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一種漢遜酵母hcp抗體制備方法，制得抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗?jié)h遜酵母宿主蛋白(HCP)抗體，所述抗?jié)h遜酵母宿主蛋白抗體為多克隆抗體，以漢遜酵母菌株制得漢遜酵母宿主蛋白后經(jīng)動物免疫再經(jīng)抗體純化后制得。本發(fā)明還提供了該抗體的制備方法，該方法包括制備漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白，通過在常規(guī)免疫動物的方法中加入抗原純化步驟，使得動物在對漢遜酵母全部宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，加強對于部分較弱免疫原性宿主蛋白的免疫反應(yīng)性，從而制得低免加強型宿主殘余蛋白抗體；實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的抗體可應(yīng)用于ELISA檢測宿主殘余蛋白中，不僅能提高靈敏度，而且對于大部分由漢遜酵母表達(dá)的生物制品的宿主殘余蛋白檢測都通用，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種漢遜酵母HCP抗體制備方法，制得抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥及檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種檢測用抗體的制備方法，更具體地說，涉及一種漢遜酵母HCP (Host cell protein, HCP,宿主蛋白)抗體的制備方法，該方法制備所得抗體，以及該抗體在相關(guān)檢測技術(shù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]酵母菌作為單細(xì)胞真核生物，既具有原核生物生長快，遺傳操作簡單的特點，又具有與聞等真核生物相似的基因表達(dá)調(diào)控和翻譯后修飾機制，因此是生廣具有真核生物活性蛋白理想的表達(dá)系統(tǒng)。其中多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)是國際上公認(rèn)的一種理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)于大腸桿菌和其他酵母菌的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，近年來已有大量難以高效表達(dá)的外源蛋白在漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)中都得已成功表達(dá)；其在生物制品產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值如下:1)外源基因整合于染色體上，重組菌株遺傳穩(wěn)定性高；2)非同源重組的頻率高，易獲得高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子；3)可利用甲醇氧化酶(MOX)啟動子等強啟動子高效的啟動外源基因的表達(dá)；4)外源蛋白的表達(dá)在過氧化物酶體內(nèi)進行，可使其免受細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解，并降低了對細(xì)胞的毒害作用；5)耐高溫，最適生長溫度為37-43°C，生長速率快，大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)時間短。當(dāng)前采用多形漢遜酵母作為表達(dá)系統(tǒng)已上市的生物制品有重組乙型肝炎病毒疫苗、水蛭素等；另外還有多種外源蛋白在多形漢遜酵母中成功表達(dá)的報道。
[0003]宿主細(xì)胞中含有大量的宿主蛋白(Host cell protein，HCP)、DNA和內(nèi)毒素等，均可能給生物制品造成污染。其中宿主蛋白潛在的免疫原性有可能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，發(fā)生免疫反應(yīng)；而且其潛在的“佐劑效應(yīng)”也可能會引起機體對藥物產(chǎn)生抗體，進而影響藥物的療效。靈敏度高、重復(fù)性好的宿主蛋白檢測方法不僅是保證生物制品安全有效的關(guān)鍵，也是生產(chǎn)過程控制和工藝優(yōu)化的重要參數(shù)。
[0004]目前，酵母宿主蛋白檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管電泳(CE)、反相HPLC、離子色譜等?！吨袊幍洹啡?2010版)中宿主蛋白殘留量檢測方法采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)。ELISA檢測方法中所用的抗宿主蛋白抗體通常是將宿主細(xì)胞破碎后，經(jīng)過初步處理得到宿主蛋白，免疫動物后獲得。宿主細(xì)胞破碎方法包括:有機試劑裂解；溶菌酶等酶類的酶促反應(yīng)；超聲、高壓勻漿等物理破碎。初步處理方式包括:固液分離；超濾濃縮等。
