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化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法。該化學(xué)發(fā)光增敏液，包括0.1-100mmol/L的對(duì)溴苯酚、0.05-100mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01％-20％有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-10mol/L、pH值為7-11的緩沖液。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該增敏液可以顯著的增強(qiáng)反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度、大大的延長(zhǎng)其發(fā)光持續(xù)時(shí)間，其最大發(fā)光強(qiáng)度(化學(xué)發(fā)光值)可以達(dá)到2.5×107，發(fā)光持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到25分鐘。
【專(zhuān)利說(shuō)明】 化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，特別涉及一種化學(xué)發(fā)光增敏液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化學(xué)發(fā)光是在常溫下，由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射。其發(fā)光機(jī)理是:反應(yīng)體系中的某些物質(zhì)分子，如反應(yīng)物、中間體或者熒光物質(zhì)吸收了反應(yīng)釋放的能量而由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)中間體由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)會(huì)釋放等能級(jí)的光子，對(duì)光子進(jìn)行測(cè)定而實(shí)現(xiàn)定量分析。1977年，Halman等人通過(guò)將高特異性的抗原抗體反應(yīng)與高靈敏度的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)。
[0003]化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物，因化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，從而避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響。魯米諾是化學(xué)發(fā)光免疫分析中應(yīng)用廣泛的標(biāo)記物質(zhì)，在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光，其中H2O2最為常用。在化學(xué)發(fā)光免疫分析的過(guò)程中，因發(fā)光反應(yīng)速度較慢，因此，常需添加某些酶類(lèi)或無(wú)機(jī)催化劑。酶類(lèi)主要是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，無(wú)機(jī)類(lèi)包括O3、齒素及Fe3+、Cu2+、Co2+或它們的配合物。
[0004]化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescentenzyme immunoassay, CLELA)是以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，反應(yīng)的過(guò)程中，酶作用于發(fā)光底物(如魯米諾)，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，再利用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，兩者有各自的發(fā)光底物。
[0005]相關(guān)技術(shù)中，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)最常用發(fā)光底物是魯米諾。在化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)中，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)后，利用魯米諾作為發(fā)光底物，在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH和H2O2)作用下，發(fā)光底物(魯米諾)發(fā)光。在反應(yīng)的過(guò)程中，該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系(HRP-H2O2-1uminol)通常為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光，存在發(fā)光強(qiáng)度低、持續(xù)時(shí)間短的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種化學(xué)發(fā)光增敏液，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系(HRP-H2O2-1uminol)由于存在的發(fā)光強(qiáng)度低、持續(xù)時(shí)間短的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法。
[0007]本發(fā)明實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，包括:0.l-100mmol/L的對(duì)溴苯酚、
0.05-100mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.0l-lOmol/L、pH值為7_11的緩沖液。
[0008]本發(fā)明提供的這種化學(xué)增敏液，其由對(duì)溴苯酚、過(guò)氧化氫，魯米諾或魯米諾衍生物、堿、有機(jī)溶劑及緩沖液組成。在化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)中，將該增敏液加入到含有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光體系中后，該增敏液以對(duì)溴苯酚為增強(qiáng)劑，其優(yōu)先與辣根過(guò)氧化物酶作用形成自由基，并且作為電子轉(zhuǎn)移中間體提高了魯米諾或魯米諾衍生物自由基的產(chǎn)率，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)增敏化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效果，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該增敏液可以顯著的增強(qiáng)反應(yīng)體系的發(fā)光強(qiáng)度、大大的延長(zhǎng)其發(fā)光持續(xù)時(shí)間,其最大發(fā)光強(qiáng)度(化學(xué)發(fā)光值)可以達(dá)到2.5X107，發(fā)光持續(xù)時(shí)間可以達(dá)到25分鐘。因此，可廣泛用于以化學(xué)發(fā)光為檢測(cè)手段的化學(xué)、生物、免疫等檢測(cè)分析產(chǎn)品中，在檢測(cè)的過(guò)程中，由于發(fā)光增強(qiáng)效果顯著，其發(fā)光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，從而便于重復(fù)測(cè)量，進(jìn)而可提高檢測(cè)分析的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0009]可選的，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括:0.l_50mmol/L的對(duì)溴苯酌.、0.05_50mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01_5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為
