久久一区二区免费播放,国产在线欧美日韩一区二区,国产综合色在线视频,精品伊人久久久香线蕉,精品视频麻豆网站,玖玖国产,国内精品久久久久影,在线观看精品视频一区二区三区,午夜久久影院,国产精品一区久久

孕酮完全抗原的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種孕酮完全抗原的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明通過碳二亞胺法(EDC)將活化的11α-羥孕酮(11α-OH-P4)，與卵清白蛋白(OVA)，選用進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫抗原。最后將制備的免疫抗原通過免疫小鼠制備抗血清，并確定檢測抗原的最佳包被濃度。
【專利說明】孕酮完全抗原的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及一種孕酮完全抗原的制備方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于孕酮是一種小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，無法令其注入機(jī)體后產(chǎn)生抗體。常 用的方法是利用偶聯(lián)劑做為媒介，通過半抗原和載體蛋白的偶聯(lián)制備完全抗原。偶聯(lián)方法 的不同和載體蛋白的選擇對完全抗原的免疫活性具有一定的影響。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種孕酮完全抗原的制備方法及其應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0005] 孕酮完全抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0006] S1、將lOOmgll α -〇H-P4與30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL無水吡啶中，在95°C水 浴鍋中水浴90min后，95°C烘干，轉(zhuǎn)化為黃色結(jié)晶109. 3mg。
[0007] S2、在0· 5mL DMF中溶解30mg S1所得的11 a -〇H-P4_HS(ll α -羥基孕酮半琥珀 酸酯）；
[0008] S3、再將 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分別溶于 0· OlmL DMF 中；
[0009] S4、將上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后，室溫下振蕩90min ;
[0010] S5、取A、B兩份7mL PBS溶液，在A溶液中加入95. 2mg BSA，在B溶液中加入95. 2mg OVA后，分別加入S4所得溶液中，4°C下攪拌過夜；；
[0011] S6、將S5所得A、B液體分別裝入透析袋中，在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小 時(shí)，在2. 2L去離子水中透析5小時(shí)，三次，最后放入pH = 7. 0的PBS溶液，中透析過夜；
[0012] S7、取出透析袋內(nèi)液體，低溫離心機(jī)4?，lOOOOrpm離心30min，棄去沉淀，取上清 液；
[0013] S8、將S7所得上清液真空冷凍干燥，制備出P4_BSA偶聯(lián)物和P4-〇VA偶聯(lián)物。
[0014] 作為優(yōu)選，所述的步驟S5中PBS溶液的PH為7。
[0015] 本發(fā)明還公開了上述方法所制備的孕酮完全抗原的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明通過碳二亞胺法（EDC)將活化的11α-羥孕酮（11α-〇H-P4)，與卵清白蛋 白（0VA)，選用進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫抗原。最后將制備的免疫抗原通過免疫小鼠制備抗血清， 并確定檢測抗原的最佳包被濃度。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0018] 本具體實(shí)施提供了一種孕酮完全抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0019] S1、將lOOmgll α -〇H-P4與30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL無水吡啶中，在95°C水 浴鍋中水浴90min后，95°C烘干，轉(zhuǎn)化為黃色結(jié)晶109. 3mg。
[0020] S2、在(λ 5mL DMF中溶解30mg S1所得的11 a -〇H-P4-HS (11 α -羥基孕酮半琥珀 酸酯）；
[0021] S3、再將 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分別溶于 0· OlmL DMF 中；
[0022] S4、將上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后，室溫下振蕩90min ;
[0023] S5、取A、B兩份7mL PBS溶液（PH = 7)，在A溶液中加入95. 2mg BSA，在B溶液中 加入95. 2mg OVA后，分別加入S4所得溶液中，4°C下攪拌過夜；；
[0024] S6、將S5所得A、B液體分別裝入透析袋中，在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小 時(shí)，在2. 2L去離子水中透析5小時(shí)，三次，最后放入pH = 7. 0的PBS溶液，中透析過夜；
[0025] S7、取出透析袋內(nèi)液體，低溫離心機(jī)4?，lOOOOrpm離心30min，棄去沉淀，取上清 液；
[0026] S8、將S7所得上清液真空冷凍干燥，制備出P4_BSA偶聯(lián)物和P4-〇VA偶聯(lián)物。
[0027] 本發(fā)明還公開了上述方法所制備的孕酮完全抗原的應(yīng)用。
[0028] 實(shí)施例
[0029] 制備抗血清