[0005]常規(guī)的酵母HCP抗體制備方法，由于HCP分子量大小不一，成分復(fù)雜，各成分之間免疫原性差異大，而不容易得到合適的HCP抗體。這是因為，常規(guī)方法將酵母HCP全部成分免疫動物之后，獲得抗體主要結(jié)合分子量大且免疫原性強的HCP成分，對于低分子量且免疫原性弱的HCP成分無結(jié)合能力。使用這種制備方法產(chǎn)生的抗體，會導(dǎo)致在通過ELISA (酶聯(lián)免疫法)檢測生物制品中HCP殘留時靈敏度大大降低，并且由于部分低免疫原性的HCP成分無法檢測而造成實際測定值偏低。
[0006]綜合上述，目前尚無一種合適的用于漢遜酵母宿主蛋白殘留量檢測的漢遜酵母HCP抗體及使用該抗體進行檢測的方法，更沒有相關(guān)的配套試劑及試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的上述不足，為了給漢遜酵母發(fā)酵生物制品中殘留宿主蛋白檢測提供一種快速有效、簡單可靠、適用大規(guī)模推廣應(yīng)用的檢測方法，本發(fā)明通過對現(xiàn)有漢遜酵母宿主蛋白制備免疫抗體的方法進行改良，所制備得到的抗體具有免疫原性強，檢測靈敏度高的特點。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種新型制備漢遜酵母HCP抗體的方法，通過在常規(guī)免疫動物的方法中加入抗原純化步驟，使得動物在對漢遜酵母全部宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，加強對于部分較弱免疫原性宿主蛋白的免疫反應(yīng)性，從而制得低免加強型HCP抗體；
[0009]作為一種優(yōu)選方案，所述新型制備漢遜酵母HCP抗體的方法，具體步驟如下: [0010]a)取2~4種常用漢遜酵母菌種分別進行種子培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)48~90小時之后，收集菌體；
[0011]b)將上述分別誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，各取相等的重量進行混合，細(xì)胞破碎，固液分離，收集破菌上清，過濾除菌，制得混合漢遜酵母HCP全蛋白；
[0012]c)使用混合漢遜酵母HCP全蛋白加上合適的佐劑免疫動物，共三次免疫，獲得中間抗體；
[0013]d)使用中間抗體制備親和層析膠，親和純化漢遜酵母HCP全蛋白，獲得漢遜酵母HCP低免蛋白；
[0014]e)使用漢遜酵母HCP低免蛋白在步驟c)的基礎(chǔ)上繼續(xù)免疫動物，共三次，獲得漢遜酵母HCP低免加強型抗體；
[0015]其中，步驟a)中所述的2~4種常用漢遜酵母菌種均為野生型，，優(yōu)選為3種，分別為 ATCC14754、ATCC34438 和 ATCC66057 ；
[0016]步驟c)中所述的免疫動物，共三次，分別為在第0，14，28天進行；
[0017]步驟d)中所述的使用中間抗體純化漢遜酵母HCP全蛋白獲得HCP低免蛋白的的步驟為將漢遜酵母HCP全蛋白適量，加入中間抗體親和層析膠內(nèi)，收集流穿蛋白樣品，即為漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白，用于后續(xù)的第四、五、六次免疫；
[0018]步驟e)中所述的免疫動物程序，以步驟c)制得的漢遜酵母低免蛋白為抗原與佐劑共免疫動物三次，分別為在第42，49，56天進行；所述動物可為小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、馬，優(yōu)選為兔和豚鼠；
[0019]所述佐劑選自弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、脂質(zhì)體佐劑、CpG佐劑，優(yōu)選為弗氏佐劑，最佳為弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑；
[0020]本發(fā)明的另一個目的是提供一種漢遜酵母HCP低免加強型抗體，所述漢遜酵母HCP低免加強型抗體為多克隆抗體，以漢遜酵母菌株制得漢遜酵母宿主蛋白后經(jīng)動物免疫再經(jīng)抗體純化后制得；
[0021]作為一種優(yōu)選方案,所述動物免疫中還包括將抗原純化步驟,使得免疫動物在對全部宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，加強對于較弱免疫原性宿主蛋白的免疫反應(yīng)性；