0.01% -10%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-5mol/L的緩沖液。
[0010]可選的，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼。
[0011]可選的，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
[0012]可選的，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或；所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
[0013]本發(fā)明提供的這種化學(xué)增敏液的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)、在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物的母液；
[0015](2)、將對(duì)溴苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的對(duì)溴苯酚母液；
[0016](3)、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對(duì)溴苯酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過(guò)氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0017]可選的，在步驟⑴中，具體包括:稱(chēng)取Illmg魯米諾，加入到0.1mol/LNaOH水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液。
[0018]可選的，在步驟(2)中，具體包括:稱(chēng)取86.5mg對(duì)溴苯酚，加入到2% DMF水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為5mmol/L的對(duì)溴苯酹母液。
[0019]可選的，在所述步驟(3)中，所述魯米諾母液和所述對(duì)溴苯酚母液的體積比為1:1。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)【具體實(shí)施方式】或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。
[0021]圖1為本實(shí)施例五提供的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法；
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的化學(xué)發(fā)光增敏液加入到含有辣根過(guò)氧化物酶的免疫反應(yīng)體系中后，體系的發(fā)光值和發(fā)光時(shí)間關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，基于本發(fā)明中的【具體實(shí)施方式】，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所得到的所有其它實(shí)施方式，都屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。
[0024]本發(fā)明提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其中包括0.l-100mmol/L的對(duì)溴苯酚、
0.05-100mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-100mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-10mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.0l-lOmol/L、pH值為7_11的緩沖液。另外，為了實(shí)現(xiàn)更好的增強(qiáng)效果，優(yōu)選的，在增敏液中，各組份的含量范圍可適當(dāng)鎖銷(xiāo)，如:其可包括0.l-50mmol/L的對(duì)溴苯酌.、0.05-50mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -10%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為
0.01-5mol/L的緩沖液；另外，優(yōu)選的，對(duì)于各組份，所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼；所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣；所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。具體在制備的過(guò)程中，本發(fā)明的增敏液可以同時(shí)具備上述條件，或者只滿(mǎn)足上述限定條件中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
[0025]接下來(lái)，通過(guò)結(jié)合上述的內(nèi)容，本發(fā)明對(duì)基于以對(duì)溴苯酚作為增強(qiáng)劑的化學(xué)發(fā)光增敏液提供了以下具體的實(shí)施例，請(qǐng)參考以下內(nèi)容:
[0026]實(shí)施例一
[0027]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括:0.lmmol/L的對(duì)溴苯酚、
0.05mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05mmol/L魯米諾、0.01mol/L的氫氧化鈉、體積百分?jǐn)?shù)為0.01 %二甲基甲酰胺、離子強(qiáng)度為0.01mol/L、pH值為7_11的磷酸鹽緩沖液。
[0028]實(shí)施例二
[0029]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液,其包括:10mmol/L的對(duì)溴苯酹、10mmol/L的過(guò)氧化氫、8mmol/L的7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼、5mol/L的氫氧化鉀、體積百分?jǐn)?shù)為10%二甲基甲酰胺、離子強(qiáng)度為5mol/L、pH值為7_11的Tris-HCl緩沖液。
[0030]實(shí)施例三
[0031]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括:50mmol/L的對(duì)溴苯酚、50mmol/L的過(guò)氧化氫、50mmol/L的異魯米諾或魯米諾鈉鹽、5mol/L的氫氧化鈣、體積百分?jǐn)?shù)為10%丙酮、甲醇或乙腈、離子強(qiáng)度為5mol/L、pH值為7_11的Tris-HCl緩沖液。
[0032]實(shí)施例四
[0033]本實(shí)施例提供的這種化學(xué)發(fā)光增敏液，其包括:100mmol/L的對(duì)溴苯酚、IOOmmol/L的過(guò)氧化氫、100mmol/L的魯米諾、10mol/L的氫氧化鈉、體積百分?jǐn)?shù)為20%丙酮、甲醇或乙腈、離子強(qiáng)度為10mol/L、pH值為7_11的Tris-HCl緩沖液。
[0034]為了使得本發(fā)明上述實(shí)施例的化學(xué)發(fā)光增敏液得到更好的應(yīng)用，更加有效應(yīng)用到化學(xué)發(fā)光免疫分析的領(lǐng)域中，本發(fā)明還在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)之上提供了實(shí)施例五，實(shí)施例五給出了上述實(shí)施例的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法，現(xiàn)做詳細(xì)的闡述和解釋。
[0035]實(shí)施例五
[0036]本發(fā)明實(shí)施例提供的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法具體包括以下步驟，請(qǐng)參考圖1:
