足至重量M，加入山楂粉末，使山楂粉末的質(zhì)量濃度為25mg/mL，所得混合液用超聲處理40分鐘，所得提取液再稱重量，加水補足至重量M，然后離心，取上清液作為樣液進樣，用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，得到樣液的總離子流色譜圖和各成分的提取離子色譜圖；以原兒茶酸的對照品配制不同濃度的對照品溶液，按照樣液同樣條件用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，獲得原兒茶酸對照品的提取離子色譜圖，以原兒茶酸對照品溶液的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積為橫坐標，以原兒茶酸對照品的進樣量為縱坐標制作原兒茶酸標準曲線，按同樣方法制作綠原酸標準曲線、表兒茶酸標準曲線、金絲桃苷標準曲線、異槲皮苷標準曲線、槲皮素標準曲線；根據(jù)樣液的各成分的提取離子色譜圖中色譜峰的峰面積及各個標準品的標準曲線計算樣液中原兒茶酸、綠原酸、表兒茶酸、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量，換算得到山楂中各成分的含量。
【文檔編號】G01N30/88GK103977102SQ201410127003
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】曹君, 胡帥帥, 代菡鑌, 曹婉, 龐瀟卿 申請人:杭州師范大學