[0022]作為更進一步優(yōu)選方案，所述抗原純化步驟為采用動物免疫中抗?jié)h遜酵母宿主蛋白抗體的中間抗體純化漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白，獲得漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白；[0023]本發(fā)明的另一種目的是提供漢遜酵母HCP低免加強型抗體的應(yīng)用，主要是作為活性成分用于制備檢測漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的生物制品宿主蛋白殘留量的試劑或試劑盒；作為一種優(yōu)選方案，所述檢測漢遜酵母宿主蛋白的產(chǎn)品為檢測試劑或檢測試劑盒；
[0024]本發(fā)明中所稱漢遜酵母宿主蛋白，即為漢遜酵母HCP，也是漢遜酵母宿主全蛋白，或稱漢遜酵母全蛋白，指的是將培養(yǎng)好的漢遜酵母菌體經(jīng)收集，破碎，離心分離，收集上清，過濾除菌后制得的產(chǎn)物，可直接選取一定劑量，用于免疫動物；
[0025]本發(fā)明中所稱漢遜酵母宿主低免蛋白，指的是漢遜酵母全蛋白中那部分分子量較小，免疫原性較低，混合在漢遜酵母全蛋白中用常規(guī)方法免疫動物不容易得到抗體的成分；
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中漢遜酵母宿主蛋白檢測手段的不足，提供了一種檢測靈敏度高的抗?jié)h遜酵母宿主蛋白抗體及其制備方法，在免疫動物中加入抗原純化步驟，使得動物在對全部宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，加強對于較弱免疫原性宿主蛋白的免疫反應(yīng)性。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的抗體可應(yīng)用于ELISA檢測HCP中，不僅能提高靈敏度，而且由于本發(fā)明在制備酵母宿主全蛋白時，采用了常用的幾種野生型漢遜酵母菌株按一定比例混合制成，對于大多數(shù)由漢遜酵母表達(dá)的生物制品HCP檢測都通用，適用面廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明與現(xiàn)有 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對照圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施例及對比例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)、完整地說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Smatoook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
[0029]以下實施例的實驗中所用到的動物、儀器設(shè)備、試劑及其配制等均是來自市售。
[0030]多形漢遜酵母菌株:ATCC14754，ATCC34438,ATCC66057
[0031]YPD培養(yǎng)基:自配，1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖。
[0032]BMMY培養(yǎng)基:自配，I %酵母粉、2 %蛋白胨、IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)、4X IO^5% Biotin (生物素，Sigma公司)、1.34% YNB (酵母氮源堿，BD公司)，使用前加入3%甲醇。
[0033]高壓均質(zhì)機:ATSAH-100B
[0034]高速冷凍離心機:ThermoFisher lynx4000
[0035]弗氏完全佐劑:Sigma公司
[0036]弗氏不完全佐劑:Sigma公司
[0037]Sephadex G25 層析柱:GE 公司
[0038]親和層析柱UNOSPHERE:Bio-rad 公司
[0039]本發(fā)明中所使用的其它生物試劑和化學(xué)試劑，如無特別說明，均為分析純或分析純以上級別。[0040]實施例1漢遜酵母HCP抗體的制備
[0041]1.漢遜酵母宿主全蛋白的制備
[0042]采用來源于美國模式菌種收集中心(ATCC)的多形漢遜酵母菌株，選取應(yīng)用較為廣泛的三株野生型標(biāo)準(zhǔn)菌株，編號為ATCC14754，ATCC34438，ATCC66057。將上述三株菌株分別接種至YPD培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，24小時后換成BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)基因表達(dá)，每24小時添加0.5%甲醇，表達(dá)72小時后，1000Orpm離心IOmin收集菌體。上述菌體培養(yǎng)誘導(dǎo)過程完全模擬含有外源基因的漢遜酵母工程菌株生產(chǎn)時的培養(yǎng)誘導(dǎo)條件。
[0043]將上述制得三株菌株的菌體各取50g混合，加入4°C預(yù)冷的緩沖溶液A (50mM PB，