[0037]步驟101:在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物的母液；[0038]具體的，在該步驟中，稱(chēng)取Illmg魯米諾，加入到0.1mol/LNaOH水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液，備用。
[0039]步驟102:將對(duì)溴苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的對(duì)溴苯酚母液；
[0040]具體的，稱(chēng)取86.5mg對(duì)溴苯酚，加入到20% DMF水溶液中，并定容至IOOmL，獲得濃度為5mmol/L的對(duì)溴苯酹母液,備用。
[0041]步驟103:按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對(duì)溴苯酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過(guò)氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0042]在該步驟中，所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對(duì)溴苯酚母液的體積比為1:1。在操作的過(guò)程中，分別吸取2mL魯米諾母液和2mL對(duì)溴苯酚母液，用16mL0.1M，pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液稀釋?zhuān)⒓尤?0 μ L30%的過(guò)氧化氫溶液，混勻即得。
[0043]其中，緩沖液的配置方法包括:用IM鹽酸溶液調(diào)整pH值至9.0，后用去離子水定容至1000mL,獲得濃度為0.05mol/L、pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液，在具體使用的時(shí)候根據(jù)特定的需求調(diào)至既定的PH和離子濃度。
[0044]另外，具體的，在本實(shí)施例中，整個(gè)配置過(guò)程可以按照以下操作進(jìn)行:稱(chēng)取Illmg魯米諾，用0.1mol/LNaOH水溶液定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液；稱(chēng)取86.5mg對(duì)溴苯酹,用20% DMF水溶液定容至IOOmL,獲得濃度為5mmol/L的對(duì)溴苯酹母液；稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷6.05g，先用900mL去離子水溶解后，用IM鹽酸溶液調(diào)整pH值至9.0，后用去離子水定容至1000mL,獲得濃度為0.05mol/L、pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液；分別吸取2mL魯米 諾母液和2mL對(duì)溴苯酚母液，用16mL0.05M, pH值為9.0的Tris-HCl緩沖液稀釋?zhuān)⒓尤?0μ L30%的過(guò)氧化氫溶液，混勻后得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
[0045]請(qǐng)參考圖2，通過(guò)上述方法制成的化學(xué)發(fā)光增敏液，其將其加入含有辣根過(guò)氧化物酶的免疫反應(yīng)體系中，可出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光值與發(fā)光時(shí)間。檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從圖2可知，基于增強(qiáng)劑對(duì)溴苯酚的化學(xué)發(fā)光增敏液有效增強(qiáng)了魯米諾-辣根過(guò)氧化物酶-過(guò)氧化氫化學(xué)發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度(最大發(fā)光強(qiáng)度可以達(dá)到
2.5X IO7)，延長(zhǎng)了其發(fā)光持續(xù)時(shí)間(可以達(dá)到25分鐘)；其具有明顯的發(fā)光增強(qiáng)效果和提高發(fā)光時(shí)間以及其發(fā)光穩(wěn)定性的效果。另外，本發(fā)明還考察了在不同濃度的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的條件下，測(cè)定其在20分鐘內(nèi)的發(fā)光動(dòng)力。具體結(jié)果請(qǐng)參考表1:
[0046]表1辣根過(guò)氧化物酶濃度和對(duì)溴苯酚增敏液對(duì)發(fā)光的影響
[0047]
【權(quán)利要求】
1.化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括:
0.1 ~1 OOmmol /I,的對(duì)漠苯酌.、0.05~1 OOmmol /I,的過(guò)氧化氧、0.05~1 OOmmol /I,魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-lOmol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01% -20%有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-10mol/L、pH 值為 7-11 的緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光增敏液包括:0.l-50mmol/L的對(duì)溴苯酌.、0.05-50mmol/L的過(guò)氧化氫、0.05-50mmol/L魯米諾或魯米諾衍生物、0.01-5mol/L的堿、體積百分?jǐn)?shù)為0.01 % -10 %有機(jī)溶劑、離子強(qiáng)度為0.01-5mol/L的緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于:所述魯米諾衍生物為魯米諾鈉鹽、異魯米諾或7-氨基-6-巰基鄰苯二甲酰肼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鈣。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈； 和/或； 所述緩沖液為磷酸鹽 緩沖液或Tris-HCl緩沖液。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光增敏液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、在堿溶液中加入魯米諾或魯米諾衍生物，得到既定濃度的魯米諾或魯米諾衍生物的母液； (2)、將對(duì)溴苯酚加入到有機(jī)溶劑中，得到既定濃度的對(duì)溴苯酚母液； (3)、按照既定體積比將所述魯米諾或魯米諾衍生物的母液與所述對(duì)溴苯酚母液混合后，在其中依次加入緩沖液和過(guò)氧化氫溶液，混勻，得到化學(xué)發(fā)光增敏液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，具體包括: 稱(chēng)取Illmg魯米諾，加入到0.1mol/LNaOH水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為6.25mmol/L的魯米諾母液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，具體包括: 稱(chēng)取86.5mg對(duì)溴苯酚，加入到20% DMF水溶液中，并定容至IOOmL,獲得濃度為5mmol/L的對(duì)溴苯酹母液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述魯米諾母液和所述對(duì)溴苯酚母液的體積比為1:1。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK104020162SQ201410302196
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】金茂俊, 王靜, 楊麗華, 杜鵬飛, 金芬, 邵華, 佘永新, 王珊珊 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所