[0030] 選取6-8周齡雄性BALB/c小鼠10只，用自制P4-BSA免疫抗原進(jìn)行多次免疫。首 次免疫：取1. 0mg/mL50 μ LP4-BSA與等量FCA完全乳化后，對每只小鼠腹腔注射，免疫時(shí)間 14d ;二次免疫：取1. 0mg/mL50 μ LP4-BSA與等量FIA完全乳化，對每只小鼠腹腔注射，免疫 時(shí)間14d ;加強(qiáng)免疫：取1. 0mg/mL50l·! LP4-BSA，對每只小鼠腹腔注射，免疫時(shí)間10d。最后 將小鼠挖眼采集血液樣品，經(jīng)離心分離血清，抗血清性質(zhì)的鑒定。
[0031] 間接ELISA試驗(yàn)
[0032] ①將預(yù)先配置的抗原包被液稀釋檢測抗原，每個(gè)孔中加入100 μ L，37°C條件下靜 置30min后，置于4°C冰箱12h ;
[0033] ②每孔加入預(yù)先配置的封閉液200 μ L，37°C恒溫箱溫育2h ;
[0034] ③每孔加入預(yù)先配置的洗滌液100-200 μ L，如此反復(fù)洗滌3次；每次洗滌3分鐘 左右；
[0035] ④將加入已用PBS稀釋的血清，每孔加100μ L，37°C下濕盒靜置lh ;
[0036] ⑤洗滌方法同上；
[0037] ⑥將已用PBS稀釋的（1 : 2000)HRP-酶標(biāo)二抗每孔中加入lOOyL，在37°C下濕 盒靜置反應(yīng)lh ;
[0038] ⑦洗滌方法同上；
[0039] ⑧將每孔中加入100μ L底物，在37°C下避光靜置lh ;
[0040] ⑨將每孔中加入50 μ L終止液；
[0041] ⑩將酶標(biāo)板用酶標(biāo)儀讀出每孔0D490nm值（重復(fù)測定3次取平均值）。
[0042] 抗原P4_0VA最適包被濃度
[0043] 包被的抗原P4_0VA最佳稀釋濃度利用方陣滴定法測定，即最適包被濃度。橫 向用抗血清包被（分別以A-F命名），按照1 : 4·0Χ103、1 : 8·0Χ103、1 : 1.6X104、 1 : 3. 2X104、1 : 6. 4Χ104和1 : 1.28Χ105的稀釋濃度包被與酶標(biāo)板中?？v向（分別以 a-g 命名）用檢測抗原 P4-〇VA 按 1 : LOXlO^l : 2·0Χ101、1 : tOXlO^l : 8.0X101、 1 : 1.6X102、1 : 3. 2X102、1 : 1.28X 103的稀釋濃度包被與酶標(biāo)板中，要在ELISA試驗(yàn)中 設(shè)橫向h和i則分別為陰性對照和空白對照。操作方法同間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果以0D 49(lnm 值最接近于1. 0的判定為P4_〇VA最適包被濃度。
[0044] 抗血清與完全抗原中孕酮?dú)埢奶禺愋?br> [0045] 將最適包被濃度的抗原P4_0VA與OVA分別包被于酶標(biāo)板中，用封閉液封閉后，將 50 μ LP4-BSA加入12個(gè)酶標(biāo)板孔中。將25 μ g/ml孕酮標(biāo)準(zhǔn)品放入甲醇中稀釋（按照1 : 10 做為開始倍比，做12個(gè)梯度），振蕩混勻20min，之后每孔加入50 μ L在上述12個(gè)酶標(biāo)板孔 中。將PBS緩沖液同無孕酮的甲醇混合為對照。按照間接ELISA試驗(yàn)方法進(jìn)行操作，測定 每孔00490_值。
[0046] 抗血清與游離的孕酮的特異性
[0047] 將最適包被濃度的抗原P4_0VA包被于酶標(biāo)板中，用封閉液封閉后，將倍比抗血清 和空白對照（PBS緩沖液）按照間接ELISA試驗(yàn)方法進(jìn)行操作，測定每孔0D 49(lnm值后，分別 計(jì)算OVA孔與空白對照孔的比值和P4-〇VA孔與OVA孔的比值。
[0048] 抗原P4-0VA最適包被濃度測定結(jié)果
[0049] 通過方陣法進(jìn)行抗原P4_0VA最適包被濃度的鑒定。結(jié)果顯示（表1) :P4-〇VA包 被濃度越高，〇D45tol值越高。通過觀察發(fā)現(xiàn)0D45(lnm值為1. 0孔為抗原P4-〇VA的包被濃度為 1 : 160,抗血清的稀釋濃度為1 : 32000,故將其作為最適包被濃度。
[0050] 表1抗原p4-ova最適包被濃度
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 孕酮完全抗原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 51、 將lOOmgll α -〇H-P4與30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL無水吡啶中，在95°C水浴鍋 中水浴90min后，95°C烘干，轉(zhuǎn)化為黃色結(jié)晶109. 3mg。 52、 在 0· 5mL DMF 中溶解 30mg S1 所得的 11 a -〇H-P4-HS ; 53、 再將 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分別溶于 0. OlmL DMF 中； 54、 將上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后，室溫下振蕩90min ; 55、 取A、B兩份7mL PBS溶液，在A溶液中加入95.2mg BSA，在B溶液中加入95.2mg OVA后，分別加入S4所得溶液中，4°C下攪拌過夜；； 56、 將S5所得A、B液體分別裝入透析袋中，在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小時(shí)， 在2. 2L去離子水中透析5小時(shí)，三次，最后放入pH = 7. 0的PBS溶液，中透析過夜； 57、 取出透析袋內(nèi)液體，低溫離心機(jī)4?，lOOOOrpm離心30min，棄去沉淀，取上清液； 58、 將S7所得上清液真空冷凍干燥，制備出P4-BSA偶聯(lián)物和P4-〇VA偶聯(lián)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的孕酮完全抗原的制備，其特征在于，所述的步驟S5中PBS溶 液的PH為7。
3. 如權(quán)利要求1所制備的孕酮完全抗原的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/74GK104086648SQ201410229282
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】夏成, 吳凌, 徐闖, 舒適, 許楚楚, 肖鑫煥, 沈泰玉, 張洪友, 包軍 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)