0.2M NaCl，0.5% Tween-80，pH7.0) 600mL，于磁力攪拌器上攪拌至完全混勻。采用高壓均質(zhì)機(ATS AH-100B)高壓破碎以上菌體混懸液，調(diào)節(jié)均質(zhì)閥，控制破菌壓力為1200bar。重復(fù)以上高壓破碎過程3-4遍。高速冷凍離心機(Thermo Fisher lynx4000)離心澄清破菌液，設(shè)定條件lOOOOrpm，30min,8°C，離心分離，收集離心后的上清液。用緩沖溶液A將上清液稀釋至蛋白濃度500ug/mL，用0.22um濾膜過濾除菌，分裝后-80°C保存；制得漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白。
[0044]2.動物免疫程序
[0045]取三只兔和兩只豚鼠進行動物免疫，分別進行六次免疫，采用抗原與佐劑等體積混合，乳化采用注射器 混合法:將等量的弗氏佐劑和抗原溶液分別吸入兩個注射器內(nèi)，兩注射器之間以一細(xì)膠管相連，注意排凈空氣，然后交替推動針管，直至形成粘稠的乳劑為止，即為乳化充分。乳化充分后，免疫動物。初免采用弗氏完全佐劑，隨后的免疫都采用弗氏不完全佐劑。免疫劑量為0.5mg/兔子，0.25mg/豚鼠，采用背部皮下多點注射。
[0046]具體免疫程序為:初免(O天，弗氏完全佐劑)，抗原為漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白；二免(14天，弗氏不完全佐劑)，抗原為漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白；三免(28天，弗氏不完全佐劑)，抗原為漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白。
[0047]三免后，將一只兔子處死，采血，獲得中間抗體；用中間抗體純化漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白，獲得漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白，其中漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白具體制備方法為:在第三次免免疫后，處死一只兔子，取20mL兔血清，加生理鹽水稀釋一倍，滴加入(NH4)2SO4飽和溶液至終濃度為50%，充分混合后，靜置5-6小時，12000rpm離心20min，棄上清。沉淀用20mL的生理鹽水溶解，滴加入(NH4)2SO4飽和溶液至終濃度為33%，充分混合后，靜置5-6小時，12000rpm離心20min，棄上清；沉淀用IOmL生理鹽水溶解，離心的上清液通過S印hadex G25層析柱(GE公司)脫鹽，換液至PBS溶液中(pH7.4)。過親和層析柱UNOSPHERE (Bio-rad公司)，用0.1M pH3.0的檸檬酸緩沖液洗脫獲得兔IgG抗體；該抗體主要結(jié)合漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白中大分子量、免疫原性高的抗原蛋白。使用Aff1-Gel Hzimmunoaffinity kit (Bio-rad)試劑盒,將所得兔 IgG 抗體換液至 Coupling Buffer,使用Nal04.氧化抗體,再次換液Coupling Buffer,并偶聯(lián)至Aff1-Gel Hz Gel,制得兔IgG抗體的親和膠。使用上述兔IgG抗體親和膠，純化步驟I)制得的漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白；將漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白樣品10mL，加入兔IgG抗體親和層析柱(親和膠20mL)，收集流穿蛋白樣品，即為漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白，用于后續(xù)的第四、五、六次免疫。
[0048]剩下的兩只兔子和兩只豚鼠再進行后續(xù)三次免疫；四免(42天，弗氏不完全佐劑)，抗原為漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白；五免(49天，弗氏不完全佐劑)，抗原為漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白；六免(56天，弗氏不完全佐劑)，抗原為漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白。63天處死、采血，血清純化，具體步驟為將血清加生理鹽水稀釋一倍，滴加入(NH4)2SO4飽和溶液至終濃度為50%，充分混合后，靜置5-6小時，12000rpm離心20min，棄上清。沉淀用20mL的生理鹽水溶解，滴加入(NH4)2SO4飽和溶液至終濃度為33%，充分混合后，靜置5-6小時，12000rpm離心20min，棄上清；沉淀用IOmL生理鹽水溶解，離心的上清液通過S印hadex G25層析柱(GE公司)脫鹽，換液至PBS溶液中(pH7.4)。過親和層析柱UNOSPHERE (Bio-rad公司)，用0.1M pH3.0的檸檬酸緩沖液洗脫獲得。后分別得到兔子與豚鼠抗?jié)h遜酵母宿主蛋白多克隆抗體。
[0049]實施例2抗?jié)h遜酵母宿主蛋白抗體效價測定
[0050]采用ELISA法檢測抗體效價，具體為:采用包被液(0.05M NaHCO3, pH9.6)將漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白稀釋至10ug/mL，100ul/孔，4°C包被過夜。除去包被液，用PBS溶液洗滌兩次。每孔加入0.3mL封閉液(5%脫脂奶粉+PBS)于37°C保溫2小時；再除去包被液，PBS溶液洗滌兩次。將上述純化獲得的兔抗/豚鼠抗?jié)h遜酵母宿主蛋白抗體分別稀釋至lmg/mL,再系列10倍稀釋，稀釋緩沖液為2%脫脂奶粉+PBS。每孔加入IOOuL,于37°C保溫I小時，除去抗體溶液，PBS溶液洗滌兩次。然后向每孔加入用稀釋緩沖液以1:5000稀釋的酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔及HR標(biāo)記的羊抗豚鼠)各100ul，37°C保溫0.5小時后除去酶標(biāo)液，PBS溶液洗滌兩次。然后向每孔中加入IOOul DAB顯色液，室溫避光作用10分鐘后加2M H2SO40.05mL終止液終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)比色儀測定OD450值，并計算抗體效價，抗體效價值如表1所示。
[0051]表1動物抗體效價值
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種制備漢遜酵母宿主蛋白(HCP)抗體的方法，其特征在于通過在常規(guī)免疫動物的方法中加入抗原純化步驟，使得動物在對漢遜酵母全部宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，加強對于部分較弱免疫原性宿主蛋白的免疫反應(yīng)性，從而制得低免加強型HCP抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種制備漢遜酵母HCP抗體的方法，具體步驟如下: a)選取幾種常用漢遜酵母菌種分別進行種子培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體； b)將上述分別誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，各取相等的重量，進行混合，細(xì)胞破碎，固液分離，收集破菌上清，過濾除菌，制得漢遜酵母HCP全蛋白； c)使用漢遜酵母HCP全蛋白加上合適的佐劑免疫動物，數(shù)次免疫后，獲得中間抗體； d)使用中間抗體制備親和層析膠，親和純化漢遜酵母HCP全蛋白，獲得漢遜酵母HCP低免蛋白； e)使用漢遜酵母HCP低免蛋白在步驟c)的基礎(chǔ)上繼續(xù)免疫動物，數(shù)次后，獲得漢遜酵母HCP低免加強型抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的一種制備漢遜酵母HCP抗體的方法，其特征在于，步驟a)所述的常用漢遜酵母菌種均為野生型，優(yōu)選為3種，分別為ATCC14754、ATCC34438和ATCC66057。
4.如權(quán)利要求2所述的一種制備漢遜酵母HCP抗體的方法，其特征在于，步驟c)中所述的免疫動物程序，優(yōu)選為三次，分別為在第O，14，28天進行。
5.如權(quán)利要求2所述的一種制備漢遜酵母HCP抗體的方法，其特征在于，步驟e)中所述的免疫動物程序，以步驟c)制得的漢遜酵母低免蛋白為抗原與佐劑共免疫動物，優(yōu)選為三次，分別為在第42，49，56天進行。
6.一種漢遜酵母HCP低免加強型抗體，所述漢遜酵母HCP低免加強型抗體為多克隆抗體，以漢遜酵母菌株制得漢遜酵母宿主蛋白后經(jīng)動物免疫再經(jīng)抗體純化后制得。
7.如權(quán)利要求8所述的一種漢遜酵母HCP低免加強型抗體，其特征在于，所述動物免疫中還包括將抗原純化步驟，使得免疫動物在對全部宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)后，加強對于較弱免疫原性宿主蛋白的免疫反應(yīng)性，所述抗原純化步驟為采用動物免疫中抗?jié)h遜酵母宿主蛋白抗體的中間抗體純化漢遜酵母宿主細(xì)胞全蛋白，獲得漢遜酵母宿主細(xì)胞低免蛋白。
8.—種漢遜酵母HCP低免加強型抗體的應(yīng)用，主要是作為活性成分用于制備檢測通過漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的 生物制品宿主蛋白殘留量的試劑或試劑盒。
【文檔編號】G01N33/53GK103641913SQ201310664352
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】張高峽 申請人:上海博唯生物科技有限公司